PRACTICA No.

6 TINCIONES
1.-OBJETIVO
Realizar el procedimiento (tincin) para identificar microorganismos gram-positivos y
gram-negativos con la ayuda del microscopio.
2.-INTRODUCCION
Para la observacin de los microorganismos es necesario la utilizacin del microscopio,
debido a que estos son seres de tamao microscpicos y no pueden ser vistos a simple vista.
Para que la observacin de microorganismos sea lo mejor posible se debe tomar en cuenta
otros factores, como lo pueden ser la previa preparacin de los microorganismos ya que es
necesario que estos presenten cierto grado de contraste con el medio para poder ser visibles
en el microscopio. Este factor tiene una gran importancia debido a que los microorganismos
no presentan color, es por ello que deben ser tratados con procesos de tincin los cuales les
aportaran cierto como caracterstico de cada bacteria y as poder ser vistos.
Tincin simple: se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La
tincin puede ser uniforme o presentar algunos grnulos en su interior. Utiliza un solo
colorante (violeta de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).La tincin simple se utiliza
para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras
celulares bsicas. En las tinciones simples se usa un nico reactivo, que preferentemente es
de tipo bsico y contiene un cromgeno (compuesto que da color al tinte) con carga
positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que
atraen y enlazan el cromgeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas
las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin
simple mejora la observacin de la clula completa.
Tincin diferencial: son aquellas tinciones que se utilizan para diferenciar de manera mas
explicita a los microorganismos. En estas tinciones se utilizan los colorantes diferenciales,
que se componen de una sustancia tintrea. Algunas de estas tinciones son la tincin de
Gram, y tincin de acido resistente.

Tincin especifica: utilizada para observar las estructuras y aumentar el contraste de las
clulas microbianas, tales como: flagelos, capsula y endosporas.
Estos tipos de tinciones son utilizadas para la identificacin de microorganismos, basndose
en el tipo de color que estos puedan presentar.
La preparacin de microorganismos puede ser fija o teida para colonias cultivadas, de
donde son tomadas las muestras que se colocaran en el portaobjetos y as realizarse el
procedimiento correspondiente. Para la observacin de bacterias teidas

es necesario

primeramente realizar un frotis, para esto se debe tomar en cuenta si el medio de cultivo es
lquido o solido. En medio liquido se toma una o varias cargas con el asa y se colocan en el
portaobjetos. En caso de medio solido se debe poner previamente una gota de agua en el
portaobjetos, despues se toma con el asa una muestra de bacteria y se coloca en la gota de
agua haciendo con el asa cargada ondulaciones para dispersar.
Despus se debe fijar, esto provoca cambio en la composicin fisicoqumica de las
bacterias, ocasionando que la bacteria conserve una estructura lo mas similar a cuando se
encontraba viva. La fijacin es utilizada para adherir las bacterias al portaobjetos formando
una pared celular ms permeable para que impida el paso de colorantes, tambien impide el
arrastre de m.o.
Este procedimiento puede ser realizado pasando el portaobjetos rpidamente por la flama
de un mechero bunsen para que la bacteria no se incinere, esto se revisara poniendo el
portaobjetos en el dorso de tu mano para determinar que la temperatura de este no sea muy
elevada.Cabe mencionar que para la fijacin tambien se puede utilizar agentes qumicos
tales como: formol o etanol.

3.-MATERIAL

Portaobjetos
Mechero Bunsen
Asa de siembra
Cubeta de tincin o similar
Colorantes para tinciones: Cristal violeta, Lugol, Acohol-Acetona (1:1) y safranina.
Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

4.- CEPAS MICROBIANAS

Staphylococus aureus
Escherichia coli
Sacharomyces cerevisiae
Mohos que se encuentran disponibles

5.- METODOLOGIA
1.- Realizacin del frotis y la fijacin de los diferentes cultivos de bacterias: se proceder
tal y como se ha descrito anteriormente.
2.- Tinciones:
A) TINCIN SIMPLE Es la tincin en que se utiliza un solo colorante.
Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza
bsica. La tcnica es la siguiente:
I.
II.
III.
IV.

Hacer el frotis, secarlo y fijarlo

Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto.
Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante
Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100x)
empleando el aceite apropiado

Esta tcnica permite observar la morfologa y el tamao de las bacterias, asi como los tipos
de agrupaciones que forman.
B) TINCION DE GRAM es la tincin diferencial mas utilizada en bacteriologa pues
permite separar las bacterias en dos grupos, las Gram-positivas y las Gram-negativas. La
tincin de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El mas utilizado es el cristal violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las
clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, por
ejemplo, una solucin diluida de yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcohol-acetona (1:1).

