Vet Clin Small Anim 37 (2007) 373-392

CLNICAS VETERINARIAS
MEDICINA DE PEQUEOS ANIMALES

Diagnstico fngico: tcnicas actuales

y tendencias futuras
Sharon M. Dial, DVM, PhD
Department of Veterinary Science and Microbiology, Arizona Veterinary Diagnostic Laboratory,
University of Arizona, 2831 North Freeway, Tucson, AZ 85705, USA

as infecciones fngicas son los grandes imitadores en la medicina humana y veterinaria. Los agentes fngicos que originan enfermedad clnica pueden afectar a cualquier rgano y presentar un amplio espectro de signos clnicos y clinicopatolgicos.
Como en cualquier enfermedad, para la identificacin de la enfermedad fngica es necesario
haber incluido al agente etiolgico en el diagnstico diferencial inicial. El reto no acaba aqu;
si se sospecha enfermedad fngica, se limitan mediante la historia clnica las opciones de
diagnstico definitivo. Los mtodos tradicionales de diagnstico de las diferentes micosis se
basan en la deteccin de una respuesta serolgica a un agente, la identificacin del agente en
las muestras citolgicas o histopatolgicas, o en el cultivo del organismo causante. La interpretacin de cualquier prueba serolgica fngica no es directa; las pruebas disponibles tienen
sensibilidad y especificidad diferentes. Por el contrario, la especificidad de la citologa, la
histopatologa y los cultivos se aproxima al 100%, segn la experiencia del patlogo y del
laboratorio, mientras que la sensibilidad es baja debido a la gran variabilidad en el nmero de
organismos dentro de las lesiones.
Los mtodos tradicionales para el diagnstico de enfermedad fngica han sido tiles en
la medicina humana y veterinaria durante dcadas. Sin embargo, con los avances de los
mtodos de biologa molecular para la deteccin de ADN y ARN especficos de especie en
las muestras clnicas, los mtodos tradicionales se complementan con tcnicas moleculares
nuevas. Ha tenido lugar la transicin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) que
se basa en la ampliacin y secuenciacin del ADN fngico desde el laboratorio de investigacin al laboratorio diagnstico, y son pocos los laboratorios veterinarios que ofrecen
pruebas basadas en la PCR con o sin secuenciacin. Los mtodos histolgicos ordinarios se
han potenciado con el desarrollo de tcnicas de tincin inmunohistoqumica especfica que
permiten la identificacin de especies en tejidos incluidos en parafina y fijados con formalina. Estas tcnicas no sustituirn a los mtodos tradicionales en un futuro cercano, y probablemente nunca. Deberan mejorar la capacidad de identificacin de un tipo de agentes
que, a menudo, es difcil. La necesidad de identificar especies de hongos miceliales puede
conducir al desarrollo de tratamientos antifngicos ms dirigidos a las especies y ms innovadores. Un abordaje global del diagnstico de la enfermedad fngica que relacione los sig-

Direccin electrnica: sdial@u.arizona.edu

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nos clnicos con la exploracin fsica, la patologa clnica y los hallazgos histopatolgicos
con la serologa, el cultivo y las tcnicas moleculares e inmunohistoqumicas ms innovadoras, cuando estn disponibles, es el mejor mtodo para optimizar la identificacin del
agente subyacente.

