AISLAMIENTO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE

LA CELULOSA
1. OBJETIVO:
Aislar microorganismos degradadores de celulosa a partir de

residuos vegetales frescos y compost.

Identificar los microorganismos con actividad celuloltica a partir

de residuos vegetales frescos y compost.

2. MARCO TERICO:
La actividad biolgica de los suelos es la resultante de las funciones
fisiolgicas de los organismos y proporciona a las plantas superiores un
medio ambiente adecuado para su desarrollo. Pero la exigencia de los
microorganismos edficos en energa, elementos nutritivos, agua,
temperaturas adecuadas y ausencia de condiciones nocivas es similar a
la de las plantas cultivadas. Las investigaciones sobre celulasas y los
polisacridos relacionados con stas dio inicio activamente a principios
de los 50s, encaminadas a aprovechar su enorme potencial para
convertir lignocelulosa, la ms abundante y renovable fuente de energa
en la tierra a azcares solubles.
La celulosa uno de los componentes ms abundantes de la biomasa
vegetal, una serie de microorganismos son capaces de degradarla,
mediante la accin de varias enzimas no asociadas en complejos; como
en los hongos filamentosos y en algunos actinomicetos o formando un
complejo denominado "celulosoma", como en los clostridios y en
bacterias del rumen. Estas enzimas han sido ampliamente estudiadas en
hongos mesfilos, tales como Trichoderma reesei. El hongo Trichoderma
reesei (viride) es el mejor productor de celulasa extracelular, por lo que
la mayora de los estudios concernientes a la naturaleza, modo de
accin y aspectos en general de las celulasas han sido realizados
usando este microorganismo. Sin embargo, sus actividades hidrolticas
son afectadas por una serie de factores fsicos y qumicos que limitan su
aplicacin a nivel industrial. Por ello, existe la necesidad de aislar cepas
con mejores rendimientos en la cantidad de enzimas liberadas al medio
extracelular y que mantengan la calidad intrnseca de dichas enzimas,
adems que expresen una elevada estabilidad de su actividad a pH
extremos, solventes orgnicos, detergentes inicos y principalmente la

de mantener sus actividades enzimticas a elevadas temperaturas de

reaccin. Por esta razn, los microorganismos termfilos han sido
sugeridos como fuentes alternativas de celulasas por la termoestabilidad
de sus enzimas, propiedad ventajosa en aplicaciones industriales. Entre
las bacterias que se destacan tenemos algunas especies de los gneros
Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora y Thermobifida (exThermomonospora).

En

el

caso

de

los clostridios,

Clostridium

cellulovorans, hidroliza la celulasa en condiciones anaerbicas; en tanto

que las especies celulolticas de Streptomyces, Thermomonospora y
Thermobifida la degradan en un ambiente aerbico. Taxonmicamente
los gneros Streptomyces, Thermomonospora y Thermobifida se ubican
en el Orden Actinomicetales y son comnmente denominados
actinomicetos.
Enzimas involucradas en la degradacin de los polmeros celulosa:
Celulasas:
La hidrlisis completa de la celulosa a glucosa, requiere de la
accin

combinada

de

mltiples

especificidades de sustrato.
Las
endoglucanasas

enzimas

con

diferentes

(1,4--D-glucano-4-

glucanohidrolasas):
Actan al azar sobre los enlaces -1,4 glucosdicos y su
actividad parece estar dirigida principalmente sobre la
celulosa soluble altamente polimerizada como lo es la
carboximetilcelulosa (CMC) y su accin se caracteriza por
disminuir su viscosidad. Est enzima corta dentro de las
cadenas de celulosa principalmente a partir de las regiones
amorfas, proveyendo a las exoglucanasas ms extremos
para actuar.
Las celobiohidrolasas

exoglucanasas

(1,4--D-

glucano celobiohidrolasas):
Esta enzima cliva los extremos accesibles de la celulosa
para liberar unidades de celobiosa y glucosa de las
cadenas de polisacrido. La celulosa microcristalina es un
sustrato adecuado para su valoracin EXOGLUCANASA
ENDOGLUCANASA -GLUCOSIDASA por tener un bajo
grado de polimerizacin y una baja accesibilidad.

 -glucosidasas:
Hidrolizan la celobiosa soluble y otras celodextrinas con un
grado de polimerizacin mayor de 6 glucosas, que sirve
como una fuente de carbono fcilmente metabolizable para
diferentes microorganismos como hongos y bacterias.
3. MATERIALES:
Medio agar CMC 1%
COMPOSICIN
Carboximetilcelulosa
Extracto de levadura
Peptona
Sulfato de amonio
Cloruro de calcio
Fosfato monobsico de potasio
Fosfato dibsico de potasio
Agar
pH 7.0 +/-2

g/L
10
2.5
2.5
0.5
0.5
0.1
0.1
15

NaCl 0,1 M
Rojo de Congo 1%
Agua peptonada 0,1%
Muestra de compost y residuos vegetales frescos.
Balanza
Incubadora
Placas Petri
Tubos de ensayo
Pipetas
Asa de Drigalsky
Asa bacteriolgica
Laminas portaobjeto
Mechero
4. PROCEDIMIENTO:
Pesar 10 gramos de suelo.
En un matraz con 90 ml de agua peptonada, aadir la muestra

pesada, homogenizar.
Hacer diluciones en tubos con agua peptonada 10 1, 102, 103, 104 y

105.
En un matraz de 250 ml, aadir el carboximetilcelulosa con agua
caliente,

calentar

homogenizar

hasta

diluir

todo

el

carboximetilcelulosa.
En otro matraz diluir los componentes restantes del medio de
cultivo en la estufa.

Mezclar el carboximetilcelulosa con los componentes restantes

diluidos y aforar hasta 100 ml con agua destilada.

Homogenizar en calor y autoclavar.
Aadir el medio frio en 10 placas aproximadamente y dejar

gelificar.
En 4 placas con medio CMC 1% p/v, rotular con las diluciones

102, 103, 104 y 105.

Aadir 0.1 ml de cada dilucin y sembrar por extensin con la

ayuda del asa de Drigalsky.

Incubar a 30 C por 48 horas.
Observar colonias pequeas traslucidas rugosas.
Posteriormente, aadir 5 ml de rojo de congo al 1% y dejar

reposar por 15 minutos.

Decantar el exceso cuidadosamente y aadir 5 ml de NaCl al 0,1

M, dejar reposar por 15 minutos, decantar.

Observar los halos de degradacin de la celulosa, cuya

caracterstica es tener una coloracin amarillenta a traslucida.

Aislar las colonias que son degradadoras de celulosa y

sembrarlas en las placas restantes con el medio CMC 1% p/v.

Incubar por 48 horas a 30 C.
Hacer la tincin Gram para observar la morfologa microscpica.
5. RESULTADOS:

Medio CMC 1% p/v, las

colonias
se
observan
semitraslucidas con borde
rugoso y textura cremosa.

Observacin de los halos de

degradacin de la celulosa por
su hidrolisis. El rojo de congo
forma complejos con la
celulosa
no
hidrolizada
facilitando as la diferenciacin
de bacterias celulolticas de
las no celulolticas.

Observacin microscpica a
100 X, se observan las
bacterias de forma bacilar de
un tamao muy reducido
Gram negativos.

Estas bacterias hidrolizan la

celulosa para formas otros
compuestos
como
la
celobiosa que son degradados
por las endoglucanasas.

Agrupacin
de
bacterias
celulolticas gran negativas.