PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
CURSO BACTERIOLOGA 001343
GUIA 5. IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS CURVOS:
FAMILIA VIBRIONACEAE Y CAMPYLOBACTERIACEAE
OBJETIVO GENERAL
Reconocer las caractersticas morfolgicas y metablicas de bacilos Gramnegativos curvos fermentadores y oxidasa positivos: FAMILIA
VIBRIONACEAE Y CAMPYLOBACTERACEAE
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Estudiar y aprender los procedimientos microbiolgicos para la identificacin de
bacilos gram-negativos curvos, fermentadores y oxidasa positivos: ejemplo
especfico Vibrio cholerae.
INTRODUCCIN
El nombre Vibrionaceae fue originalmente propuesto por Veron en 1965, con el intento
de agrupar un nmero de bacilos gram-negativos no entricos y fermentadores, oxidasa
positivos y mviles por medio de flagelos polares. Este agrupamiento, bsicamente fue
dirigido con el fin de diferenciar estos microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae.
La familia Vibrionaceae, de acuerdo a como est definida actualmente en el Manual
Bergeys de Bacterioloa Sistemtica, incluye los siguientes gneros: Vibrio (27
especies), Aeromonas (cuatro especies), Photobacterium ( tres especies) y Plesiomonas
(una especie). Sin embargo, en los ltimos 20 aos se ha recibido el apoyo de una
variedad de mtodos para el anlisis de cidos nucleicos que han revolucionado la
taxonomia microbiana y en consecuencia han conducido a la reeestructuracin de esta
familia con el establecimiento de dos nuevos gneros, Listonella y Shewanella, y una
nueva familia, Aeromonadaceae.
Las especies del gnero Vibrio han tenido y siguen tenido inters. Vibrio cholerae es el
agente etiolgico de clera asitico en humanos, una severa enfermedad diarreica que
ha afectado al hombre a travs de cientos de aos. Esta bacteria fue descrita por primera
vez y nominada por Pacini en 1854. Treinta y dos aos despus Robert Koch aisl el
organismo, que el denomin Kommabacillus debido a la caracterstica curvada o
apariencia en forma de coma de las clulas bacterianas en forma individual.
Desde la primera pandemia en 1816-1817, se han presentado otras seis a partir de 1889
con intervalos de cerca de 10 a 15 aos; la ultima ocurri en 1961 y envolvi a la cepa
El Tor. En 1989, se reportaron a la Organizacin Mundial de la Salud, 48.403 casos de
clera originados en 35 pases, que refleja la naturaleza amplia de diseminacin que
tuvo esta pandemia. La mayora de infecciones se han presentado despus de la
ingestin de alimentos de mar contaminados y muy pobremente cocinados.

Las cepas de V. Cholerae que han sido recuperadas de casos clsicos de pandemia de
clera aglutinan con el antisuero denominado 01. Las cepas que no aglutinan con este
antisuero son denominadas V. cholerae no 01. Las especies V. cholerae no 01 estn mas
comnmente asociadas con infecciones extraintestinales.
Las cepas de V. cholerae se pueden dividir de acuerdo a diferencias en la composicin
de la pared celular (antigeno somtico O), el cual es la base del esquema de
serotipificacin que clasifica los organismos en 139 serogrupos. Todas las cepas
comparten un antigno flagelar comn (H). Las cepas V. cholerae 01 se pueden separar
en uno de tres serogrupos: Inaba, Ogawa y Hikojima. Estos serogrupos son muy
importantes para estudios epidemiolgicos.
En Colombia, en 1991, se present la epidemia de clera causada por una cepa V.
cholerae 01 Serotipo Inaba, biotipo El Tor.
En los aislamientos iniciales, V. cholerae es un bacilo curvo en forma de coma, de 2 a 4
um de longitud. Presenta motilidad activa por medio de un flagelo polar. V. cholerae y la
mayor parte de otros vibriones crecen bien a 37 C sobre muchos medios de cultivo,
incluso medios definidos que contienen sales minerales y asparagina como fuentes de
carbono y nitrgeno. Crece bien sobre el medio TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa)
sobre el cual produce colonias de color amarillo. Tpicamente los vibriones crecen a pH
muy alto (8.5-9.5) y los cidos los destruyen con rapidez. V. Cholerae fermenta la
glucosa, la sacarosa, la manosa pero no la arabinosa. Una prueba oxidasa positiva es una
etapa clave en la identificacin preliminar de esta bacteria y otros vibriones. La mayor
parte de las especies de Vibrio son halotolerantes y con frecuencia el NaCl estimula su
crecimiento.
PROCEDIMIENTO A SEGUIR EN EL LABORATORIO (DIA 1)
1. Cada grupo de dos estudiantes recibir un cultivo en agar TCBS (tiosulfato
citrato bilis sacarosa) sembrado con un bacilo Gram-negativo curvo.
2. Observar las caractersticas de las colonias y realizar coloracin de Gram a partir
de una colonia aislada del medio de cultivo y observar la morfologa al
microscopio.
3. Realice la prueba de la cuerda. Con este fin coloque en una lmina de 3 a 5 gotas
de desoxicolato de sodio 0.5% y mezcle con una colonia aislada del medio
TCBS. Cuando las colonias de V. cholerae son mezcladas con desoxicolato de
sodio al 0.5% , y despus de 1 minuto se produce una suspensin viscosa que
puede verse como un collar de perlas cuando el asa redonda se levanta
lentamente de la lmina. Registre el resultado.
4. Realice la prueba de oxidasa. Con este fin tome la tira de oxidasa y con cuidado
ponga en contacto con una colonia del medio TCBS. Registre el resultado.
5. Sembrar el microorganismo en la prueba Glucosa OF, Sacarosa OF y Lactosa
OF, llevar a incubacin a 37 C y leer a las 48 horas (segundo da de la
practica).
6. De forma inmediata, sembrar un juego completo de pruebas (batera) con
colonias aisladas del medio TCBS. La batera de pruebas bioqumicas se
sembrarn en el siguiente y estricto orden: Citrato Simmons, Fenilalanina, TSI,
LIA, SIM, VP, RM, y caldo de nitratos. Tambin con colonias aisladas del medio
TCBS siembre las siguientes pruebas: Caldo Moeller con Arginina 1%, caldo