PRESENTACIN CLNICA
Los agentes fngicos tienen un repertorio extremadamente variado de signos clnicos: enfermedad drmica primaria, masas subcutneas nicas o mltiples, masas en las cavidades corporales, enfermedad diseminada con disfuncin orgnica mltiple, y enfermedad diseminada que
se presenta con la disfuncin de un solo rgano o como causa de muerte sbita. La coccidioidomicosis, por ejemplo, puede presentarse con cualquiera de los cuadros descritos anteriormente. La coccidioidomicosis que afecta al corazn y al pericardio en el perro puede ser el
evento final de la enfermedad diseminada, originando el colapso sbito y la muerte sin previos
signos de enfermedad [1]. La enfermedad fngica puede clasificarse en patgenos primarios
(Blastotmyces, Histoplasma, Coccidioides, Cryptococcus) y patgenos oportunistas (Aspergillus, Cladosporium, Conidiobolus, Basidiobolus). Los patgenos oportunistas incluyen un gran
nmero de hongos saprfitos del suelo, que pueden originar enfermedad cuando se introducen
en los tejidos por traumatismo local. Tienen una tendencia mnima a la enfermedad diseminada. Cuando aparece la diseminacin de los patgenos oportunistas, se asocia con frecuencia con
una disminucin de la inmunocompetencia.
Existe cierto grado de presentacin tpica de varios agentes fngicos: la coccidioidomicosis, la histoplasmosis y la blastomicosis son patgenos principalmente pulmonares. La histoplasmosis tambin se asocia al tracto gastrointestinal, mientras que este sistema raramente se
afecta en la coccidioidomicosis o la blastomicosis. Por el contrario, Coccidioides spp se diseminan con mayor frecuencia en el hueso. Conocer las presentaciones frecuentes de cada uno de
los agentes fngicos primarios los coloca en primera lnea del diagnstico diferencial. Conocer
la capacidad de dichos agentes infecciosos para imitar muchas enfermedades hace que el clnico siempre los tenga en mente, y se incline por ellos cuando existe una respuesta inadecuada al
tratamiento en un caso difcil.
PATOLOGA CLNICA
Debido a la gran variedad de rganos que pueden afectarse en la enfermedad fngica diseminada, no existen cambios qumicos sricos o en sangre perifrica tpicos asociados a
cualquier agente fngico. La evidencia de una inflamacin crnica, como la leucocitosis con
una monocitosis importante o una hipergammaglobulinemia policlonal con protenas inflamatorias aumentadas con o sin hipoalbuminemia, apoyara la sospecha de enfermedad fngica. Debido a la naturaleza crnica de la mayora de las infecciones fngicas, no es habitual una desviacin hacia la izquierda importante de los neutrofilos. Sin embargo, existen
cambios inespecficos que pueden observarse en mltiples lesiones inflamatorias. La eosinofilia perifrica no es un hallazgo frecuente en la enfermedad fngica, aunque los eosinfilos son un componente importante de la respuesta inflamatoria tisular a los elementos fngicos. La anemia de enfermedad crnica es frecuente en cualquier enfermedad inflamatoria
crnica, as como la hipoalbuminemia leve. La hipercalcemia se ha asociado con la enfermedad granulomatosa en medicina humana y veterinaria, con una asociacin especfica a la
histoplasmosis [2,3], criptococosis [6,7], neumocistosis [8,10], candidiasis [11] y cocci-

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dioidomicosis [6,12-14]. El mecanismo de hipercalcemia se debe a un aumento de la

1,25-dihidroxivitamina D circulante en varios casos en humanos, y se asocia ms a menudo
con un proceso inflamatorio granulomatoso que con el organismo en s [7,15]. En los humanos, se observa tambin hipercalcemia importante en la sarcoidosis, beriliosis y tuberculosis [16]. Los macrfagos en estas lesiones interfieren con la regulacin normal de la
1,25-dihidroxivitamina D; la hipercalcemia se resuelve cuando disminuye la respuesta inflamatoria granulomatosa [16].
La citologa es una de las tcnicas de patologa clnica ms tiles para la identificacin
de la enfermedad fngica. Las caractersticas citolgicas de la mayora de los patgenos fngicos se describen bien en varios libros de texto de veterinaria [17,18], y no se repetirn en
este artculo. La exploracin citolgica de los lquidos corporales, masas de la piel y tejido
subcutneo y aspirados de rganos internos, lquidos del lavado transtraqueal o broncoalveolar, orina y heces, pueden originar el diagnstico definitivo de enfermedad fngica si el
organismo fngico existe en cantidades suficientes en los tejidos (figs. 1 y 2). La orina y las
heces se ignoran a menudo como muestras citolgicas. Se pueden encontrar Histoplasma
capsulatum, Prototheca zopfii, y Cryptococcus neoformans [19] en citologas fecales, si
existe afectacin gastrointestinal en la enfermedad diseminada o como patgeno gastrointestinal primario. Se han identificado Aspergillus spp [20] y Candida spp [21] en la citologa o
en el cultivo de orina en casos de enfermedad diseminada o enfermedad urinaria primaria. Aunque la especificidad de estas tcnicas es alta, la sensibilidad vara considerablemente.
La ventaja principal de la citologa es su facilidad y rapidez. El conocimiento de los antecedentes individuales del portaobjetos es la principal variable de la citologa en el contexto
clnico. Se requiere una buena calidad de tincin citolgica. Las tinciones de Wright Giemsa y
de Wright Giemsa modificada tien correctamente la mayora de los organismos fngicos en
las preparaciones citolgicas. Existen pocas excepciones, como los oomicetos (nicos patgenos similares a los hongos) Pythium y Lagenidium, que tienen una afinidad baja para la

