DESCRIPCIN DE LAS CARACTERSTICAS DE

TRES TCNICAS INMUNOLGICAS PARA

MEDIR PROGESTERONA EN SANGRE Y SU
APLICACIN EN MEDICINA VETERINARIA Y
ZOOTECNIA

MONOGRAFA

PRESENTADA POR
MAURICIO JOS CANTO LPEZ

EN OPCIN AL TTULO DE

QUMICO FARMACUTICO BILOGO

MRIDA, YUCATN, MXICO

2013

UADY

FACULTAD DE
QUMICA

Mrida, Y u c , Mayo 22 de 2013

Oficio Nm. SAC/841/13
Asunto: Aprobacin del
Trabajo Final de Monografa

COMIT REVISOR
La Monografa titulada "DESCRIPCIN DE L A S CARACTERSTICAS DE T R E S
TCNICAS INMUNOLGICAS PARA MEDIR PROGESTERONA EN SANGRE Y SU
APLICACIN EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA" presentada por el

C.

Mauricio Jos Canto Lpez, en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al ttulo
de Qumico Farmacutico Bilogo, ha sido aprobada en su contenido cientfico y en
cuanto al cumplimiento de lo establecido en el Manual de Procedimientos de Licenciatura.

M. en C. CanqnenUosefa Quintero Carrillo

Secretaria Acadmica

Calle 41 No. 421 x 26 y 28 Col. Industrial C P . 97150 Mrida, Yucatn

Tels. (999) 922-57-11 y 922-57-16
Fax. (999) 922-57-08

Artculo 100 del reglamento interior

de la Facultad de Qumica de la
Universidad Autnoma de Yucatn.

Aunque un trabajo en Opcin a

Titulacin hubiere servido para el
Examen Profesional y hubiere sido
aprobado por el Snodo, slo su
autor

es

responsable

doctrinas en l emitidas.

de

las

AGRADECIMIENTOS ACADMICOS

Al Dr. Rubn Montes Prez.

A la QFB. Luca Lpez Castillo.

A la QFB. Alheli de Jess Avils Denis.

Al QFB. Jos M. Marrufo Gmez.

Al QBA. Jos Fernando Domnguez Santana ().

A la M. en C. Martha L. Mena Reynoso.

A la M. en C. Maria Fidelia Crdenas Marrufo.

Al Dr. Vctor E. Arana Argez.

NDICE
Resumen
Introduccin

Objetivos

General

Especficos

I.

Progestinas

II.

Progesterona

III.

II.1. Caractersticas estructurales

II.2. Biosntesis

II.3. Transporte y receptores

11

II.4. Actividad fisiolgica en tejidos blanco

14

Medicin de progesterona en sangre

17

III.1. Importancia de la medicin de la progesterona en la

reproduccin del ganado bovino
IV.

V.

18

Inmunoanlisis

20

IV.1. Principios bsicos

20

IV.2. Componentes primarios

30

IV.2.1. Antgeno

30

IV.2.2. Anticuerpo

31

IV.2.3. Trazador

32

IV.3. Caractersticas analticas

32

Radioinmunoanlisis

36

VI.

VII.

V.1. Caractersticas analticas

37

V.2. Ventajas y desventajas

40

Enzimoinmunoanlisis

41

VI.1. Caractersticas analticas

44

VI.2. Ventajas y desventajas

46

Quimioluminiscencia

47

VII.1. Caractersticas analticas

52

VII.2. Ventajas y desventajas

56

VIII.

Anlisis y discusin

57

IX.

Conclusin

64

Referencias bibliogrficas

65

Resumen

La determinacin de los niveles plasmticos de la progesterona

proporciona datos tiles para la monitorizacin de una adecuada fase ltea, los
procedimientos de sincronizacin e induccin del estro y para el estudio de la
fertilidad entre otros aspectos. Esta hormona ejerce su accin sobre el tero, el
eje hipotalmico-hipofisario, glndulas mamarias y el ovario.
La

estructura

bsica

de

la

progesterona

es

el

ciclopentanoperhidrofenantreno. Es sintetizada en los ovarios y la placenta, y

vertida a la circulacin en mayor cantidad durante el diestro del ciclo estral y
tambien durante la gestacin. Por encontrarse en muy bajas concentraciones
en fluidos biolgicos como plasma o suero sanguneo o leche, en el orden de
ng/ml o pg/mL, se hace imprescindible el uso de mtodos inmunoanalticos
competitivos para detectar su presencia, entre los cuales destacan el
radioinmunoanlisis, el enzimoinmunoanlisis y la quimioluminiscencia. stos
constan de tres componentes primarios, el anticuerpo, el antgeno a determinar
y el trazador. En este tipo de anlisis el antgeno que se desea medir y el
trazador compiten por los sitios de unin del anticuerpo siguiendo la ley de
accin de masas. El grado de confiabilidad del mtodo depender de la
especificidad, sensibilidad, precisin y exactitud que ste proporcione; y
depender del analista escoger el mtodo que le resulte ms conveniente,
tomando en cuenta las ventajas y desventajas de cada sistema. Algunos de los
sistemas ms empleados en medicina veterinaria son el RIA en fase slida,
IMMULITE 1000, ADVIA Centaur y ELECSYS 2010; stos presentan
caractersticas analticas similares pero con diferencias en sus costos de
adquisicin.
Aunque para algunos laboratorios resulte costosa la implementacin de
estos sistemas en su centro de trabajo, se encuentra la posibilidad de reajustar
los gastos a travs de la implementacin de procedimientos antes o durante la

ejecucin de los inmunoanlisis, los cuales han sido probados dando

excelentes resultados e incluso comparables a los observados en sistemas
provistos por casas comerciales. Con estas medidas, se puede procurar que
mayor cantidad de laboratorios de investigacin y productores tengan acceso a
tecnologas que mejoren la calidad del trabajo en el laboratorio.

INTRODUCCIN

La evaluacin de la funcin endocrina ha presentado un avance

extraordinario. Diferentes instituciones como escuelas de medicina, medicina
veterinaria, laboratorios de diagnstico, clnicas, etc., han procurado el estudio y
medicin de hormonas en suero y plasma con diferentes propsitos:
diagnosticar problemas de piel, enfermedades endocrinas y metablicas como
hipotiroidismo, hiperadrenocorticismo, desbalances gonadales, infertilidad,
evaluar la seguridad de nuevos productos mdicos, e investigar funciones
endocrinas en estudios fisiolgicos.1
En ganadera, la medicin de las hormonas sexuales en plasma
sanguneo como la progesterona, la cual es producida por el cuerpo lteo y la
placenta2, es una herramienta til en el campo de la endocrinologa, ya que
tiene una aplicacin directa como mtodo para mejorar la eficiencia
reproductiva en la produccin animal. Por ejemplo, para determinar el
diagnostico de preez , confirmar el celo y determinar la funcionalidad
reproductiva en diferentes especies;1,3,4 en el rea de la inseminacin artificial,
la determinacin de los niveles plasmticos de progesterona tiene un gran valor
para documentar la existencia de ovulacin y una adecuada fase ltea en el
estudio de infertilidad,5 as como el diagnstico de quistes ovricos en el
ganado bovino.1 Los mtodos utilizados para estas determinaciones se hacen a
travs de inmunoensayos competitivos como el radioinmunoanlisis6,7,
enzimoinmunoanlisis2,8 y quimioluminiscencia9,10, los cuales son sumamente
sensibles y tiles debido a que la hormona se encuentra en concentraciones de
nanogramos por mililitro (ng/mL).11,12
El presente trabajo aborda las caractersticas de tres tcnicas
inmunolgicas para estimar los niveles de progesterona en sangre y su
aplicacin en el rea de medicina veterinaria y zootecnia. Las discusiones

aportadas en ste son el producto del anlisis de diversos estudios que se han
documentado acerca de los diferentes inmunoanlisis para la medicin de
progesterona, dentro de los cuales se aprecian un anlisis de costeo, con el fin
de reducir costos de operacin de las tcnicas produciendo uno de los
componentes, y con el mismo objetivo, se menciona la implementacin de un
mtodo alternativo de separacin, logrando una calidad comparable con la de
kits comerciales.4,13,14

Aunado a esto se destacan las caractersticas

tecnolgicas de cada una de stas, mencionadas en prrafos anteriores as

como los precios de adquisicin de los kits comerciales en el mercado. En
contraste se describen las desventajas que pudieran tener las tcnicas y que
limitan hasta cierto punto poderlas desarrollar.

OBJETIVOS

Objetivo general

Hacer una revisin actualizada acerca de los fundamentos y caractersticas

tecnolgicas en que opera las tcnicas inmunolgicas de radioinmunoanlisis,
enzimoinmunoanlisis y quimioluminiscencia.

Objetivos especficos

1) Describir los fundamentos y caractersticas tecnolgicas en que operan las

tcnicas de radioinmunoanlisis, enzimoinmunoanlisis y quimioluminiscencia
para cuantificar progesterona en sangre de ganado bovino.

2) Comparar las ventajas y desventajas de las tcnicas de radioinmunoanlisis,

enzimoinmunoanlisis y quimioluminiscencia para cuantificar progesterona en
sangre de ganado bovino.

3) Analizar alternativas para economizar el uso de algunos inmunoanlisis.

I.

Progestinas

Los esteroides que poseen la estructura bsica del ciclo pentano

perhidrofenantreno con 4 o 5

y 21 carbonos en su composicin, se les

denomina progestinas, cuya principal accin biolgica es promover la gestacin,

por esta razn se les denomina de accin progestgena15,

16

, la Figura 1,

muestra la estructura general de las progestinas. Una de las principales

progestinas en suero o plasma sanguneo es la progesterona.

Figura 1. Estructura general de las progestinas que posee el ncleo del

ciclopentanoperhidrofenantreno y est compuesta de 21 carbonos.(A partir de datos en Nath, 2010;
Litwack, 2004)

II.

Progesterona

Se ha considerado que la progesterona es un progestgeno importante

en mamferos. En la mujer se secreta en cantidades significativas en la segunda
mitad de cada ciclo ovrico, de igual manera, en la vaca sta tiene sus niveles
ms altos durante el diestro del ciclo estrual, cuando es producida por el cuerpo
lteo.1,

2, 12, 17

La progesterona se sintetiza en los ovarios, principalmente, a

partir del colesterol sanguneo que proviene de la dieta, as como del colesterol
que se produce de novo en las clulas. La progesterona se forma durante la
fase folicular del ciclo, gran parte es convertida en estrgeno por las clulas de
la granulosa antes de que sta pueda abandonar los ovarios, al entrar a la fase
lutenica se habr formado ya demasiada progesterona, y por consiguiente
tendr que ser secretada, en gran medida, a la circulacin sangunea.12

II.1. Caractersticas estructurales

La clasificacin de las hormonas esteroides se basa en el nmero de

carbonos de sus respectivas estructuras; la progesterona, de 21 carbonos,
pertenece al grupo de esteroides C21,18 su nombre qumico es 4-pregnano3,20-diona, con un peso molecular de 314.47 g/mol19.
La estructura de la Progesterona est relacionada con el ncleo del
ciclopentanoperhidrofenantreno, un sistema tetracclico de androstano, los
cuatro anillos se identifican como A, B, C y D comenzando con el anillo de la
izquierda inferior; en la figura 2 se muestra la numeracin del sistema anular de
dicha estructura as como las letras con las que se designan los anillos. Otras
caractersticas estructurales, consisten en la presencia de un grupo Oxo
(carbonilo) en el carbono 3, un doble enlace conjugado entre los carbonos 4 y 5

en el anillo A, y sustituyentes metilo en el carbono 10 del anillo A y en el

carbono 13 del anillo C. Tanto la cetona ubicada en C3 como el doble enlace
que se encuentra entre C4 y C5, le confieren el efecto progestacional a sta
molcula.20-22 La figura 2 muestra la estructura de la progesterona.

