Preparacin De Medio De Cultivo, Tcnicas De Siembra De

Microrganismos y Tcnicas de Tincin

Preparation of Culture Medium, Sowing Techniques
Microorganisms and staining techniques

Francisco Javier Carvajal Andrade1, Jos Ricardo Mora Escobar2

Resumen
En este artculo, se dar a conocer los procedimientos y tcnicas empleados en la preparacin, siembra y posterior
tincin los cuales se desarrollaron en 3 diferentes prcticas para la identificacin de los microrganismos presentes en
una muestra de cultivo. El estudio se llevo a cabo en el laboratorio de Conservacin de productos Agropecuarios
(practica 1 y 2) y de Biologa (practica 3) ubicados en la Universidad Surcolombiana.
En la prctica n 1 se utilizo los procedimientos en la preparacin para dos medios de cultivo, uno en medio solido
con agar y el otro en medio liquido con agua peptona. 8 das despus en la practica n 2 se empleo las tcnicas de
siembra por superficie, triple estra, en profundidad y doble capa. Los microorganismos a observar se obtuvieron de
los baos de hombres y mujeres ubicados en la facultad de ingeniera de la misma universidad. Pasados otros 8 das
en la practica n 3 se fijo y mediante la tcnica de tincin Gram se agreg colorantes para la identificacin de
bacterias Gram positivos y/o Gram negativos. Se pudo identificar la formacin de colonias aisladas en la siembra de
triple estra y en la tincin de Gram se observaron microorganismos con forma de coco y bacilos, adems Gram
positivos y Gram negativos.
Palabras Claves: tincin de Gram; tcnicas de siembra; Gram positivos; Gram negativos; microrganismos; muestras de
cultivo

Summary
In this article, we will present the methods and techniques used in the preparation, planting and subsequent staining
which developed in 3 different practices for the identification of microorganisms present in a sample of culture. The
study was conducted in the laboratory of Conservation Agricultural products (practice 1 and 2) and Biology
(practice 3) located at the University Surcolombiana.
In practice no.1 preparation procedures for two culture media, one in solid agar medium and the other in liquid
medium with peptone water was used. 8 days after the practice is job No. 2 seeding techniques for surface triple
groove, ball and double layer. Microorganisms were obtained to observe the bathrooms for men and women located
in the Faculty of Engineering at the same university. After a further 8 days in practice fixed No 3 and by gram
staining technique for identifying dyes Gram positive bacteria and / or Gram negative added . Could identify isolated
Estudiante de Ingeniera Agrcola. Universidad Surcolombiana- Neiva. Av. Pastrana Carrera 1. Carvacho23@hotmail.com
Estudiante de Ingeniera Agrcola. Universidad Surcolombiana- Neiva. Av. Pastrana Carrera 1. jose911925@hotmail.com

1
2

colony formation in triple planting groove and Gram stain coconut shaped organisms and Gram-negative bacilli was
observed Gram positive addition.
Keywords: Gram stain, planting techniques, Gram positive, Gram negative, microorganisms, culture samples
1. Introduccin
Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolucin de estos organismos.
Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelacin y el punto de
ebullicin del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado
ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes. Los microorganismos se hallan
capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes.
Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las caractersticas
del ambiente determinan cules especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: mohos,
levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus. (http://www.unsa.edu.ar/matbib/micragri/micagricap1.pdf).
Los laboratorios de microbiologa constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden presentar riesgos de
enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo diario en el laboratorio
es un trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante las prcticas, as como el
entrenamiento que posean en las tcnicas requeridas para el manejo de material contaminado, determinan su propia
seguridad, as como la de sus compaeros y la de la colectividad en general.
Es por ello que antes de comenzar con las actividades prcticas, todas las personas involucradas (estudiantes y
profesores) tienen la obligacin de conocer cules son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera
tal, que el trabajo se realice con un riesgo mnimo de exposicin, tanto para las personas que lo ejecutan como para
el medio ambiente. (Normas de seguridad en el laboratorio de microbiologa.pdf).
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La
composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varan
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales
y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para
crecer. (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo).
Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa, definida por el tamao, la forma, el
arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas
bacilos y una tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada
categora puede sub clasificarse con base a diferentes arreglos.
Estas caractersticas pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las clulas no teidas son
prcticamente transparentes, pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lmina y
laminilla o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro.
(http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.
pdf)
2. Metodologa.
2.1 Preparacin de medio de cultivo (Ver Figura 7)
2.1.1