Fig. 1. Aspirado pulmonar de un gato. Existen numerosos macrfagos epitelioides grandes y

neutrfilos no degenerativos. Los macrfagos contienen hongos pequeos de 1 a 2 m, que se
sealan con las flechas (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 3400). (Esta figura se
encuentra en color al final del libro)

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Fig. 2. Ampliacin mayor de un macrfago que ilustra el aspecto citolgico caracterstico de

Histoplasma capsulatum. Los hongos tienen un ncleo basfilo denso y un halo claro o seudocpsula (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 31.000). (Esta figura se encuentra
en color al final del libro)

mayora de las tinciones citolgicas e histolgicas. Los organismos que no se tien bien aparecen como elementos no teidos que se pasan por alto fcilmente (fig. 3). Se recomienda la
tinta India para la identificacin de criptococos, ya que muestra la cpsula de mucina de este
organismo. En la prctica, las proteinceas y las clulas inflamatorias que le rodean son normalmente muy tiles para demostrar la cpsula, y tienen una menor tendencia al artefacto

Fig. 3. Aspirado de una masa torcica de un perro. La flecha seala micelias con tincin negativa en una clula gigante multinucleada (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original
31.000). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

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(fig. 4). Adems, la falta de cpsula no descarta Cryptococcus spp, ya que existen cepas
acapsulares que pueden dificultar la diferenciacin de Candida spp [22]. Cuando se examina la preparacin citolgica, es importante saber que a veces los hongos pueden presentarse con morfologa atpica. Las esfrulas de Coccidioides pueden confundirse fcilmente con
blastomicosis si son pequeas y estn muy unidas (fig. 5). Adems, raramente, slo las
endosporas de las esfrulas rotas pueden existir y fcilmente ignorarse o confundirse con
otros agentes [23]. La figura 6 ilustra un caso de coccidioidomicosis con esfrulas pequeas
raras y grandes cantidades de endosporas libres, algunas de las cuales pueden confundirse
con agentes como Prototheca spp. Como muchas de las infecciones fngicas profundas tienen distribuciones regionales, la historia de los recorridos realizados puede ser especialmente importante al valorar presentaciones atpicas de estas enfermedades.
En muchos casos, el aspecto ms til de una preparacin citolgica es la identificacin
de la respuesta inflamatoria tpica a los agentes fngicos; inflamacin granulomatosa a piogranulomatosa con o sin eosinfilos, mastocitos, clulas gigantes multinucleadas, y fibrocitos reactivos (fig. 7). La enfermedad fngica debe sospecharse enormemente cuando se
identifique este tipo de respuesta inflamatoria, se observe o no el agente etiolgico. Como
pueden producirse infecciones mixtas, fngicas y bacterianas, las lesiones inflamatorias
spticas que no responden a tratamiento mdico adecuado deben investigarse ms a fondo
para descartar la enfermedad mictica subyacente. En los seres humanos, el 25% de las neumonas bacterianas que no responden son efectivamente fngicas, con enfermedad bacteriana secundaria [24]. La identificacin de un agente bacteriano no descarta el agente fngico. Esto es particularmente cierto en la cavidad nasal, en la que la enfermedad fngica
primaria se asocia a menudo con infeccin bacteriana secundaria. En el caso de los hongos
miceliales, como Aspergillus spp, las caractersticas citolgicas no pueden identificar defi-