Figura 2. Estructura de la progesterona. Se observa la numeracin del sistema anular

del ciclopentanoperhidrofenantreno, as como las letras con las que se designan los
anillos.(A partir de datos en Litwack, 2004)

II.2. Biosntesis

Se cree que casi todas las clulas ovricas poseen la dotacin

enzimtica completa necesaria para convertir el colesterol en estradiol, sin
embargo, los diferentes tipos celulares del ovario contienen cantidades
variables de estas enzimas, por lo que en cada compartimiento principal
predominan hormonas diferentes. Por ejemplo, el cuerpo lteo produce
fundamentalmente P4 y 17-hidroxiprogesterona.23
Tras la ovulacin, la sntesis de progesterona se inicia en el cuerpo lteo
del ovario, formado a partir del residuo retenido del folculo ovulado. En el

ovario existen tres tipos de clulas productoras de hormonas: clulas de la teca,

clulas de la granulosa y clulas intersticiales del estroma, las dos primeras
forman parte de la estructura de los folculos, las cuales al aumentar de tamao
y acumular lpidos durante el pico preovulatorio de la LH adquieren la capacidad
de producir progesterona y pierden la capacidad de producir estrgenos debido
a la inhibicin de la enzima aromatasa P450 arom y P450 17-, este fenmeno
es conocido como luteinizacin.23, 24
El precursor bsico de la biosntesis esteroidea del ovario es el
colesterol,25 la principal fuente de ste, procede de las lipoprotenas de baja
densidad (LDL) circulantes,26, 27 las cuales se unen a receptores especficos de
las clulas productoras de esteroides y penetran en stas. En el interior de ellas
se unen con lisosomas, cuyas proteasas y esterasas desdoblan las
lipoprotenas y dejan en libertad al colesterol no esterificado y aminocidos28. El
colesterol tambin puede ser obtenido por medio de la sntesis de novo que se
da lugar en el retculo endoplasmtico liso a partir de la acetl-CoA. En el primer
paso de la sntesis, dos molculas de acetil-CoA reaccionan para formar
acetoacetil-CoA, la cual reacciona con otra molcula de acetl-CoA para formar
el compuesto 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (3HMG-CoA). En el siguiente paso, el
grupo 3-HMG libera CoA y simultneamente se reduce a mevalonato; los
primeros pasos de la sntesis se llevan a cabo con la ayuda de la enzima 3HMG-CoA-reductasa.

El

mevalonato

es

descarboxilado

hasta

producir

isopentenil-difosfato, el cual es convertido en su ismero dimetilalil-difosfato,

sta molecula se condensa con isopentenil-difosfato para obtener geranildifosfato al cual se le agrega otra molcula de isopentenil-difosfato para obtener
farnesil-difosfato el cual por medio de la fusin cabeza-cabeza con otra
molcula igual, forma el escualeno. Esta molcula se cicla para obtener
lanosterol, de la cual se eliminan tres grupos metilo, lo que da como producto
final el colesterol.20 (Fig.4)

La biosntesis de progesterona comienza con la unin de la LH a su

receptor especfico en la membrana celular del cuerpo lteo,29 lo que produce
un incremento en la produccin de AMP cclico que constituye el principal
mediador intracelular de LH. La unin de la LH a estos receptores,
pertenecientes a la familia de los receptores acoplados a protena G,30 activa el
sistema adenilato ciclasa, donde el ATP es convertido en AMP cclico (AMPc),
este ltimo activa el sistema protena kinasa A (PKA) que produce la
fosforilacin de diversas protenas, lo que multiplica la hidrolisis de los steres
de colesterol de las LDL e incrementa el transporte de colesterol a las
mitocondrias.18, 24 La figura 3 muestra el mecanismo de accin de la hormona
luteinizante

sobre

las

clulas

del

ovario,

lo

que

desencadena

la

esteroidognesis.

Figura 3. Mecanismo de accin de la hormona luteinizante sobre las clulas del

ovario para llevar a cabo la esteroidognesis. (Modificado de Litwack, 2004)

Por medio de la protena reguladora de la esteroidognesis aguda

(StAR), el colesterol intracelular es transportado a la membrana mitocondrial
interna, donde est localizado la enzima P450.18, 28
Para que la cadena lateral del colesterol pueda ser escindida por medio
de la citocromo P450 (CYP11A1), cuya funcin es romper el enlace entre los
tomos de carbono 20 y 22, es necesario primeramente hidroxilar estos dos
carbonos por medio de un complejo sistema enzimtico (22-hidroxilasa; 20hidroxilasa; 20,22-desmolasa),28, 31 produciendo pregnenolona de 21 carbonos;
sta fuera de la mitocondria se transforma en P4 por medio de la 3hidroxiesteroide deshidrogenasa que transforma el grupo 3-OH en un grupo 3ceto, y la 5,4-isomerasa que desplaza el doble enlace desde el anillo B hasta
el anillo A,18 una vez formada la P4 es liberada de la clula mediante un
proceso de difusin24. La figura 5 muestra la ruta de biosntesis de la
progesterona.

Figura 4. Ruta de biosntesis de novo del colesterol. (Modificado de Koolman, 2004)

Figura 5. Ruta de biosntesis de la progesterona. (Modificado de Litwack, 2004)

Si tiene lugar la preez en la hembra, el cuerpo lteo persiste por efecto

de las gonadotropinas corinicas placentarias y secreta progesterona para
apoyar la fase inicial de la gestacin.23 La placenta produce esta hormona en
cantidades suficientes como para no ser necesaria la presencia del cuerpo
lteo32.
Los esteroides no se almacenan dentro de las clulas que los producen,
sino que son sintetizados, secretados por difusin y transportados en la sangre
unidos a protenas del tipo de globulinas o albumina. 33, 34

10

II.3. Transporte y receptores

Las hormonas esteroideas son muy poco solubles en el plasma debido a

su carcter no polar, adems, cuando se encuentran libres penetran
rpidamente en las clulas por difusin a travs de la membrana,26 en especial
a nivel heptico y renal, que es donde se lleva a cabo su catabolismo,
principalmente. Por tanto, es necesario que circulen asociadas (de manera
reversible) a protenas plasmticas para que puedan permanecer un cierto
tiempo en la sangre y aumente la probabilidad de que lleguen a los tejidos
diana.35 No obstante, las hormonas unidas a las protenas no difunden bien a
travs de los capilares y no pueden acceder a sus clulas diana, por lo que
carecen de actividad biolgica hasta que se disocian de las protenas
plasmticas.12, 24
Las cantidades relativamente grandes de hormonas unidas a las
protenas actan como depsito y reponen la concentracin de hormonas libres
cuando se unen a sus receptores diana o son eliminadas de la circulacin.
Asimismo, la unin de las hormonas a las protenas plasmticas retrasa
considerablemente su eliminacin del plasma.12
La progesterona vertida en la circulacin general se une a las protenas
plasmticas y de esta forma es trasladada para mantener sus niveles en la
circulacin y protegerla del metabolismo y de la inactivacin (Fig. 6).18 La
Transcortina

o globulina de fijacin de corticoesteroides (CGB) es una

glucoprotena plasmtica que se une a la progesterona, el cortisol, la

desoxicorticosterona, la corticosterona y algunos otros compuestos corticales
menores. Tambin la progesterona, como el cortisol, se unen dbilmente a la
albmina y una pequea porcin queda libre.28 Los determinantes estructurales
ms sealados en la unin de los esteroides a la CBG son los grupos 4-3cetona y 20-cetona18.

11

Figura 6. La progesterona vertida en la circulacin se une de manera reversible a

protenas de transporte.(A partir de datos en Litwack, 2004)

12

Figura 7. Modelo de accin de una hormona esteroide.(Modificado de Litwack, 2004)

Las hormonas esteroides, ejercen su accin por medio de su unin a

receptores miembros de la superfamilia de receptores nucleares de factores de
transcripcin, entre los que se encuentran los receptores de andrgenos,
glucocorticoides,

mineralocorticoides,

estrgenos

progesterona.

Estos

receptores se caracterizan por tener una regin A/B amino-terminal requerido

para la completa actividad transcripcional del receptor, una regin de unin al
ADN formada por dos dedos de zinc, una regin bisagra participante en la
13

dimerizacin de la protena y un dominio carboxi-terminal de unin a la

hormona.36
Estos receptores se localizan en el citoplasma y al unirse a su ligando,
dimerizan y traslocan al ncleo donde actan como factores de transcripcin. La
unin de la P4 a su receptor produce la liberacin de los complejos de protenas
de choque trmico (HSP) que se encontraban unidas al receptor ocultando el
dominio de unin con el DNA. Una vez liberado el complejo de HSP, se produce
la unin del receptor a una secuencia consenso en el ADN denominada
elemento respondedor a Progesterona. Despus de la unin, el complejo
receptor activado, en el sitio aceptor del DNA, tiene lugar la estimulacin o
inhibicin de la transcripcin.35 Los nuevos RNA mensajeros, producto de la
transcripcin, se translocan desde el ncleo hacia el citoplasma a fin de formar
complejos de traduccin para la sntesis de protenas que modifican el
metabolismo y el funcionamiento de la clula diana (Fig. 7).18, 36

II.4. Actividad fisiolgica en tejidos blanco

Todos los cambios que se producen por efecto de la Progesterona en el

aparato reproductor de la hembra, la preparan para la preez y el
mantenimiento del feto.57 Los rganos en los que ejerce su accin esta
hormona, son el tero a nivel de endometrio y miomtrio, el eje hipotlamohipofisario, las glndulas mamarias y el ovario.35, 37, 38
A nivel de endometrio, activa pasos enzimticos que vuelven a los
estrgenos biolgicamente inactivos, adems de que disminuye el nmero de
receptores de stos, provocando su hipertrofia al inhibir la mitosis,
engrosndolo y transformndolo de proliferativo a secretor.

39, 40

En el miomtrio, mantiene los niveles de relaxina inhibiendo la

contraccin del musculo liso y trompas uterinas inducida por prostaglandinas,

14

adems disminuye la sntesis de stas, provoca el aumento de la viscosidad del

moco cervical, aumenta el entorno de colgeno y la distensible del tero. 23, 27, 4143

La Progesterona acta a nivel del eje hipotlamo-hipofisario regulando la

secrecin de gonadotropina y el comportamiento de apareamiento.44, 45
Sobre la glndula mamaria intensifica el desarrollo de ascinos
glandulares preparndolos para la lactancia.27, 41
De manera general, en el ovario, la progesterona inhibe el desarrollo de
folculos ovricos y los somete a atresia;46 reduce la mitosis y apoptosis de las
clulas de la granulosa, de igual manera inhibe la secrecin de estrgenos y
promueve su propia secrecin en estas clulas, la progesterona tambin acta
en el mantenimiento de las clulas luteales suprimiendo su apoptosis. 45
Durante las primeras semanas de la gestacin, la progesterona
sintetizada por el cuerpo lteo sostiene la preez para luego asumir esta
funcin la placenta.27, 41 Induce la reaccin decidual del endometrio preparando
al epitelio para la implantacin del blastocisto y manteniendo el tono uterino
durante la preez.23, 39 De igual manera inhibe nuevas ovulaciones durante esta
etapa reduciendo el pulso de liberacin de la hormona liberadora de
gonadotropina (GnRH).38
Es relevante destacar que tambin posee una actividad inmunosupresora
para evitar el rechazo del blastocisto y de la placenta del feto procurando su
retencin, ya que la progesterona regula el reconocimiento del complejo mayor
de histocompatibilidad paternos, la polaridad de las clulas T efectoras y la
sensibilidad de las clulas presentadoras de antgeno, as como la supresin de
la actividad de los macrfagos. Todas estas acciones estn mediadas por el
Factor Bloqueador Inducido por Progesterona (PIBF), sintetizado en los
linfocitos de hembras en gestacin por accin de la progesterona. 38, 46, 47

15

La accin hipertrmica que produce la Progesterona se debe a un

aumento de la temperatura basal, ocasionado por la disminucin del flujo
sanguneo que tiene por consecuencia una prdida menor de calor, dato de
gran valor diagnstico de la ovulacin. 23, 27, 41

16

III.