Moeller con lisina 1%, caldo Moeller con ornitina 1% y caldo Moeller sin
aminocido (control). Incubar todas las pruebas a 37C durante 18 24 horas y
leer las reacciones ocurridas en cada medio (segundo da de la practica).
7. Siembre por aislamiento las colonias del medio TCBS en agar nutritivo con
NaCl 3%. Tambin siembre la bacteria objeto de estudio en los siguientes
medios lquidos: caldo nutritivo sin NaCl, caldo nutritivo con NaCl 1%, caldo
nutritivo con NaCl 6%. Incube todos los medios a 37C durante 18 24 horas, e
informe el segundo da de la practica.
PROCEDIMIENTO A SEGUIR EN EL LABORATORIO (DIA 2).
RESULTADOS.
1. Realice la prueba de la cuerda. Con este fin coloque en una lmina de 3 a 5 gotas
de desoxicolato de sodio 0.5% y mezcle con una colonia aislada del medio agar
nutritivo NaCl 3%. Registre el resultado.
2. Realice la prueba de oxidasa. Con este fin tome la tira de oxidasa y con cuidado
ponga en contacto con una colonia del medio de cultivo Agar nutritivo NaCl 3%.
Registre el resultado.
2. El da 2 de la prctica de laboratorio, el estudiante debe leer todas las pruebas
realizadas con el fin de identificar el microorganismo objeto de estudio. El
informe de laboratorio se hace de acuerdo a las instrucciones dadas en el
documento INFORME DE LABORATORIO que esta colgado en nuestro
correo de g-mail. El estudiante esta en la obligacin de discutir los resultados
con los profesores del curso. Antes de finalizar la prctica los profesores deben
hacer una puesta en comn con el fin de mostrar todos los perfiles
microbiolgicos y bioqumicos encontrados en los microorganismos estudiados
en todo el grupo. Anote si hubo alguna reaccin atpica, o que no halla
funcionado y comntala en la puesta en comn.
AYUDAS PARA RECOGER LOS RESULTADOS Y HACER UNA MEJOR
INTERPRETACION DE LOS MISMOS
1. Lea las reacciones bioqumicas de los diferentes medios que se encuentran en los
tubos:
CARACTERSTICA BIOQUIMICA
PRUEBA DE LA CUERDA
PRUEBA DE LA OXIDASA
PRUEBA GLUCOSA OF
PRUEBA SACAROSA OF
PRUEBA LACTOSA OF
CALDO MOELLER CONTROL
CALDO MOELLER CON ARGININA
CALDO MOELLER CON LISINA
CALDO MOELLER CON ORNITINA
Crecimiento en caldo nutritivo sin NaCl
Crecimiento en caldo nutritivo NaCl 1%
Crecimiento en caldo nutritivo NaCl 6%

LECTURA

Crecimiento en Agar nutritivo NaCl 3%.

TSI
LIA
CITRATO DE SIMMONS
FENILALANINA DEAMINASA
PRODUCCIN DE INDOL
PRODUCCIN DE H2S
MOTILIDAD
VOGES PROSKAUER
ROJO DE METILO
PRUEBA DE NITRATOS
Microorganismo identificado:________________________________________

Diferenciacin por pruebas bioqumicas de tres especies de Vibrio aisladas

con mayor frecuencia
Prueba
Oxidasa
Nitratos
H2S
Movilidad
Glucosa
Sacarosa
Arabinosa
Descarb. Lisina
Descarb. Ornitina
Dihidrolasa Arginina
Indol
Rojo de Metilo
+: Positivo,

V. cholerae
+
+
+
A
A
+
+
+
+

-: Negativo,

V. alginoyiticus
+
+
+
A
A
+
V+
V

V: variable,

V.cincinnatiensis
+
+
+
A
A
A
+
+

V+: Variable casi siempre positivo

ACTIVIDADES QUE EL ESTUDIANTE DEBE CUMPLIR ANTES DE LA

REALIZACIN DE LA PRCTICA

Investigue que es la prueba de la cuerda. Como se hace? Como se interpreta ?

Para que es til ?
Que es un microorganismo halfilo? Que es un microorganismo halotolerante?
Cuales son los componentes del medio TCBS. Cual es el fundamento del medio.
Como se ven las colonias de V. cholerae ?
Cual es la utilidad del agua peptonada en la recupeacin de V. cholerae a partir
de muestras clnicas. A que concentracin se utiliza y que pH debe tener ?
Investigue y aprende el fundamento de las pruebas: Citrato Simmons,
fenilalanina, TSI, LIA, SIM, urea, VP, RM, nitratos y fermentacin de glucosa,
sacarosa y lactosa, hidrlisis de la arginina, lisina y ornitina. Que reactivos debe
agregar a las pruebas para hacer la debida lectura de los resultados.