Fig. 4. Aspirado de un ndulo subcutneo de un gato. La gran cpsula clara de Cryptococcus

neoformans queda bien definida por los eritrocitos adyacentes. Obsrvese el citoplasma basfilo con un ncleo excntricamente colocado que aparece clsicamente en este organismo (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 31.000). (Esta figura se encuentra en color al final
del libro)

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Fig. 5. Aspirado de una lesin cutnea supurativa de un perro. Dos esfrulas pequeas de Coccidioides spp (flecha) muy prximas pueden imitar fcilmente a las formas del hongo Blastomyces dermatitidis. Se observaron esfrulas grandes y raras, y endosporas libres, en toda la
preparacin para ayudar a identificar el organismo como Coccidioides spp. (Recuadro)
B. dermatitides (punta de flecha) (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 3400). (Esta
figura se encuentra en color al final del libro)

Fig. 6. Aspirado de una lesin cutnea supurativa de un perro (misma muestra que en la
fig. 5). En este pequeo agregado de Coccidioides spp, las endosporas con septos prominentes entre las endosporas individuales recuerdan un Prototheca zopfii (punta de flecha). sta fue
la forma predominante del organismo observada en la preparacin. Slo se encontraron algunas esfrulas al examinar con detalle todas las muestras derivadas. (Recuadros) P. zopfii (flechas) (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 31.000). (Esta figura se encuentra en
color al final del libro)

nitivamente las especies, y el cultivo es necesario para su identificacin final. La caracterizacin morfolgica de los hongos que crecen en el tejido puede ser muy diferente de la morfologa de los hongos cuando crecen en un medio fngico. Estructuras como las clamidos-

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Fig. 7. Aspirado pulmonar de un perro. Inflamacin piogranulomatosa con clulas gigantes

multinucleadas (flecha) y agregados de fibroblastos (punta de flecha) caractersticos de la respuesta inflamatoria de muchas lesiones fngicas. Se cultiv Coccidioides spp de lquido pleurtico enviado con este aspirado (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 3200). (Esta
figura se encuentra en color al final del libro)

poras (fig. 8) se forman con frecuencia en tejidos por varios agentes fngicos, pero no se
forman fcilmente en el cultivo.

HISTOPATOLOGA
El diagnstico histolgico de la enfermedad fngica comparte la misma especificidad y sensibilidad que las preparaciones citolgicas. As, la sensibilidad depende en gran medida de la

Fig. 8. Raspado corneal de un caballo. La flecha seala la inflamacin terminal tipo chlamydoconidium al final de un micelio septal. Estas estructuras pueden ser abundantes o infrecuentes, segn la especie fngica, y, posiblemente, segn factores del husped que influyen en el
crecimiento fngico en los tejidos (tincin de Wright Giemsa, ampliacin original 31.000).
(Esta figura se encuentra en color al final del libro)

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cifra de organismos que existe en el tejido derivado. La figura 9 ilustra una esfrula nica de
Coccidioides spp encontrada en uno de los 10 cortes de una biopsia sea. El corte original valorado por el patlogo tena una lesin inflamatoria tpica de osteomielitis coccidioidal que provoc la obtencin de los dems cortes para buscar el organismo. El tamao de la muestra suele
ser el factor determinante para proporcionar el diagnstico histolgico. Como con la citologa,
aunque no se identifiquen agentes etiolgicos en las tinciones ordinarias, las caractersticas de
la respuesta inflamatoria requieren a menudo la aplicacin de tinciones especiales que ayuden
a encontrar a los agentes fngicos presentes en pequeas cantidades. El empleo ordinario de las
tinciones de cido-Schiff (PAS) y plata-metenamina de Gomori (GMS) confirman con frecuencia la sospecha de enfermedad fngica. Con los hongos dimrficos, como Coccidioides
spp, el aspecto histolgico de la fase tisular habitualmente permite la identificacin de las especies. Esto no ocurre con los agentes fngicos miceliales. Aunque existen detalles que pueden
ayudar a clasificar el agente fngico identificado dentro de grandes grupos de hongos
(Zygomycetes, Hyalohyphomycetes y Phaeohyphomycetes), no existen caractersticas histolgicas diagnsticas de ningn patgeno micelial. Una excepcin a la regla puede ser la tendencia de Aspergillus niger a formar cristales de oxalato en el tejido perifrico (fig. 10) [25]. Los
dos oomicetos patognicos Pythium insidiosum y Lagenidium spp no pueden diferenciarse
fcilmente de Zygomycetes en el tejido, y son difciles de aislar en el cultivo [26]. Los patgenos fngicos se describen segn su pigmentacin (hongos dematiceos), grado de tabicacin y
amplitud y grado de paralelismo del micelio. Con estas caractersticas, el patlogo puede proporcionar
una
lista de posibles agentes etiolgicos. Aunque son infrecuentes, las infecciones dobles con dos
patgenos fngicos pueden producirse. La figura 11 ilustra una infeccin simultnea en
un perro con Coccidioides spp y hongo dematiceo. El perro tuvo un diagnstico ante mrtem de coccidioidomicosis, pero no respondi al tratamiento antifngico. Como con la identificacin citolgica de los agentes fngicos, suele ser necesario el cultivo para realizar la
identificacin final.