Medicin de progesterona en sangre

Las concentraciones de la mayora de las hormonas que dirigen la

funcin reproductiva, son mucho menores que las de las sustancias
bioqumicas habituales como carbohidratos o lpidos, y se necesitan tcnicas
especializadas para medir stas concentraciones tan bajas, por tanto las
determinaciones de stas en el laboratorio deben ser precisas, especficas y
exactas para identificar cambios en los valores hormonales. 48
Para cuantificar molculas, como las hormonas, en fluidos biolgicos que
se encuentran en concentraciones de nanogramos por mililitro, se utilizan los
inmunoanlisis que son tcnicas de unin que utilizan anticuerpos como
ligadores que se enlazan especfica y reversiblemente a la sustancia que se
interesa detectar o cuantificar. Existen junto con esta tecnologa otras ms,
como la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) o la cromatografa de
gas-lquido, que tambin son capaces de medir cantidades de masa a estas
concentraciones; sin embargo, se han descrito interferencias hidrosolubles en
algunas pruebas directas para la determinacin de esteroides, por lo que
todava no han logrado ser ampliamente disponibles para su uso cotidiano
como los inmunoanlisis.11, 48
Actualmente se cuantifican los niveles de progesterona mediante
inmunoanlisis

competitivos10

enzimoinmunoanlisis2,

como

el

radioinmunoanlisis6,

quimioluminiscencia9,

los

cuales

miden

concentraciones, no actividad biolgica. Sin embargo, para la mayora de las

hormonas existe una fuerte relacin entre la concentracin del esteroide que se
ha de determinar y la actividad biolgica.48
Es factible realizar el anlisis de progesterona en muestras de leche,
debido a que stas pueden obtenerse de forma repetida sin provocar ninguna
respuesta negativa en el animal. No obstante, cuando se desea conocer con

17

precisin los niveles existentes de esta hormona es necesario determinarlos en

sangre.8

III.1. Importancia de la medicin de la progesterona en la reproduccin del

ganado bovino

De manera global, la determinacin de los niveles plasmticos de

progesterona proporciona datos tiles en el estudio de la fertilidad, de la
efectividad de los procedimientos de sincronizacin e induccin del estro y para
documentar la existencia de ovulacin y una adecuada fase ltea.5 As mismo,
es til para la verificacin del estro, monitoreo del ciclo estral y deteccin de
disfuncin ovrica2. Adicionalmente, constituye una poderosa herramienta en el
estudio de los procesos reproductores de las especies domsticas, en la clnica
de fertilizacin In Vitro, trasplante embrionario y para explicar los factores que
afectan la eficiencia reproductiva.39, 49
De manera puntual, en el estudio de la fertilidad, es importante
determinar una adecuada fase ltea en las vacas, esto se logra cuantificando
los niveles de progesterona en sangre ya que sta se incrementan
progresivamente y de forma paralela al crecimiento del cuerpo lteo, formado a
partir del remanente de las clulas foliculares despus de la ovulacin; las
concentraciones de progesterona se mantienen elevadas durante toda la vida
del cuerpo lteo hasta el final del ciclo cuando se produce su regresin.32, 50, 51
La correcta deteccin del estro mejora el rendimiento reproductivo del
ganado bovino, a travs de la vigilancia de la actividad ovrica.50 La
determinacin de las concentraciones de progesterona es de gran ayuda junto
con otros mtodos veterinarios como auxiliar para confirmar con precisin la
deteccin del estro,50 etapa con mayor receptividad al macho, en la cual se
observan niveles de progesterona inferiores a 1 ng/mL, esta disminucin es
18

importante para suprimir la retroalimentacin negativa sobre la secrecin de

gonadotropinas aumentando la frecuencia pulstil en los niveles de stas, las
que estimulan el desarrollo de un folculo ovrico; a medida que ste se
desarrolla, se produce un aumento de los niveles de estradiol. Los niveles de
estradiol continan aumentando y cuando se alcanza cierto nivel se estimula la
receptividad al macho y comienza el periodo de estro.24 Al no detectar el estro
con precisin, se podran inseminar vacas que no estn receptivas, lo que
disminuye el ndice de concepcin del hato.50
De igual manera, el diagnstico exacto de la preez es de importancia
crucial para un programa reproductivo. Por ejemplo, el productor debe saber tan
pronto como sea posible si una vaca ha sido montada y no est gestante, para
que pueda ser montada sin demora en el prximo celo.1 Cuando se haya
producido el apareamiento y fecundacin, la cuantificacin de progesterona
permitir diagnosticar la gestacin,52 ya que el embrin sintetiza y secreta
protenas para sealar su presencia al sistema materno, las cuales sirven para
inhibir la sntesis de PGF2 luteoltica del tero y evitar la regresin del cuerpo
lteo, manteniendo de esta forma la produccin de progesterona. 53 Sin
embargo debido a que sta refleja la funcin del cuerpo lteo, vacas que no
estn gestantes pero presentan prolongaciones del ciclo por cualquier razn,
pueden ser diagnosticadas positivas.1
La medicin de progesterona tambin es til en el diagnostico de quistes
ovricos; las vacas con quistes luteales presentan un nivel elevado de
progesterona en el suero, en contraste, vacas con quistes foliculares producen
bajos niveles de progesterona. Es importante diferenciar ambos tipos de quistes
ovricos puesto que el rgimen teraputico puede ser diferente.38

19

IV.

Inmunoanlisis

Los inmunoanalisis han sido de especial valor para el estudio de las

funciones endocrinas de los rganos reproductivos y de diversos procesos
metablicos, ya que permite medir con exactitud la dinmica de los cambios
hormonales. Asimismo, son una poderosa herramienta de laboratorio en la
identificacin de problemas nutricionales, reproductivos y de manejo a nivel de
finca2. Ya que las hormonas esteroides son molculas pequeas con un peso
molecular de 300 a 400 Da, para su determinacin se requieren inmunoanlisis
del tipo competitivo.19,

54-56

stos se caracterizan por contar con tres

componentes primarios, el anticuerpo que tiene la funcin de molcula

enlazadora, la molcula o antgeno que se desea medir y el trazador que se
trata del mismo antgeno pero marcado.11 En este tipo de anlisis, ocurre una
competencia entre el antgeno que se desea medir y el antgeno marcado por
los sitios de unin del anticuerpo.57

IV.1. Principios bsicos

Los inmunoanalisis competitivos consisten bsicamente en una reaccin

qumica de unin reversible, no covalente, que se lleva a cabo entre una
molcula y un anticuerpo especfico para sta, mediante sitios reactivos
especficos en stas molculas y que obedece la ley de accin de masas. 58, 59
La ley de accin de masas expresa las velocidades de asociacin y
disociacin de los complejos, asi como las concentraciones de reactivos y
productos en el equilibrio. Estas velocidades de reaccin son directamente
proporcionales a las concentraciones de las substancias que reaccionan. De tal
forma, que cuando una reaccin se encuentra en equilibrio, las concentraciones
de las especies qumicas que se encuentran en ambos lados de la reaccin

20

sern constantes,60 as como sus respectivas velocidades de formacin las

cuales sern iguales hacia ambos lados de la reaccin. El concepto de
equilibrio qumico se puede representar con una reaccin monomolecular con
un sitio de unin como sigue:61
V1
[A]

[B]
V2

V1=k1[A]
V2=k2[B]
Dnde [A] y [B] representan a la concentracin de los reactivos y los
productos, V1 y V2 son las velocidades de formacin de productos y de reactivos
y K1 y K2 son las constantes de proporcionalidad de la reaccin de formacin y
disociacin del complejo. Los compuestos presentes en esta reaccin se
encuentran en equilibrio. Por consiguiente las velocidades de reaccin sern
iguales:
V1 = V2
k1[A] = k2[B]
Al despejar esta igualdad se obtiene:
[B]

[A]

k1 = Keq
k2

Se puede observar que al relacionar las concentraciones de [A] y [B] se

obtiene la constante de equilibrio (Keq). Por medio de sta ecuacin se expresa
la condicin de equilibrio de la concentracin de los reactivos y productos de
acuerdo con la Ley de Accion de Masas:
Keq = [B]
[A]

21

De manera similar la reaccin de formacin de complejos entre el

antgeno y el anticuerpo puede ser descrita mediante la ley de accin de masas:
V1
[Ag] + [Ac]

[Ag:Ac]
V2

V1 = k1 [Ac][Ag]
V2 = k2 [Ac:Ag]
Donde [Ac] y [Ag] son las concentraciones molares de los reactivos,
[Ag:Ac] la concentracin del complejo formado, K1 y K2 son las constantes de
formacin y disociacin del complejo, asi como V1 y V2 sus respectivas
velocidades.11
Cuando se alcanza el equilibrio en la reaccin de formacin del complejo
[Ag:Ac] las velocidades de reaccin son iguales:
V1 = V2
k1 [Ac][Ag] = k2 [Ac:Ag]
La relacin de las dos constantes de velocidad proporciona la constante
de equilibrio (Keq); sta tambin es conocida como la constante de afinidad, la
cual es una caracterstica clave para que un anticuerpo funcione correctamente
en un inmunoanlisis.55
Keq = k1 = [Ac:Ag]
k2

[Ac][Ag]

La afinidad es la fuerza de la union el antgeno y el anticuerpo que

puede determinarse por medio de la ecuacin anterior.58 Pero, debido a que el
anticuerpo se encuentra distribuido entre la fraccin libre y la unida, podemos
obtener el valor del anticuerpo libre de la siguiente manera: 55
[Ac] = [Act] - [Ac:Ag]

22

Donde [Ac] es la concentracin del anticuerpo libre en el equilibrio, [Act]

es la concentracin del anticuerpo total y [Ac:Ag] la concentracin del
anticuerpo unido.55

Substituyendo en la ecuacin de la constante de equilibrio, se obtiene:

Keq =

[Ac:Ag]
[Act] [Ac:Ag][Ag]

despus de despejar los trminos, la ecuacin obtenida es:

Keq [Act] - Keq [Ac:Ag] = [Ac:Ag]
[Ag]
La ecuacin anterior indica la relacin lineal entre la proporcin del
antgeno unido entre el libre, que est representada con el trmino [Ac:Ag]/
[Ac][Ag], y la concentracin del antgeno unido, representada como [Ac:Ag]. Al
graficar esta relacin, representando en el eje X la concentracin de antgeno
unido y en el eje Y la relacin de los analtos unidos y los libres, se obtiene la
grafica de Scatchard, la cual se emplea frecuentemente para evaluar la funcin
del anticuerpo (Fig. 8).55, 62

23

Figura 8. Grfica de Scatchard lineal. La pendiente de la lnea proporciona la

constante de afinidad y la interseccin de sta al eje x permite estimar la concentracin
de los sitios de unin del anticuerpo cuando se emplean anticuerpos
monoclonales.(Modificado de Montes, 1995)

