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Curso de Inmunologa General Laboratorio

Semestre 2015-I
EJERCICIO EXPERIMENTAL 5
Determinar la cantidad de C4 en el plasma humano.
Inmunodifusin Radial (RID). Tcnica de Mancini.
OBJETIVO
Cuantificar la protena C4 del complemento en una muestra de suero problema.
CMO?
Mediante el mtodo de inmunodifusin radial simple (RID) descrito por Manzini, Carbonara y
Hermans, que consiste en un gel de agar que contiene el antisuero especfico y el antgeno difunde
radialmente a partir de un orificio en la capa de agar de grueso uniforme con formacin de
precipitados de forma circular, cuya superficie es proporcional a la concentracin de antgeno.
MATERIAL

I caja petr de 60X100mm.


1 Micropipeta de 20 y 50 L.
1 nivelador.
1 mechero
1 tripie y tela de asbesto para mechero
1 bao de agua a 45 C (por grupo).
5 mL. de solucin de agar noble al 1.5 % en PBS.
1 mL. de solucin de agar noble al 0.3 % en PBS.

INTRODUCCIN
La Inmunodifusin radial o Mancini es un tipo de prueba que utiliza un soporte slido, compuesto
por diferentes sustancias siendo la ms comn el agar o la agarosa; en este gel existen una serie
de poros a travs de los cuales la sustancia que se coloca en ellos puede difundir libremente. Esta
tcnica se hace generalmente en una placa, caja petri o porta objeto; consiste en agregar una
determinada cantidad de agar al cual se le ha incorporado, generalmente, un anticuerpo contra lo
que se quiere medir, y colocarlo en alguno de los soportes anteriormente mencionados.
Una vez solidificado el agar con el anticuerpo se hacen orificios y en ellos se coloca el antgeno
que desea probarse. Despus de un periodo de 12, 24 o 48 hrs. de incubacin, dependiendo de lo
que se este midiendo, se forman halos de precipitacin alrededor del orificio, este fenmeno se
debe a la formacin de complejos antgeno-anticuerpo hasta llegar el momento de equivalencia en
el cual se produce el precipitado. El dimetro de la zona de precipitacin es directamente
proporcional a la concentracin del antgeno.
Esta tcnica puede considerarse como cuantitativa si se coloca un volumen medido con exactitud
tanto de un estndar cuando menos en tres diluciones de concentracin conocida, como de los
sueros problema.
Esta prueba se puede utilizar para aquellas sustancias que se encuentren en orden de mg/mL, el
anticuerpo incorporado determina la sensibilidad de la tcnica.
Este mtodo se aplica en inmunologa clnica para la cuantificacin de antgenos,
fundamentalmente de las fracciones plasmticas humanas, como son la albmina srica humana,
las inmunoglobulinas G, A y M, los componentes C3 y C4 del complemento, factores de
coagulacin, etc.

Curso de Inmunologa General Laboratorio


Semestre 2015-I
Esta tcnica se utiliza en el campo para identificar la existencia de diversos problemas que pueden
tener el ganado., por ejemplo para detectar Leucosis bovina, el virus causante de la lengua azul,
Neumona ovina progresiva y anemia equina infecciosa se utiliza bastante para saber con certeza
cuales vacas estn vacunadas con B. abortus S-19.
Las aplicaciones que puede tener la inmunodifusin radial son bastantes, ya que su fundamento y
realizacin son fciles de aplicar. Bsicamente, esta tcnica se puede aplicar a demasiados
antgenos y anticuerpos, siempre y cuando stos se puedan estar incorporados en el soporte
utilizado (gel de agarosa).
Por su utilidad se puede llevar a campo y a lugares en donde se requiera de una prueba rpida y
barata. Del qumico depende aplicar la imaginacin para aplicar esta tcnica en sus diferentes
retos y en nuevas aplicaciones que ayuden a un diagnostico seguro, rpido y barato.
METODOLOGA
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Prepara una solucin de agar noble al 1.5 % en amortiguador de fosfatos (PBS) pH 7.2.
Prepara una solucin de agar noble al 0.3 % en PBS, pH 7.2.
Fundir utilizando un bao de agua hirviendo.
Colocar el tubo con 5 mL. de solucin de agar al 1.5% en un bao de agua a 45 C,
mantener el tubo con gel a esa temperatura durante 15 min. (hasta que se estabilice)
Manteniendo el tubo dentro del bao de agua a 45 C, incorporar al gel de agar 50 L de
anticuerpos anti-C4 humano.
Tapar el tubo, sacarlo del bao y mezclar por inversin rpida, pero suavemente para
evitar que se forme espuma.
Verter el agar sobre la placa de plstico para RID. Sobre una superficie perfectamente
nivelada.
Homogenizar con movimientos de rotacin suaves y en seguida dejar solidificar sobre la
placa de vidrio perfectamente nivelada.
Realizar 5 horadaciones en el gel con un perforador de 4 mm. de dimetro interno.
Dejar solidificar a temperatura ambiente.
Depositar 10 L de solucin de agar al 0.3 % en cada horadacin para sellar la superficie.
Dejar solidificar a temperatura ambiente.
Depositar 25 L. de muestra o estndares en los pocillos designados a tal efecto.
Permitir que la muestra comience a difundir hacia en interior del agar.
Incubar en posicin horizontal el tiempo deseado (48-72 hrs)

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
La determinacin de la cantidad de C4 dentro de una muestra, se realiza de la siguiente manera:
Se realiza una curva estndar con concentraciones conocidas del antgeno, una vez obtenidos los
halos de precipitacin, se mide el dimetro de los mismos, de tal manera que se construye una
grfica con el valor de los dimetros al cuadrado contra la concentracin de los mismos; una vez
obtenida esta curva, se extrapola el cuadrado del dimetro de la muestra, y se obtiene la
concentracin de C4 en el suero humano problema.