Preparacin medio de cultivo con agar: Se tuvo en cuenta la relacin de preparacin entre agua y
agar especificados en la etiqueta del producto (ver figura 1), por ende se pes 2,3 gr de agar (ver figura 2

para 100 ml de agua destilada, se verti en un Erlenmeyer (ver figura 3), se homogenizo y
posteriormente se tapo con papel aluminio. Finalmente se coloc cinta autoclave se llev al autoclave a
121 C hasta el cambio de color en la cinta y se dej atemperar (figura 7).

Figura 1. Especificaciones etiqueta.

Laboratorios Merck KGaA
2.1.2

Figura 2. Peso del agar utilizado

Pesa Scout Pro (DHAUS)

Figura 3. Vertimiento en
Erlenmeyer

Preparacin del cultivo liquido: Se tuvo en cuenta la relacin de agua peptona especificados en la
etiqueta del producto (ver figura 4), por ende se pes 1,3 gr de peptona para 50 ml de agua destilada, se
verti en un vaso de precipitados (ver figura 5), y se homogenizo con ayuda del agitador magntico.
luego por medio de un dosificador estril se adicion 9 ml a cada tubo de ensayo y se tap con papel
aluminio. Finalmente se llev a la autoclave a 121 C durante un tiempo aproximado de 20 min
(Figura 7).

Figura 4. Especificaciones etiqueta

Laboratorios Merck KGaA

Figura 5. Vertido y homogenizado

Heidolph MR Hei-Mix S

Figura 6. Adicin 9 ml a tubos de

ensayo

Figura 7. Autoclave a 121 C de los dos

Medios de cultivo.
All American Model No 25X

PREPARACION
DE MEDIO
MEDIO
Preparacin
medio de cultivo
con agar

Preparacin
cultivo lquido

Se pes gr para
100 ml de agua
destilada

Se pes 1,3 gr
para 50 ml de
agua destilada

Se envaso en vaso de
precipitado, se homogenizo y
luego con un dosificador se
adiciono 9 ml a cada tubo de
ensayo y se tapo con papel
aluminio

Se envaso en un
Erlenmeyer, se
homogenizo y
tapo con papel
aluminio.

Se llevo hasta a la
autoclave a 121
C durante un
tiempo aprox. De
20 min.
Figura 8. Mapa Procedimiento de preparacin medio del cultivo

2.2 Tcnicas de siembra de microorganismos:

Se realiz soluciones seriadas hasta el orden de 10-4 unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/gr)
a partir de una disolucin madre para realizar cada una de las tcnicas de siembra de microorganismos (Ver
figura 9.)

Figura 9. Diluciones seriadas de la muestra para cada tipo de siembra.

2.2.1

Siembra profundidad (S.P.): Se verti cierta cantidad de PC (medio de cultivo solido, agar) a una
placa. Seguidamente se adiciono 1 ml del tubo -2 y se homogenizo la suspensin con movimientos
horarios y anti horario. Finalmente se incubo y se observo a un tiempo ptimo el crecimiento
microbiano. (figura 10)

2.2.2

Siembra doble capa (S.D.C.): Se verti cierta cantidad de PC (medio de cultivo solido, agar) a una
placa. Se adicion 1 ml de la muestra del tubo -4, y luego se homogeniz la suspensin con
movimientos horarios y anti horario. Se dej solidificar. Posteriormente se adicion otra cantidad de PC
y se incubo. Se observo a un tiempo ptimo el crecimiento microbiano. (figura 10)

2.2.3

Siembra por masa (S.M.): Se adicion 1 ml de muestra del tubo -3 a una caja de Petri. Se extendi
homogneamente con un asa de platino. finalmente se incub y se observ en un tiempo ptimo el
crecimiento microbiano. (figura 10)