Para representar los valores grficamente, es necesario estimar la

proporcin unido/libre que se encuentra representada como [Ac:Ag]/ [Ac][Ag] y
tambin puede representarse como B/F, as como obtener la expresin molar
del antgeno unido. Para obtener los resultados es preciso separar la fraccin
libre de la unida. Al separar ambas fracciones se medir la seal caracterstica
del trazador empleado en el anlisis procedente de los complejos [Ac:Ag] o la
proveniente de los reactivos libres, ya que la especie trazadora se encontrar
en ambas fracciones. Como se ver ms adelante, el tipo de marcaje para
detectar el analto condicionar el mtodo de deteccin de la seal, de sta
manera se podr obtener la

razn

B/F. Al representar B/F contra la

concentracin se observar la grfica de Scatchard.11, 63

24

La grafica de Scatchard es de utilidad para obtener el valor de la

constante de afinidad, la cual ser determinada por el valor de la pendiente de
la lnea. Sin embargo, otra utilidad de la grfica consiste en estimar la
concentracin de los sitios de unin del anticuerpo por la interseccin de la
recta en el eje X, siempre y cuando el anticuerpo tuviera un comportamiento
lineal en el sistema, como ocurre en el caso de los anticuerpos monoclonales. 11,
55, 62

Cuando se utilizan anticuerpos policlonales y se grafican los mismos

valores para realizar una grafica de Scatchard se obtiene una lnea curva,
dificultando las estimaciones, ya que esto significa que existen varias
poblaciones de anticuerpos con diferentes afinidades.55,

64-66

El valor de la

afinidad de un antisuero policlonal, se puede obtener determinando el promedio

de las constantes de asociacin entre los anticuerpos de alta y baja afinidad. A
este valor se le llamar avidez y tendr la misma interpretacin matemtica que
la afinidad (Fig. 9).65, 66

Figura 9. Grfica de Scatchard curva de un antisuero policlonal. El valor de la

constante de afinidad se obtiene determinando el promedio de las constantes de
asociacin de los anticuerpos de alta y baja afinidad.(Modificado de Montes, 1991)

25

En la reaccin de competencia, dos molculas de progesterona, una

marcada y otra sin marcar, compiten por un nmero limitado de sitios de unin
en el anticuerpo, el cual es especfico para unirse a esta hormona esteroide con
la misma afinidad, sin importar si sta se encuentra unida a una molcula
marcadora48, formando as complejos antgeno-anticuerpo y antgeno marcadoanticuerpo,57 hasta alcanzar el equilibrio como se representa a continuacin11:
Ag + 2Ac + Ag*

Ag:Ac + Ag*:Ac

Debido a que las cantidades de anticuerpo y trazador son constantes, la

inhibicin o favorecimiento de la unin del antgeno marcado con el anticuerpo
est relacionada con la concentracin del analto en la muestra, de esta
manera, conforme aumenta la concentracin de analto sin marcar en la
muestra, ocurre el desplazamiento del trazador por el analto para ocupar los
sitos de unin en el anticuerpo, la concentracin de trazador unido al anticuerpo
ser menor que la concentracin de analto unido, por lo tanto, despus de
separar las fraccin unida de la libre y medir la seal emitida por la fraccin
unida, sta ser menor si hay concentraciones mayores de analto.48,

63

La

seal detectada brinda un estimado de los sitios de unin que no se encuentran

ocupados por el analto, esto quiere decir, que la proporcin de trazador que se
une al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentracin del analto
en la muestra.11, 55
Este proceso de desplazamiento de la P4 marcada por la P4 sin marcar
cuando la concentracin de esta ltima aumenta puede observarse graficando
los datos obtenidos a partir del anlisis de muestras con concentraciones
conocidas, la grafica que resulta de este anlisis es llamada grafica dosisrespuesta o curva de calibracin.66 Para obtener los datos necesarios se utiliza
una serie de tubos conteniendo cantidades de progesterona marcada y
anticuerpo, bajo condiciones controladas, conocidas y constantes, como
temperatura, volumen, pH y concentracin, para que el anticuerpo se una con
la progesterona11. A estos tubos se les aade cantidades conocidas pero

26

variables de progesterona sin marcar, y despus de incubar los tubos hasta que
la reaccin inmune alcance el equilibrio, se separan las fracciones unidas de las
libres y se mide la emisin de la seal del trazador en la fraccin unida. 66
Los datos obtenidos se pueden analizar de distintas formas para realizar
la grafica dosis respuesta, el valor de la ordenada puede ser calculada de
cualquiera de las siguientes formas:67
Como el porcentaje de la emisin de seal detectada en la fraccin unida de
cada tubo (B), dividida entre la emisin en la fraccin unida al anticuerpo en
ausencia de ligando no marcado (B0):
% B = B/ B0 * 100
Porcentaje de la emisin de la seal de la fraccin unida, dividida entre la
emisin total en cada tubo (T) antes de la separacin de fracciones:
% B/T = B/T * 100
Porcentaje de la seal de la fraccin unida, entre la seal de la fraccin libre (F):
% B/F = B/F * 100
Cualquiera de los valores obtenidos para la ordenada, sean estos %B,
%B/T o %B/F, pueden ser graficadas contra la concentracin de la dosis de
progesterona no marcada o con el logaritmo de la concentracin de sta. De
igual manera, puede ser graficada directamente la relacin de la seal emitida
por la fraccin unida sin modificaciones matemticas, contra la concentracin
de la progesterona no marcada o el logaritmo de la dosis.11, 67
Una de las curvas de calibracin que se utiliza con ms frecuencia es la
curva Logit-Log, que es la relacin entre el logaritmo de (% B/F) en la ordenada
y el logaritmo de la concentracin de progesterona en la abscisa. 67 Con esta
grafica se obtiene una lnea recta, con la cual es ms simple comparar los
resultados, pero resulta ser complicado de realizar de manera manual, por lo
que se requiere la ayuda de un programa de clculo para computadora para

27

realizarla de forma relativamente simple.11, 67, 68 En la figura 10 se muestran tres

ejemplos de graficas usadas en inmunoanlisis.

Figura 10. Tres grficas de uso comn en inmunoanlisis competitivo.(Modificado de Gobello,

1998)

Con la grfica dosis respuesta para inmunoanlisis competitivos,

independientemente de los valores que se desee utilizar, se puede apreciar el
desplazamiento del trazador por el antgeno frio o analto, ya que todos los
modelos de graficas producen curvas que son inversamente proporcionales a la
cantidad de progesterona no marcada presente.67 Conforme aumenta la
concentracin de sta, la seal del trazador detectada en la fraccin unida
disminuye hasta un valor mnimo con concentraciones elevadas.48 El principio

28

bsico del desplazamiento del marcador unido debido a la dosis es un principio

que se aplica a todo inmunoanlisis competitivo.67
La curva dosis-respuesta es muy til no solamente para observar el
desplazamiento de la Progesterona marcada por la Progesterona sin marcar,
sino que tambin para estimar las concentraciones de la hormona en las
muestras problema, ya que los valores de la seal detectada estn en funcin
de la concentracin del analto.66,

68

Debido a que una muestra problema

experimenta un proceso de incubacin y separacin de fracciones bajo las

mismas condiciones que las muestras estndar al realizar la curva, tambin se
pueden detectar las emisiones de su fraccin unida, las cuales permitirn
estimar la concentracin del analto en la muestra, como en la curva estndar
se conocen las respuestas para un intervalo determinado de concentraciones,
el valor de la muestra problema puede ser identificado mediante interpolacin
en la curva estndar, la cual puede ser realizada por medio de un programa
para clculos en computadora (Fig. 11).66, 68, 69

Figura 11. Curva estndar e interpolacin.(Modificado de Garcs, 2008)

29

IV.2. componentes primarios

Los inmunoensayos estn constituidos por tres componentes principales:

el anticuerpo, el trazador y el antgeno no marcado (analto).

IV.2.1. Antgeno

Para que las sustancias de inters a medir puedan ser cuantificadas por
medio de inmunoanlisis, es necesario que stas posean actividad antignica. 70
El antgeno o ligando frio11 se puede definir como cualquier sustancia
que puede ser especficamente unida por un anticuerpo o por un receptor de
linfocito B, pero que no necesariamente genera una respuesta inmune. Los
antgenos que se pueden unir a anticuerpo pueden ser desde molculas
pequeas como las hormonas, hasta macromolculas como protenas,
glicoprotenas y otros productos naturales. nicamente las macromolculas son
capaces de estimular por si mismas respuestas inmunitarias, estas molculas
se denominan inmungenos. A pesar del conocimiento de la diferencia entre
estos dos trminos se continua utilizando el trmino antgeno como sinnimo de
inmungeno.58, 62, 71
De

igual

manera,

las

molculas

pequeas

pueden

unirse

especficamente a los anticuerpos, pero a diferencia de los inmungenos, estas

molculas no pueden activar a los linfocitos B por si mismas. stas, sin
embargo, pueden ser unidas covalentemente a macromolculas para formar un
inmungeno. En stos casos la molcula pequea se denomina hapteno y la
macromolcula, transportador.58, 71

30

Tabla 1. Caractersticas diferenciales entre inmungenos y haptenos.58, 71

INMUNGENO

HAPTENO

Peso molecular: >1000 Daltons

Peso molecular: <1000 Daltons

Macromolculas
del
tipo
de
los Molculas pequeas como
carbohidratos complejos, fosfolpidos, simples, lpidos y hormonas
cidos nucleicos y protenas
Capaz de estimular una respuesta inmune
por si solo

azucares

Incapaz de estimular una respuesta

inmune por s solo. Para tal fin, se debe
de unir a una molcula transportadora de
mayor peso molecular

IV.2.2. Anticuerpo

El anticuerpo es, generalmente, una inmunoglobulina G capaz de fijar

con gran afinidad y de manera especfica al antgeno que se encuentre
presente en el estndar o una muestra y se desee cuantificar, y de la misma
manera se unir al antgeno marcado con la misma afinidad y especificidad.70
La afinidad es la medida de la fuerza de unin entre un determinante
antignico y uno de los sitios de unin del anticuerpo.66 La interaccin entre
estos sitios de unin es estabilizada mediante la suma de los enlaces dbiles
presentes, como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals e
interacciones electrostticas e hidrofbicas. Puede entenderse como la
constante de afinidad de la reaccin entre un antgeno y un anticuerpo.72
Los anticuerpos deben ser especficos, es decir, ser capaces de unirse
nicamente con aquella molcula que se interesa medir, ya que pueden existir
estructuras antignicas similares que pueden reaccionar con los anticuerpos en
forma anloga y producir reacciones cruzadas y tener como consecuencia
resultados falsamente elevados.57, 63, 73

31

IV.2.3. Trazador

Es la sustancia que se desea medir, pero sta se encuentra unida a un

marcador

radioactivo,

enzimtico

quimioluminiscente. 11 Una

de

las

caractersticas que distingue a cada mtodo es el antgeno marcado, el cual

debe estar altamente purificado y al ser marcado no debe perder su
inmunorreactividad, debido a la falta de alteraciones alostricas cuando se
conjugan molculas marcadoras con antgenos pequeos.62, 63, 74
El tipo de marcaje para detectar el analto condiciona el mtodo de
deteccin. Por ejemplo, los mtodos radioisotpicos se basan en la deteccin
de la radiacin emitida; los espectrofotomtricos, fluorescentes o luminiscentes,
en la deteccin de luz; los electroquimioluminiscentes se basan en la emisin
de radiacin electromagntica producida por una reaccin qumica. 63