4. Colorante contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante,

como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos
referamos

difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram

positivas se teirn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los
pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del cristal
violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina. La diferencia esta
determinada por la composicin de su envoltura celular. Las bacterias Gram positivas
poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las bacterias
Gram negativas, recubriendo en una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana
externa que envuelve toda la clula.
El mtodo de tincin es el siguiente:
1.
2.
3.
4.

Separar el frotis, se seca y se fija

Se cubre con cristal violeta durante un minuto
Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante
Sacudir un poco y sin dejar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. El

lugol acta como mordiente aumentando la afinidad del colorante por la bacteria.
5. Lavar con agua el exceso de lugol
6. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin deje de perder
color y se lava enseguida con agua abundante.
7. Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la safranina, durante 30
segundos.
8. Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el objetivo de
inmersin.
3.- Observacin de las tinciones de bacterias al microscopio
Las bacterias Gram-positivas presentarn una coloracin violeta mientras que las
Gram-negativas la presentaran roja o rosa. La identificacin de las bacterias Grampositivas puede ser problemtica, solamente cuando las bacterias Gram-positivas se
encuentren en crecimiento exponencial (cultivos jovenes) la reaccin es clara; en
fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden ser Gramnegativas.
6.-RESULTADOS

Las tinciones que se realizaron fueron de E.coli y de Cocos, y se observaron al

microscopio. Las formas y colores son iguales a las imgenes que se encuentran en internet.
Las siguientes imgenes fueron las observadas durante la realizacin de la practica.

Estreptococos tomada en el lab.

Estreptococos imagen de internet.

7.-CONCLUCINES
Se llego a la conclusin de que el procedimiento de tincin debi ser realizado
cuidadosamente debido a que si no es as el resultado ser errneo. Para esto es necesario
leer previamente el manual antes de realizacin el procedimiento tomando en cuenta los
consejos del profesor, cabe mencionar que para este procedimiento fue necesario tener a la
mano un cronometro para que se tomen los tiempos sealados en la practica con la mayor
exactitud posible. Este procedimiento defini que tipo de bacterias estn presentan los

medios de cultivo realizados con anterioridad, tales como: los e. cocos a los cuales se les
aplico la tincin de Gram para poderse observar en el microscopio estos, tomaron su color
caracterstico (violeta) debido a que son bacterias Gram-positivas en forma de racimos de
uva.
Tambin se observaron bacterias del tipo Gram-negativas tales como: escherichia coli,
aplicando el procedimiento de tincin simple. Es importante sealar que dependiendo del
tipo de bacteria que se desee observar en el microscopio, le corresponder su determinada
tincin.
8.- CUESTIONARIO
1. Realiza el esquema de la preparacin en fresco del moho observado.
2. realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla
3.Cules son los inconvenientes al realizar un frotis con gran carga microbiana?
Porque quedar un frotis grueso, la luz no pasar y no observaremos.
4. Cul es la finalidad de observar una muestra en fresco?
Para ver el organismo vivo.
5. Por qu se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?
Para tener una muestra uniforme bien extendida entre el cubreobjetos y el portaobjetos de
lo contrario no se lograra un buen enfoque y por consiguiente una buena observacin
6. Cul es el propsito de fijar los frotis?
poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio
de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.
7. Cmo afecta la edad del cultivo en la tcnica de Gram?
Se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram negativas
8.Por qu la tincin de Gram no se emplea para mohos?

Por que se tien con irregularidad, y la tincin de Gram es exclusiva para bacterias Gram
positivas y negativas.
9.Cundo es recomendable utilizar una tincin de simple y que colorante utilizaras?
Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto
que la mayor parte del material no celular no se tie. Se utiliza el azul de metileno.
10. Cul es la finalidad de utilizar el barniz de uas en las preparaciones en fresco?
Para que la preparacin dure mas y se sellen los bordes del cubreobjetos.
9.- BIBLIOGRAFIA
1.- Consultado en: http://es.scribd.com/doc/80998594/Tincion-Simple
2.- Consultado en: http://bactteriias.blogspot.mx/2010/04/tinciones-diferenciales_21.html