2.2.4

Siembra triple estra: Se tom el asa que se utilizo en la siembra por masa sin esterilizar con
contenido microbiano y se sembr en la mitad de una placa con medio de cultivo, posteriormente
se flameo el asa al rojo vivo y luego de enfriarse se realiz una segunda estra a partir de la anterior. Se
flameo nuevamente y se hizo una ltima estra. Finalmente se incub durante un tiempo ptimo y se
observ el crecimiento microbiano. (figura 10)

Figura 10. Incubacin

2.3 Tincin de Gram (Ver Figura 11): Se tom un portaobjetos delimitando la zona de estudio para cada
muestra (hombre y mujeres), se agreg a cada zona una gota de agua destilada para extender y fijar; luego
se ti durante un minuto con violeta de genciana y sin lavar se remplaz el colorante por el reactivo del
lugol, lo cual arrastr el primer colorante y se dej actuar durante 1 minuto. fue necesario lavar con agua y
alcohol durante treinta segundos para teir con fuchsina bsica durante 3 minutos; finalmente se lav,
sec y se observ al microscopio. (Ver Figura 12, 13, 14 y 15)

Figura 11. Mapa del proceso tincin Gram

Figura 12. Flameado de la muestra

figura 13. Resultado final

Figura 14. Extensin de la muestra

Figura 15. Observacin en microscopio

3. Resultados y Discusin:
Para lograr un buen anlisis en la observacin de microorganismos es importante seguir un protocolo de
seguridad en el laboratorio y en el manejo del material, de esta forma se evitar alteraciones en las muestras
por contaminacin, adems se debe tener en cuenta que en el laboratorio de microbiologa de la Universidad
Surcolombiana se pueden encontrar condiciones de trabajos riesgosas como: No se monitorea el flujo de aire
en el laboratorio, no se usan campanas para gases y vapores nocivos, todas las reas estn expuestas a las
muestras , no se descontaminan las reas de trabajo diariamente, no hay equipo de proteccin especial, no
hay contenedores especiales para materiales contaminados, se usan sustancias cancergenas, las mayoras de
las soluciones se preparan en el laboratorio, no hay superficies anti resbalantes y los puestos de trabajo no
estn diseados ergonmicamente.(Buesa, 2008)

3.1 Preparacin de medio

A la hora de realizar los medios
La falta de implementos y equipos necesarios para la realizacin de una buena prctica en el laboratorio, el
estar expuestos al ambiente, adems de la falta de experiencia de los estudiantes al emplear las tcnicas y
mtodos requeridos para este trabajo, gener errores como por ejemplo; no se logr la adecuada
solidificacin de los medios slidos.
Tincin de Gram (ver figuras 15,16)
Se observ antes de empezar el laboratorio, que para nuestro caso las colonias no estaban del todo aisladas
debido a la falta de experiencia al realizar los procedimientos en las anteriores prcticas.
Despus de la tincin, se observ por medio del microscopio la presencia de microorganismos en su
tamao, morfologa y la organizacin de las clulas. Adems se observ presencia de bacterias Gram
positivas (de color violeta ver figura 16) y Gram negativas como Enterobacterias (de color rosa ver figura
15). De igual manera se presenci bacilos y cocos.
Este efecto es ocasionado por la diferencia de la formacin taxonmica de cada tipo de microorganismos,
debido a que las Gram Negativas presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza una fina pared
celular de peptidoglicanopermite la extraccin del cristal violeta lugol por medio del alcohol adems su

pared externa contienen porinasque son protenas las cuales tienen como funcin regular la entrada y salida
de diferentes sustancias(Cisneros Martnez, 2011), al contrario las Gran Positivas por poseer paredes
gruesas formadas por peptiglicano al entrar en contacto con el alcohol se deshidratan evitando la salida del
cristal.
Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran nmero de especies. Algunos de ellos causan
principalmente
enfermedades
respiratorias
(Haemophilusinfluenzae,
Klebsiellapneumoniae,
Legionellapneumophila,
Pseudomonasaeruginosa),
enfermedades
urinarias
(Escherichiacoli,
Proteusmirabilis, Enterobactercloacae, Serratiamarcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter
pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros estn asociadas a infecciones nosocomiales
(Acinetobacterbaumanii). (Bernabe Alfaro, y otros, 2010)