IV.3. Caractersticas analticas

Conocer las caractersticas analticas de un inmunoanlisis es de gran

utilidad para el analista a fin de saber el grado de confiabilidad que le puede
proveer el mtodo elegido. Para tal caso es necesario conocer las principales
caractersticas analticas del mtodo, como son la especificidad, sensibilidad,
precisin y exactitud.70
La especificidad de un mtodo inmunoanaltico est ntimamente
relacionada con la especificidad de los anticuerpos empleados en ste.70 Esta
caracterstica, como se dijo anteriormente, es la capacidad de un anticuerpo de
distinguir entre varios antgenos de estructuras similares. 57,

63, 66

La actividad

inmunolgica de la progesterona y otras molculas de estructura relacionada

puede ser semejante, pero no refleja la actividad biolgica de esta hormona y
por lo tanto se puede alterar la interpretacin de los resultados, obteniendo de
32

esta manera resultados falsos positivos cuando se pretende medir la actividad

biolgica a partir de la actividad inmunolgica. La especificidad puede ser
determinada mediante la medicin de los porcentajes de reaccin cruzada con
otras molculas relacionadas con la que deseamos cuantificar, en este caso
con la progesterona. 57, 73
La reaccin cruzada se define como la cantidad de antgeno diferente del
analto de inters que reacciona con el anticuerpo y que es necesaria para
reducir el 50% de la seal obtenida de la unin mxima de antgeno marcado,
en relacin a la cantidad de antgeno original que ocasiona la misma cada en la
seal.55, 66

%RC= Concentracin de analto que reduce el 50% de la seal

x100

Concentracin de analto que interfiere y reduce el 50% de la seal

Otra caracterstica que debe de cumplir un inmunoanlisis es ser
altamente sensible; esto, se refiere a la cantidad ms pequea de antgeno no
marcado que puede ser distinguida del estndar cero. La sensibilidad depende
de la afinidad del anticuerpo por el antgeno, la actividad especfica del antgeno
marcado, el volumen medio de incubacin, el pH del medio, el tiempo de
incubacin y la precisin del anlisis.57
Despus de haber analizado en repetidas ocasiones el estndar cero, el
valor de la sensibilidad puede ser determinado restando al valor de la media de
la respuesta dos desviaciones estndar, para obtener de esta manera el lmite
de deteccin de la respuesta, cuyo valor ser interpolado en la grafica dosis
respuesta para obtener la mnima concentracin de analto que puede ser
detectada (Fig. 12).55, 75

33

Figura 12. Grfica para obtener el valor de la sensibilidad. Este valor se obtiene
restando dos desviaciones estndar al valor de la media de la respuesta obtenida con
el estndar cero (B0), e interpolando ste en la grfica dosis respuesta.(Modificado de Davies,
2005)

La precisin describe la dispersin de los resultados con respecto al valor

esperado de una misma muestra. Cuando la dispersin de los valores
determinados en un anlisis es pequea, se dice que la precisin es alta. 76, 77
La precisin suele expresarse como coeficiente de variacin48,
porcentaje de la desviacin estndar sobre el valor de la media75:

%CV=

s x 100
X

34

es decir, el

Donde s es el valor de la desviacin estndar, X es la media aritmtica de los

resultados individuales.
Cuando se estudia la variacin en la cuantificacin de muestras iguales
en un mismo anlisis se dice que el coeficiente de variacin es intraensayo, y
cuando se estudia la misma variacin entre muestras iguales pero cuantificadas
en diferentes anlisis se le conoce como coeficiente de variacin interensayo. 70
Cabe destacar que no se debe de confundir la precisin con la exactitud,
ya que sta se refiere a la cercana del valor medio de la muestra al valor
verdadero del anlisis.75 El cual se puede saber cundo se dispone de patrones
de referencia certificados. En consecuencia, la exactitud puede evaluarse
realizando experimentos de recuperacin consistentes en aadir cantidades
conocidas del analto a muestras de suero o plasma libre del analto a
cuantificar y a relacionar la cantidad determinada en el anlisis con la
esperada.66 La exactitud se expresa como porcentaje de recuperacin en la
valoracin de una cantidad conocida de analto sobre la muestra.78 La forma de
obtener el porcentaje de recuperacin es la siguiente:

%Recuperacin =

valor observado
valor esperado

100

Otra forma de evaluar la exactitud, es comparar los resultados del analto

en las muestras obtenidos por medio del inmunoanlisis que se est
empleando, con los resultados obtenidos por otros inmunoanlisis previamente
validados correlacionando los resultados por el proceso de regresin lineal, del
que se espera un coeficiente de correlacin igual o cercano a 1.00.66

35

V.

Radioinmunoanlisis

Las primeras tcnicas inmunoanalticas aplicadas en endocrinologa

fueron los trabajos de Yallow y Berson en 1959, en los cuales se utilizaron
isotopos radioactivos y anticuerpos para analizar insulina. 79-81 Posteriormente,
en la dcada de los 80, los inmunoanlisis que utilizaban isotopos radioactivos
fueron establecidos en los laboratorios de produccin animal. Se comenzaron a
desarrollar y validar protocolos de RIA para ser utilizados para el anlisis de
Progesterona.59 Actualmente el RIA es aplicado en ganadera y en el campo de
la endocrinologa clnica para medir los niveles de progesterona en sangre con
mucha precisin.6, 7 , 81
El antgeno marcado es la sustancia que se desea detectar pero sta se
encuentra unida a una partcula radiactiva, lo cual es una de las principales
caractersticas que distingue a este mtodo. Los radioistopos ms frecuentes
empleados como marcaje en los radioinmunoanlisis son el I125, I131, H3, C14 y
P32. 11, 62
La caracterstica ms relevante de un radioistopo para ser seleccionado
como molcula marcadora es su vida media, que se refiere al tiempo que tarda
el ncleo original en desintegrase a la mitad.57 La mayora de los RIA
actualmente emplean el I125, la razn por la que este radioistopo es utilizado
con ms frecuencia, es debido a que necesita un tiempo relativamente corto
para el conteo y tiene una vida media superior al I131, pero no puede
almacenarse mucho tiempo, debido a su vida media de 60 das. 62 Este
radioistopo es un tomo inestable cuyo ncleo decae espontneamente a un
estado ms estable, emitiendo energa en forma de radiacin gamma. 57,

82, 83

Otro radioistopo utilizado es el tritio (H3), que emite radiaciones beta y que
tiene una vida media de 12.3 aos, pero requiere un tiempo mayor para el
conteo, y por tanto incrementa la duracin del ensayo, razn por la cual su uso
en RIA no es frecuente.62 En cambio, debido a sus caractersticas, el uso de

36

antgenos marcados con I125 posibilita el diseo de protocolos donde una de las
fracciones se queda en el tubo de ensayo cuya seal puede ser contada
directamente en trminos de cuentas por minuto (CPM) como emisiones de
radiacin gamma,62 mediante un contador de centelleo que detecta el numero
de desintegraciones por minuto (Fig. 13).83

Figura 13. RIA en fase slida que emplea I125. (Modificado de Ashihara, 2007)

V.1. Caractersticas analticas

Los RIA para determinar Progesterona siguen el mtodo competitivo, un

ejemplo de estos inmunoanlisis es el ensayo Coat-A-Count Progesterona7
cuyas caractersticas analticas son las siguientes:84
Sensibilidad: 0.02 ng/mL
Precisin
Coeficiente de variacin intraensayo (ng/mL)
Los datos mostrados en la tabla 2 fueron calculados para las muestras a partir
de los resultados de 20 pares de tubos en un solo ensayo.

37

Tabla 2. Coeficientes de variacin intraensayo del ensayo Coat-A-Count

Progesterona.84
1
2
3
4
5
6

Media

DS

CV (%)

0.34
0.82
1.5
3.3
18
30

0.03
0.04
0.06
0.12
0.7
0.8

8.8
4.9
4
3.6
3.9
2.7

Coeficiente de variacin interensayo (ng/mL)

Los datos mostrados en la tabla 3 fueron calculados para las muestras a partir
de los resultados de 20 pares de tubos en diferentes ensayos de la tcnica:
Tabla 3. Coeficientes de variacin interensayo del ensayo Coat-A-Count
Progesterona.84
1
2
3
4
5
6

Media

DS

CV (%)

0.31
0.84
1.4
3.3
18
28

0.03
0.06
0.08
0.13
1
1.1

9.7
7.1
5.7
3.9
5.6
3.9

Especificidad
En la tabla 4 se muestran las reacciones cruzadas que se observaron con otras
molculas diferentes a la progesterona pero con estructura relacionada:

38

Tabla 4. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona

observadas en el ensayo Coat-A-Count Progesterona.84
Componente

Reactividad cruzada (%)

Progesterona
Androstenediol
Corticosterona
Cortisol
Danazol
11-Desoxicorticoesterona
11-Desoxicorticoesterol
DHEA-SO4
20-Dihidroprogesterona
Estradiol
17-Hidroxiprogesterona
Medroxiprogesterona
Pregnano
5-Pregnan-3-ol-20-ona
5-Pregnan-3,20-diona
5-Pregnan-3,20-diona
Pregnenolona
5-Pregnen-3-ol-20-one-sulfato
Testosterona

100
ND
0.9
0.03
0.006
2.2
0.01
0.002
0.2
ND
3.4
0.3
ND
0.05
9
3.2
0.1
0.05
0.1

ND= No Detectable

Exactitud
Trescientas cuarenta muestras de suero de pacientes fueron sujetas a
ensayo con el procedimiento Progesterona Coat-A-Count y con el kit de
Progesterona IMMULITE, con concentraciones de progesterona que van desde
aproximadamente 0.17 a 18 ng/mL. La siguiente ecuacin define la relacin
lineal:
(CAC) = 1.05 (IML) + 0.13 ng/mL
R = 0.993

39

V.2. Ventajas y desventajas

El RIA tiene la ventaja de ser una tcnica de elevada sensibilidad ya que

permite cuantificar sustancias que se encuentran en concentraciones del orden
de pg/mL85 y la seal puede ser detectada sin optimizacin y con bastante
estabilidad frente a la interferencia ambiental del ensayo, adems de que el
empleo de isotopos radioactivos como marca no suele afectar a la actividad
antignica, debido a la falta de alteraciones alostricas62. Las desventajas del
RIA son la pronta caducidad del istopo radioactivo, como es el caso del I125
que tiene una vida media de 60 das, as como la necesidad de disponer de
instalaciones adecuadas y personal calificado para su realizacin, adems de la
debida disposicin de los desechos debido al riesgo de contaminacin
radioactiva para el personal y el medio ambiente.62, 86

40

VI.

Enzimoinmunoanlisis

En la dcada del 70, se desarrollaron inmunoanlisis que emplean

enzimas como molcula marcadora,87, 88 siendo de esta manera una alternativa
a la necesidad de trabajar con istopos radioactivos, para lo cual hace falta
siempre autorizaciones oficiales.62, 86
Actualmente,

los

ensayos

inmunoenzimticos

se

encuentran

comercialmente disponibles para su uso en veterinaria para determinar niveles

de progesterona en sangre, de los cuales se pueden encontrar ensayos
semicuantitativos as como tambin cuantitativos.89-92
El principio de los inmunoanlisis enzimticos es similar al de RIA,
excepto que no son istopos radioactivos los que se emplean como marca sino
enzimas, de las cuales la peroxidasa de rabano y la fosfatasa alcalina son las
de mayor aplicacin,79,

93

por lo tanto, no es la radioactividad la que se mide,

sino la actividad enzimtica del complejo formado.62 Esto ltimo puede lograrse
con la adicin de un sustrato en un segundo paso de incubacin. El tipo de
sustrato empleado es lo que va a definir si el inmunoanlisis es colorimtrico,
fluoromtrico o quimioluminiscente.83
En medicina veterinaria los EIA mas empleados para determinar
Progesterona son los del tipo colorimtrico8 y los quimioluminiscentes. El
mtodo colorimtrico funciona mejor con peroxidasa de rabano, ya que la
intensidad de la seal obtenida con sta enzima es mayor que la obtenida con
fosfatasa alcalina ante un substrato colorimtrico, brindando de esta manera
mayor sensibilidad al anlisis. El substrato que ms se usa comnmente con la
peroxidasa es el TMB (tetrametilbencidina),94 cuya reaccin genera un color el
cual es ledo por un espectrofotmetro que expresa el resultado en densidad
ptica79, stos resultados son graficados en la curva estndar para estimar la
concentracin del analto.83

41

El mtodo enzimtico quimioluminiscente es el mtodo de preferencia

por algunos laboratorios de investigacin veterinaria10,

91, 92

debido a que el

sustrato empleado en ste, por presentar alta estabilidad,93 ha permitido el

desarrollo de sistemas automatizados, facilitando de esta manera su ejecucin,
como es el caso del sistema IMMULITE,10 el cual utiliza fosfatasa alcalina como
molcula marcadora y adamantil-1-2-dioxetano aril fosfato (AMPPD) como
substrato. La reaccin inmunolgica en ste sistema es llevada a cabo en un
tubo que contiene una perla recubierta de anticuerpos especficos para
progesterona, dentro del cual se agregan la muestra y el reactivo de manera
automtica. Despus de la primera incubacin a 37C, el tubo es centrifugado
sobre su eje longitudinal y sometido a pasos de lavado entre cada
centrifugacin, dejando de esta manera, al tubo que contiene la perla recubierta
totalmente libre de antgeno no unido (Fig. 14). Despus del paso de lavado, se
adiciona el substrato AMPPD, cuyo grupo fosfato es escindido para producir
una molcula inestable que emite luz en el rango comprendido entre 400 y 750
nm, la cual es medida en un contador de fotones; las cuentas por segundo son
interpretadas, mediante la curva de calibracin almacenada en el equipo, como
la concentracin del analto (Fig. 15).95

42

Figura 14. Pasos del ensayo IMMULITE. 1) El reactivo y la muestra son pipeteados
automticamente en el tubo el cual es incubado a 37C; 2) En el paso de lavado, la
unidad es centrifugada a alta velocidad sobre su eje vertical; 3) La fraccin no unida es
retirada eficientemente de la unidad de ensayo; 4) Se aade el substrato
quimioluminiscente a la unidad para lograr la emisin de la luz.(Modificado de Bapson, 2005)

Figura 15. Reaccin enzimtica que se lleva a cabo en el sistema IMMULITE.(Modificado

de Bapson, 2005)

43

VI.1. Caractersticas analticas

Las caractersticas analticas del ensayo IMMULITE 1000 Progesterone

son las siguientes:96
Sensibilidad: 0.2 ng/mL
Precisin:
Coeficiente de variacin intraensayo (ng/mL)
Los datos estadsticos mostrados en la tabla 5 fueron obtenidos a partir de 20
replicas en una sola corrida.
Tabla 5. Coeficientes de variacin intraensayo del ensayo IMMULITE 1000
Progesterone.96
1
2
3
4

Media

DS

CV%

0.93
1.9
4.3
7.9

0.15
0.15
0.35
0.5

16
7.9
8.1
6.3

Coeficiente de variacin interensayo (ng/mL)

Los datos estadsticos mostrados en la tabla 6 fueron obtenidos a partir de
muestras analizadas en 20 corridas distintas.
Tabla 6. Coeficientes de variacin interensayo del ensayo IMMULITE 1000
Progesterone.96
1
2
3
4

Media

DS

CV%

0.81
1.7
3.9
7.2

0.13
0.17
0.31
0.42

16
10
7.9
5.8

44

Especificidad:
En la tabla 7 se muestran las reacciones cruzadas que se observaron con otras
molculas diferentes a la progesterona.
Tabla 7. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona
observadas en el ensayo IMMULITE 1000 Progesterone.96
Componente

Reactividad cruzada (%)

Progesterona
Androstendiona
Corticosterona
Cortisol
Danazol
11-Desoxicorticosterona
11-Desoxicortisol
Estradiol
17-Hidroxi-progesterona
Medroxi-progesterona
Pregnenolona
Testosterona
ND = no detectable

100
0.047
0.38
0.066
0.004
1.18
ND
ND
1.04
0.21
0.3
0.12

Exactitud:
El ensayo fue comparado con el IMMULITE 2000 Progesterona (L2KPW) en
182 muestras de pacientes. El intervalo de concentracin fue aproximadamente
de 0.2 a 20ng/mL. La relacin se define por la siguiente ecuacin:
(IML-LKPG)=1.19 (IML 2000-L2KPW) 0.60 ng/mL
r=0.969

45

VI.2. Ventajas y desventajas

Las ventajas de emplear mtodos enzimticos es que se evita el uso de

istopos radioactivos que pueden causar contaminacin y efectos nocivos a la
salud;62 las enzimas empleadas son ms estables que los isotopos radioactivos
y presentan una mayor vida de almacn3,

83

; una sola molcula de enzima

puede causar la conversin de 107 molculas de sustrato por minuto logrando

de esta manera una seal ms fuerte83; los reactivos necesarios son menos
costosos que los de RIA; todos los pasos de incubacin, separacin de las
fases, deteccin de la seal y procesamiento de datos, son realizados de
manera automtica en el sistema IMMULITE 1000

95

por lo que los resultados

pueden ser obtenidos con mayor rapidez3.

Entre las desventajas de ste mtodo est que la actividad de las
enzimas puede ser modificada por los anticoagulantes, por lo tanto sta tcnica
no puede ser utilizada con cualquier medio de recogida de muestras3, 79 adems
de que se requieren de dos incubaciones, de las cuales la segunda se trata del
paso para la generacin de la seal la cual es muy susceptible a
interferencias.83

46

VII.

Quimioluminiscencia

Las primeras aplicaciones de la quimioluminiscencia como tcnica analtica

fueron realizadas en el final de la dcada del 50, con la aplicacin de varias
sustancias quimioluminiscentes como indicadores volumtricos. A partir de
entonces, el inters analtico de la quimioluminiscencia ha aumentando
considerablemente debido a las ventajas

como alta sensibilidad y rangos

amplios de deteccin, as como la alta actividad especfica y la gran versatilidad

de los compuestos quimioluminiscentes.97 Las investigaciones se han centrado
especialmente en el desarrollo de productos quimioluminiscentes para
aplicaciones de diagnstico mediante tcnicas inmunolgicas 98, desde el
empleo de stos productos como substratos en inmunoanlisis enzimticos,
hasta su uso para marcar antgenos y anticuerpos de manera directa; as, la
quimioluminiscencia directa es hoy en da una alternativa ms al uso de
radioistopos, lo que puede significar un posible sustituto del RIA.97
Al igual que las tcnicas que emplean isotopos radioactivos y enzimas 9, los
inmunoanlisis de quimioluminiscencia directa y los electroquimioluminiscentes
son tcnicas empleadas en la actualidad por laboratorios de investigacin
veterinaria para determinar niveles de progesterona en sangre y obtener
diagnsticos exactos.99, 100
La Quimioluminiscencia es la emisin de radiacin electromagntica,
normalmente en la regin del visible o del infrarrojo cercano, producida por una
reaccin qumica,97 en la cual, la molcula luminiscente que reacciona puede
ser descompuesta en un fragmento excitado que emite luz o ser llevada a un
estado excitado que retorna a su estado fundamental lo que es acompaado de
la emisin de un fotn.81 La reaccin quimioluminiscente se produce de forma
adiabtica, es decir, que la reaccin ocurre sin prdida ni ganancia de energa
en forma de calor.101

47

Para lograr la emisin de luz, se emplean compuestos como esteres de

acridinio o luminol que son oxidados en medio bsico, por el perxido de
hidrgeno provocando la emisin de un fotn.81
Una de las principales molculas marcadoras utilizadas para generar
quimioluminiscencia directa es el ester de acridinio como ocurre en el caso del
sistema ADVIA Centaur,100 el cual emplea como fase solida, micropartculas
paramagnticas recubiertas de progesterona y como marca el ster de acridinio
que se encuentra unido a anticuerpos especficos contra la sustancia a analizar,
los cuales se unirn a la progesterona presente en la muestra y tambin a la
progesterona unida a la fase slida. Las partculas paramagnticas empleadas
en estos ensayos ofrecen una mxima superficie de contacto y una rpida
separacin magntica. Este ensayo se caracteriza por la emisin de luz visible
debido a una reaccin qumica producida por la oxidacin del ester de acridinio
en medio bsico (Fig. 16).81

48

Figura 16. Pasos que se llevan a cabo en el sistema ADVIA Centaur. 1) En la celda
de reaccin, el anticuerpo marcado con ster de acridinio se une a la progesterona
presente en la muestra y a su vez a un derivado de la progesterona unido a partculas
paramagnticas, se incuba la celda a 37C. 2) Despus del perodo de incubacin, se
lleva a cabo la separacin magntica de la fase slida, el aspirado del lquido contenido
en la celda y la separacin por lavado de los anticuerpos no unidos a la fase slida. 3)
A la celda de reaccin donde se encuentra la fase slida se le aaden los reactivos
para, 4) iniciar la reaccin de quimioluminiscencia.(Modificado de Taylor, 2005; Kricka, 2005)

El mtodo electroquimioluminiscente tambin es empleado en medicina

veterinaria para determinar niveles de progesterona en sangre, como es el caso
del sistema Elecsys 2010 con el cual se pueden obtener resultados exactos.99
ste sistema emplea partculas paramagnticas cubiertas de estreptavidina las
cuales en una segunda incubacin sern recubiertas de anticuerpos marcados
con biotina que habrn reaccionado de manera competitiva con la progesterona
de la muestra y la progesterona marcada en la primera incubacin (Fig. 17). La
molcula que es empleada como marca en este sistema es el rutenio II; ste
compuesto en presencia de tripropilamina es oxidado en la superficie de un
electrodo mediante la aplicacin de un potencial elctrico, el cual tambin oxida
49

a la tripropilamina de manera simultnea y es convertida en un catin radical,

que reacciona con el Rutenio oxidado el cual pasa a un estado excitado y emite
un fotn de luz a 620nm al decaer a su estado basal a travs de la reduccin
con tripropilamina(Fig. 18).102,103

Figura 17. Reacciones de unin involucradas en el sistema ELECSYS . 1) La muestra

es incubada en presencia de anticuerpos unidos a biotina y progesterona marcada con
rutenio II. 2) En la segunda incubacin, el complejo inmune formado es unido a
partculas recubiertas de estreptavidina, las cuales tienen una alta capacidad de unin
a la biotina. 3) La mezcla de reaccin es trasladada a la celda de medicin donde las
micropartculas son magnticamente capturadas en la superficie de un electrodo y los
componentes libres separados por lavado. 4) Como paso final, la quimioluminiscencia
es inducida por medio de la aplicacin de un potencial elctrico en la superficie del
electrodo.(Modificado de Myers, 2005)

50

Figura 18. La reaccin de oxidacin del rutenio en la superficie del electrodo se lleva a
cabo en presencia de tripropilamina (TPA), que es oxidada simultneamente con el
rutenio al aplicarse un potencial elctrico y convertida en un catin radical que pierde
un protn y reacciona con el rutenio oxidado, resultando en el estado excitado de ste,
el cual decae a su estado basal con la emisin de un fotn. (Modificado de Myers, 2005)