Figura 15. Resultado de la tincin. Muestra

mg. Gram negativas como Enterobacterias

.
Figura 16. Resultado de la tincin. Muestra mh.
Triple estra. Gram positivas

3.2 Tcnicas de siembra

Es importante tener claro que cuando se trabaja en microbiologa, cualquier microbio usado o estudiado en
el laboratorio no debe ser contaminado con otros del ambiente o por el mismo microbilogo.
Las tcnicas empleadas en la siembra de microorganismos son siembra por superficie, triple estra y en
profundidad. Cuando se siembra en placa por extensin y en estras, se extiende una mezcla de clulas
sobre una superficie de agar, cada clula aislada se multiplicar formando una colonia independiente, cada
colonia representa un cultivo puro. Dicha colonia se toma y posteriormente se siembra por superficie
haciendo la extensin uniforme de la colonia por el medio de cultivo se toma una muestra lquida, la cual
se adiciona a la placa que contiene el medio de cultivo y luego se extiende con ayuda de un asa. Las clulas
diseminadas sobre la superficie desarrollaran colonias aisladas, el nmero de colonias que se desarrollen
corresponden al nmero de organismos viables de la muestra, siempre y cuando se proporcionen las
condiciones ptimas para su desarrollo (Prescott, et al., 2002). La siembra por extensin es muy empleada
para determinar en una muestra la concentracin bacteriana

La siembra en estras facilita la obtencin de colonias aisladas. La cual consiste, en extender la mezcla
microbiana en un extremo de la placa en masa, luego se flamea el asa y se extiende un estra que sale a
partir de la extensin inicial, posteriormente se vuelve a flamear el asa y se hace otra estra que sale de la
anterior. Las colonias que crecen en la superficie de una placa se pueden inocular en un medio fresco y
preparar cultivos puros (Prescott, et al., 2002).
Se observ que los resultados son diferentes en cada tcnica empleada, ya que algunas facilitan el
crecimiento de colonias aisladas ms que otras. Sin embargo no se logr formar colonias aisladas en todas
las siembras tal vez por la falta de experiencia a la hora de realizar las siembras. Solo se obtuvo colonias
aisladas en la siembra triple estra.
Una de las ventajas de la siembra en profundidad es que es un mtodo utilizado para el recuento de
microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

4. Conclusiones

La falta de implementos y equipos, adems de la falta de experiencia a la hora de realizar las prcticas
interfiri en los resultados.

Al realizar el medio solido estos no se solidificaron del todo probablemente al incorrecto seguimiento
del protocolo para esa prctica.

Por medio de la tcnica de Tincin de Gram se logr observar microorganismos Gran positivos y Gran
negativos

Se aprendi que las porinas son protenas de membrana externa presentes en bacterias Gram negativas
que tienen como funcin regular la entrada y salida de diferentes sustancias. Y que el alcohol permite
el escape del complejo cristal violeta lugol lo cual induce al descoloramiento de los
microorganismos.

Despus de la tincin, se observ por medio del microscopio la presencia de microorganismos en su

tamao, morfologa y la organizacin de las clulas.

Se conoci y empleo La forma de esterilizar los medios de cultivo en la autoclave.

Se aprendi a utilizar los diferentes equipos y materiales presentes en el laboratorio, los mtodos que se
llevan a cabo a la hora de Preparacin De Medio De Cultivo, Tcnicas De Siembra De Microrganismos
y Tcnicas de Tincin.

Es importante Mantener la limpieza del ambiente (uso de mechero) donde se realiz la tcnica de
siembra y tambin de nuestras manos para reducir la probabilidad de ingreso de microorganismos del
ambiente.

La siembra triple estra fue la que mejor presento resultados y se obtuvo colonias aisladas.

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