Para medir la luminiscencia obtenida por quimioluminiscencia directa as

como por electroquimioluminiscencia, cuyas reacciones se llevan a cabo en una
celda aislada de la luz, se utiliza un tubo fotomultiplicador, el cual detecta los
fotones de luz emitida y los convierte en pulsos elctricos que son contados por
el sistema en Unidades Relativas de Luz (RLU). 81 La intensidad de la emisin
de luz es relacionada con la curva patrn almacenada en el sistema para la
cuantificacin del analto; los datos obtenidos son convertidos automticamente
por el software del sistema a datos de concentracin del analto, los cuales
tambin pueden ser convertidos a unidades del Sistema Internacional de
Unidades (SI). Esta caracterstica se presenta en el sistema ADVIA Centaur de
SIEMENS y en cualquiera de los sistemas Elecsys de Roche.102, 104

51

VII.1. Caractersticas analticas

Las caractersticas analticas del ensayo Elecsys Progesterone II son las

siguientes105:
Sensibilidad analtica: 0.03 ng/mL
Precisin intraensayo e interensayo (ng/mL).
La precisin fue determinada mediante reactivos Elecsys, sueros
humanos y controles segn un protocolo modificado (EP5-A) del CLSI (Clinical
and Laboratory Standards Institute) (tabla 8)
Tabla 8. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del analizador Elecsys
2010.105
Elecsys 2010
Muestra
SH 1
SH 2
SH 3
PC U 1
PC U 2

Media (ng/mL)
1.57
12
30.2
8.83
20.8

Precisin Intraensayo
DS (ng/mL)
CV %
0.04
2.4
0.17
1.5
0.76
2.7
0.19
2.3
0.35
1.7

Precisin Interensayo
DS (ng/mL)
CV %
0.09
5.4
0.48
4.1
1.54
5.5
0.38
4.6
0.77
3.7

SH= suero humano

PU C= PreciControl Universal

Tabla 9. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del analizador MODULAR

ANALYTICS E170.105
MODULAR ANALYTICS E170
Precisin Intraensayo
Muestra

Precisin Interensayo

DS
(ng/mL)
0.02

CV %

SH 1

Media
(ng/mL)
0.73

DS
(ng/mL)
0.04

CV %

2.9

Media
(ng/mL)
0.79

SH 2
SH 3

3.01
32.4

0.04
0.3

1.4
0.9

3.13
35.3

0.09
0.7

2.8
2

PC U 1
PC U 2

4.89
19.3

0.05
0.14

1.1
0.7

5.26
20.4

0.17
0.38

3.3
1.8

52

4.8

Especificidad:
Las reacciones cruzadas observadas con otras molculas diferentes a la
progesterona se muestran en la tabla 10.105

Tabla 10. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona

observadas en el ensayo Elecsys Progesterone II (en %).105
COMPUESTO

Androstendiol
Androstendiona
Corticosterona
Cortisol
Danazol
DHEA-S
D-(-)-Norgestrel
Estradiol
Etisterona
Etinoldioldiacetato
Medroxiprogesterona
Noretindrona
Noretindrona acetato
Testosterona
4-Pregnen-11-17-diol-3,20-diona
11-Desoxicorticosterona
11-Desoxicortisol
5--Dihidrotestosterona
5--Dihidroprogesterona
5-Pregnen-3-ol-20-ona
5-Pregnan-3-ol-20-ona
6-Metil-17-hidroxi-progesterona acetato
6-Metilprednisolona
17-Hidroxipregnenolona
17-Hidroxiprogesterona
20-Hidroxi-4-pregnen-3-ona

0.002
0.136
0.687
0.005
0.002
0.009
0.008
0.009
0.002
n.d.
0.812
0.01
n.d.
0.02
0.338
0.296
0.392
0.04
20.7
0.858
0.211
0.257
n.d.
0.018
1.3
0.016

n.d.=no detectable
Exactitud: se compar el ensayo Elecsys Progesterone II con el ensayo
Elecsys Progesterone usando muestras clnicas, y se obtuvo la siguiente
correlacin:
53

Nmero de muestras: 88
Regresin lineal
y = 0.90x + 0.50
r = 0.998
Las concentraciones de las muestras eran de aproximadamente entre 0.2 y 44
ng/mL.
El mtodo quimioluminiscente directo ADVIA Centaur Progesterona
presenta las siguientes caractersticas analticas106:
Sensibilidad analtica: 0.15 ng/mL
Precisin
Para obtener la precisin se analizaron seis muestras seis veces, en cada una
de diez series, en tres sistemas, durante un perodo de tres das (tabla 11).
Tabla 11. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del ensayo Progesterona
de ADVIA Centaur.106
Media (ng/mL)
1.2
1.5
7.2
11.9
20.9
48.7

CV intraensayo
(%)
12.4
7.2
3.7
2.5
3.2
2.5

CV interensayo
(%)
2.6
5.7
3.9
3.1
1.9
4.2

CV total (%)
12.7
9.2
5.4
3.9
3.7
4.8

Especificidad.
El ensayo Progesterona de ADVIA Centaur presenta una elevada
especificidad para la progesterona. Se aadieron los siguientes compuestos a
Multidiluyente 3 y se determin el Valor aparente de progesterona. El porcentaje
de reactividad cruzada es el resultado aparente en comparacin con la cantidad
agregada (tabla 12).

54

Tabla 12. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a progesterona

observadas en el ensayo Progesterona de ADVIA Centaur.106
Compuesto

Reactividad cruzada (%)

Cortisol

ND

11-desoxicorticosterona
Corticosterona

0.08
0.95

Testosterona
Aldosterona

ND
ND

Pregnenolona
Androstenodiol

0.46
ND

17-hidroxiprogesterona
11-desoxicortisol

0.31
ND

Danazol
Prednisolona

ND
ND

17-estradiol
Estrona

ND
ND

Estriol
Clomifeno

ND
ND

Bromocriptina

ND

ND=No detectable

Exactitud:
Se compar el ensayo Progesterona ADVIA Centaur con el ensayo
Progesterona

ACS:180,

realizando

el

anlisis

de

230

muestras

con

concentraciones dentro del rango de 0.15 a 53.7 ng/mL, la relacin se define

por la siguiente ecuacin:
Progesterona de ADVIA Centaur = 0,97 (Progesterona de ACS:180) 0,12
ng/ml
Coeficiente de correlacin (r) = 0,99.

55

VII.2. Ventajas y desventajas

Todos los pasos de adicin de reactivos, generacin de la seal y deteccin

de sta son realizados de manera automtica en el equipo analizador; debido a
la automatizacin se reduce la manipulacin de los reactivos conservndolos en
buen estado; las molculas marcadoras utilizadas para la quimioluminiscencia
no generan ruido de fondo, adems de no generar radioactividad lo que no
produce riesgos a la salud derivados de la exposicin a los reactivos, por lo
tanto, no se necesitan licencias especiales de operacin para el personal que
realiza el anlisis, como en el caso de Radioinmunoanlisis, lo que significa un
importante ahorro de recursos econmicos81, 83; no se necesita realizar la curva
patrn de manera manual, ya que sta se encuentra almacenada en l sistema,
adems de que la estabilidad de las calibraciones presenta un tiempo
prolongado, lo que reduce el tiempo de operacin y optimiza el costo por
prueba; pueden obtenerse limites de deteccin muy bajos y los resultados son
interpretados directamente en unidades de concentracin del analto en
cuestin de minutos.81, 102, 104 Pero a pesar de las ventajas ofrecidas, se debe
de tener especial cuidado al manipular los reactivos, ya que los ensayos por
quimioluminiscencia requieren reactivos escrupulosamente puros debido a que
las impurezas pueden causar una seales de fondo no especficas que afecta a
la sensibilidad del ensayo.83

56

VIII.

Anlisis y discusin

Se realiz la revisin bibliogrfica de las tcnicas inmunolgicas para

medir progesterona en sangre, de las cuales los sistemas ms empleados en
medicina veterinaria son los sistemas Coat-A-Count, IMMULITE 1000 y ADVIA
Centaur de SIEMENS y ELECSYS 2010 de Roche, los cuales se basan en el
mtodo competitivo.
Los sistemas descritos en ste trabajo presentan caractersticas
analticas apropiadas para medir progesterona, pues presentan una sensibilidad
que permite detectar las concentraciones mnimas de sta hormona durante el
ciclo estral, y cuyos valores son cercanos a 1 ng/mL. As mismo, muestran
buena especificidad hacia la progesterona, ya que el porcentaje mximo de
reaccin cruzada que se registra es de 20.7% para 5--dihidroprogesterona;
ste porcentaje no es significativo ya que este metabolto es derivado de la
progesterona, en consecuencia, si la concentracin de progesterona en sangre
aumenta o disminuye, la 5--dihidroprogesterona tambin lo har de manera
proporcional, pero siempre se encontrar en menor cantidad. 107 Los valores
mximos de coeficientes de variacin intra e inter ensayo se observan en el
sistema IMMULITE 1000, los cuales son admisibles para los inmunoanlisis que
determinan hormonas en medicina veterinaria.10, 73, 91 Los cuatro sistemas son
exactos ya que al ser relacionados con otros sistemas previamente validados
demostraron coeficientes de correlacin cercanos a uno.
Si bien los cuatro sistemas tienen caractersticas analticas similares,
cada uno recurre a cierta tcnica que no presentan iguales particularidades
tecnolgicas. Las tcnicas quimioluminiscentes y la enzimtica mencionadas en
esta monografa se valen de sistemas automatizados y la radioinmunoanaltica
de un mtodo manual. sta condicin conlleva de manera adjunta ciertas
ventajas y desventajas. Por ejemplo, los sistemas automatizados no requieren
de gran manipulacin de los reactivos por parte del operador a diferencia del

57

sistema manual, adems de tener el inconveniente de utilizar reactivos

peligrosos por ser radioactivos hacindose presente el riesgo de contaminacin
radiactiva en caso de ocurrir un accidente, y en adicin, el simple hecho de
manipularlos constituye una exposicin a la misma. Derivado de estos
aspectos, las normativas establecidas exigen contar con personal clasificado
como ocupacionalmente expuesto, as como los requerimientos que deben
tener los laboratorios que manipulen este tipo de materiales.86, 108-110
En cuanto a la estabilidad de los reactivos, los utilizados en mtodos
enzimticos son ms estables que los isotopos radioactivos, por presentar una
mayor vida de anaquel, sin embargo, en el mtodo enzimtico la actividad de
las enzimas puede ser modificada por anticoagulantes, por consiguiente no
puede ser empleado cualquier medio de recoleccin de muestra. Por su parte la
quimioluminiscencia directa requiere de reactivos escrupulosamente puros, ya
que las impurezas pueden afectar la sensibilidad del ensayo. En contraste el
empleo de isotopos radioactivos no afecta la actividad antignica ya que no
crea alteraciones alostricas que puedan afectar la sensibilidad del ensayo.
Es importante considerar que el precio por unidad de anlisis de un
sistema automatizado puede ser ms elevado que el precio por tubo de un
sistema manual. Por ejemplo, el precio del paquete que contiene 100 tubos
para realizar RIA es de 237.80 USD, el de 200 tubos es de 408.32 USD y el del
que contiene 500 tubos es de 997.60 USD. El precio del paquete de unidades
de anlisis del sistema IMMULITE 1000 para 100 pruebas es de 377.02 USD.
Todos los precios son vigentes al 2012 con IVA incluido.111 Por lo tanto es ms
caro el costo por tubo del sistema IMMULITE 1000 (3.77 USD) que el de RIA
(2.37 USD).
Los datos obtenidos en el presente trabajo, son de utilidad para
considerar qu mtodo es conveniente establecer en el laboratorio, pero
tambin se debe tomar en consideracin la capacidad econmica para la
adquisicin de uno u otro sistema, por lo que tambin puede considerarse en

58

qu parte de la tcnica es posible tener un ahorro de los recursos econmicos e

integrarlos en la rutina, haciendo a la tcnica menos cara. A pesar de las
ventajas que ofrecen los mtodos automatizados, estos pudieran no ser una
opcin para algunos laboratorios ya sea porque stos no cuentan con los
suficientes recursos econmicos para adquirirlos o bien porque ya han
establecido el sistema Radioinmunoanaltico.
Es importante tomar en cuenta el costo de operacin de la tecnologa,
porque el costo de un equipo automatizado es mayor que el del sistema
manual, y el impacto del costo est reflejado en la frecuencia e intensidad de
uso de este mismo equipo, por ejemplo si un equipo manual cuesta 4,977 USD
y el automatizado 5,880 USD, y ambos procesan 500 muestras por da, el costo
de operacin del equipo por unidad de muestra procesada para el primero es de
9.95 USD y para el segundo 11.76 USD.112
Desde el punto de vista del tiempo de vida til del equipo, que se
determina a travs de la depreciacin, si dos equipos tienen la misma vigencia
til, pero uno de ellos es ms costoso, al final ste ltimo tambin tendr un
valor ms alto de depreciacin. Por ejemplo, si los equipos mencionados
anteriormente, tienen los mismos periodos de vida til, la depreciacin a 10
aos, suponiendo que no existe costo de recuperacin del equipo mismo ($0.0),
por el mtodo lineal es de 497.7 USD/ao para el equipo manual y de 588.0
USD/ao para el automatizado.112, 113
Finalmente se puede aadir los costos de mantenimiento del equipo, este
costo es mayor para un equipo cuyos componentes sean ms caros, ya sea
por el costo de sus refacciones o por la mano de obra tcnica. Estas son
condiciones que deben analizarse al momento de decidir cual tecnologa
implementar, principalmente en pases como Mxico, en el cual la investigacin
es altamente dependiente de tecnologa extranjera.114, 115

59

Para atender el inconveniente econmico que acarrea realizar pruebas

inmunoanalticas, se han encontrado investigaciones en la literatura que han
propuesto alternativas para superar este obstculo.
Una de estas investigaciones encontradas, fue la realizada por Montes et
4

al. en la cual se validaron dos tcnicas radioinmunoanalticas para medir

progesterona, establecidas utilizando anticuerpos obtenidos mediante la
inmunizacin de animales con progesterona. La primera tcnica utiliz
anticuerpos inducidos en plasma de conejo y la segunda con anticuerpos
inducidos en gallina de postura extrados de la yema de huevo.
Al hacer la evaluacin de las caractersticas analticas, se encontr que
stas fueron adecuadas para reconocer actividad luteal, ya que presentaron
reacciones cruzadas inferiores a 7% y sensibilidad menor a 0.27 ng/mL, a pesar
de observarse coeficientes de variacin intraensayo de 14.7 y 19.6%, y
coeficientes de variacin interensayo de 22.7 y 22.2% para la tcnica
establecida con anticuerpos de conejo y la establecida con anticuerpos de yema
de huevo, respectivamente. Estos valores elevados fueron explicados por la
presencia de residuos de solventes orgnicos en los tubos donde se
concentraron los esteroides para ser analizados despus del proceso de
extraccin. Aunque los valores de coeficientes de variacin fueron elevados,
stos se encontraron por debajo de los de algunos inmunoensayos comerciales
para medir progesterona, disponibles en 1996, los cuales presentaban
coeficientes de variacin intra e interensayo de 33 y 32% respectivamente.
Adems, al comparar el valor de las concentraciones de progesterona
determinadas con los radioinmunoanlisis establecidos en los cuales se
emplearon los anticuerpos obtenidos y las estimadas con un

estuche

comercial, se obtuvo una elevada correlacin.

Aunque ambas tcnicas establecidas por Montes et al. presentaron una
precisin comparable a la ofrecida por algunos inmunoensayos comerciales,
ste es un parmetro que ha sido mejorado en la actualidad, logrando

60

coeficientes de variacin mximos de hasta 16% en los estuches comerciales.

Esta mejora en la precisin representa un nuevo reto para las investigaciones
que tengan como objetivo establecer tcnicas inmunolgicas a partir de
anticuerpos obtenidos de nuevas fuentes biolgicas, logrando as igualar las
caractersticas analticas de los sistemas disponibles en el mercado, los cuales
cumplen con las ms altas exigencias de calidad.
Para estimar el costo de produccin por tubo, se tom en cuenta el
material biolgico, los reactivos y qumicos para preparar los anticuerpos, el
trazador, calibradores, insumos secundarios como amortiguadores, fosfato
salino, carbn activado, reactivos para extraer esteroides en plasma sanguneo,
esteroides para medir especificidad de anticuerpo, equipos y herramientas para
realizar la medicin como centrifuga, termmetro y bao mara.
Los resultados obtenidos por Montes et al. demuestran que el costo de
produccin por tubo disminuy conforme aument el rendimiento del anticuerpo.
El costo por tubo de un estuche comercial estuvo entre uno y dos dlares en el
ao de 1996. En la tcnica donde se utiliz anticuerpos de conejo, el costo por
tubo fue de 0.14 USD, y 0.20 USD para la que utiliz anticuerpos de yema de
huevo de gallina. En la actualidad el costo por tubo recubierto de anticuerpos de
un estuche comercial oscila alrededor de los 2 USD, por lo anterior se observa
que el costo se ha mantenido y por lo tanto la produccin de anticuerpos sigue
siendo una excelente alternativa para la reduccin del costo, sin embargo, se
tendra un desperdicio en los recursos biolgicos si el objetivo fuera aplicarlo en
un solo laboratorio, pues la produccin de anticuerpos fructifica para varios
millones de tubos. No obstante, dicha propuesta resultara ms rentable si la
produccin de anticuerpos fuera compartida entre laboratorios a travs de
vinculaciones.
Otro aspecto en el que se puede generar el ahorro de recursos es en la
separacin de la fraccin unida al anticuerpo de la fraccin libre. Una de las
investigaciones ms prometedoras al respecto, fue la realizada por Gonzlez et

61

al.14, en la cual fue desarrollado un mtodo inmunoenzimtico competitivo en

fase liquida. En ste mtodo los complejos antgeno anticuerpo formados son
atrapados por un segundo anticuerpo que se encuentra acoplado a partculas
magnetizables, las cuales permiten que los complejos sean precipitados por
una gradilla magntica para seguidamente proceder a los pasos que genera la
reaccin de color para la cuantificacin.
Cabe resaltar que el trazador, un conjugado de progesterona con la
enzima fosfatasa alcalina, que cataliza la reaccin con el sustrato colorimtrico
fue preparada en el mismo laboratorio y el anticuerpo empleado contra la
progesterona fue donado por el Laboratorio de Hormonas del Centro Mdico
quirrgico de Buenos Aires, que fue utilizado para inmunizar carneros y obtener
anticuerpos antiglobulinas de ratn que despus fueron acopladas a magnetita
para obtener el reactivo de separacin. La calidad del mtodo fue validada
comparndola con los reactivos de la Matched Reagent Program del Programa
de Reproduccin Humana de la OMS, y adicionalmente los resultados
obtenidos se compararon con el mtodo radioisotpico PROG-CTRIA,
obteniendo

resultados

reproducibles

de

los

mtodos

de

referencia,

demostrando la exactitud de mtodo. Adems, se observ que las reacciones

cruzadas con otras molculas relacionadas a la progesterona fue inferior a
0.013% y sensibilidad de 0.71 nmol/L equivalente a 0.22 ng/mL, lo que
demuestra que ste mtodo es adecuado para ser incorporado en un
laboratorio de diagnstico, a pesar de haberse obtenido coeficientes de
variacin intra e interensayo de 15 y 30% respectivamente. Para evitar stos
valores altos de coeficientes de variacin, los autores recomendaron mejorar la
conservacin y estabilidad de los reactivos preparados en el laboratorio y cuidar
las medidas de manipulacin de stos.
Las ventajas de ste mtodo es que no requiere de centrifugacin para la
separacin de fases ni extraccin de esteroides con solventes orgnicos, por
tanto slo depende del uso de tubos convencionales, de gradillas con base

62

magntica y un colormetro convencional para realizar las lecturas, evitando la

necesidad de adquirir centrifugas y equipos complejos de conteo. Por esta
razn, aunque no se realiz un anlisis de costos, la implementacin de este
mtodo significa un importante ahorro de recursos econmicos para el
laboratorio que desee implementarlo.
La separacin de fracciones por medio de partculas magnetizables es un
mtodo que es empleado en la actualidad por sistemas automatizados de
inmunoanlisis, por sta razn, pueden ser exploradas nuevas ideas que
puedan ser aprovechadas en ste o en algn otro paso del ensayo, indicando
que estas investigaciones no solo pueden ser empleadas para lograr el ahorro
de recursos econmicos sino tambin pueden extrapolarse a otros campos
como es el del diseo de tecnologa destinada al diagnstico. De igual manera,
la investigacin de fuentes alternativas para obtener recursos biolgicos
representa un aporte importante en el desarrollo tecnolgico, ya que el obtener
fuentes sostenibles y abundantes de stos recursos, aumenta la posibilidad de
lograr una produccin en masa de tecnologa para el diagnostico.116 Esto
conducira a la reduccin de los costos, lo que posibilitara el acceso de estos
sistemas a mayor nmero de laboratorios de investigacin y a productores de
ganado, lo que ocasionara un manejo reproductivo ms eficiente de los hatos
bovinos, reflejndose en el ahorro de los costos de produccin en la ganadera
mexicana, lo cual beneficia al sector ganadero, que tiene por objetivo cubrir las
necesidades alimentarias de la sociedad.

63

IX.

Conclusin
Debido a la importancia de la funcin de la progesterona en la

reproduccin, es necesario conocer las caractersticas de las tcnicas

inmunoanalticas para medir sus concentraciones, as como las ventajas y
desventajas de los sistemas disponibles en la actualidad, con el objetivo de
elegir que mtodo es ms conveniente establecer en un laboratorio.
Pese a los beneficios de implementar un inmunoanlisis, sto puede no
ser una opcin para algn laboratorio que no cuente con los suficientes
recursos econmicos, por tanto es conveniente analizar alternativas para la
disminucin de costos, estableciendo tcnicas inmunoanalticas a partir de
componentes primarios. Aunque se pueden presentar diversas limitantes para
que los laboratorios produzcan sus propios insumos primarios, como pueden
ser la escasa disponibilidad de recursos humanos, materiales y econmicos,
entre otras.
A pesar de estas limitaciones, existe posibilidad de vincular con
instituciones, con las cuales se puede intercambiar apoyos para realizar
investigacin, como tecnologa, material biolgico o mano de obra, que si bien
puede que no cubran las necesidades en su totalidad, si pueden disminuir el
impacto monetario que implica la falta de stos. Estas vinculaciones
aumentaran las posibilidades de abrir acuerdos de transferencia tecnolgica
entre instituciones de investigacin y la iniciativa privada, aplicables al diseo
de sistemas inmunoanalticos.
Por esta razn, es importante dejar de lado las concepciones que
impiden el crecimiento de la investigacin tecnolgica que est dirigida a la
vinculacin directa con la industria pecuaria en Mxico; con base en esta
concepcin, el desarrollo tecnolgico tendra como una de las metas
principales, la menor dependencia tecnolgica del extranjero, que en sta
monografa se mencion la existencia de varios para alcanzar parte de esta
meta.
64

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