Fig. 9. Biopsia sea de una lesin ltica y proliferativa en el fmur distal de un perro. Existe
un gran foco de inflamacin piogranulomatosa con una nica esfrula de Coccidioides spp
sealada por la flecha (tincin de hematoxilina-eosina, ampliacin del original 3 40).
(Recuadro) Mayor ampliacin de la esfrula (tincin de hematoxilina-eosina, ampliacin original 3400). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

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Fig. 10. Biopsia nasal de un perro. Existen abundantes cristales birrefringentes de oxalato clcico junto con una gran alfombra fngica adherida al tejido del cornete nasal. El cultivo fngico
origin un importante crecimiento de Aspergillus niger (tincin de hematoxilina-eosina bajo luz
polarizada, ampliacin original 3100). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

Fig. 11. Tejido tisular de un perro. Abundantes esfrulas viables (punta de flecha) y vacas (asterisco) de Coccidioides spp, y dos granulomas pequeos bien definidos (esquina inferior derecha) (tincin de hematoxilina-eosina, ampliacin del original 3100). (Recuadro A) Ampliacin
mayor del granuloma que contiene hifas fngicas pigmentadas (dematiceo) (tincin de hematoxilina-eosina, ampliacin del original 3400). (Recuadro B) Tincin GMS que muestra ambos
tipos de hongos (negro) en el tejido esplnico (ampliacin original 3100). (Esta figura se
encuentra en color al final del libro)

SEROLOGA
El empleo de la serologa en el diagnstico de la enfermedad fngica reta los conocimientos del
clnico para la interpretacin de los datos de laboratorio. El primer paso para comprender la

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serologa es estar seguro de la metodologa y de sus limitaciones, como la sensibilidad y

la especificidad de las pruebas individuales. Un conocimiento firme de estos factores es necesario para emplear la serologa en su mxima capacidad. Ello es particularmente cierto en la serologa fngica, ya que cada prueba serolgica para cada agente tiene sus problemas. La dificultad para determinar la verdadera sensibilidad de una prueba serolgica para una enfermedad
fngica es evidente por la falta de referencias que pueden proporcionar dichos datos, segn
ensayos epidemiolgicos veterinarios amplios. Se han publicado datos de sensibilidad y especificidad de las pruebas serolgicas frente a blastomicosis [27], histoplasmosis [28] y criptococosis [29]. La especificidad de las pruebas serolgicas fngicas puede valorarse ms fcilmente en el contexto clnico y de laboratorio. La tabla 1 enumera las pruebas serolgicas
actualmente disponibles para varios agentes fngicos y sus caractersticas. La mayora de las
pruebas serolgicas fngicas actualmente en uso en medicina veterinaria detectan la respuesta
humoral (anticuerpo) a la exposicin. Por el contrario, las pruebas que detectan los antgenos
fngicos pueden proporcionar un diagnstico definitivo si la prueba del antgeno es lo suficientemente especfica. La prueba de la aglutinacin en ltex basada en antgeno disponible
para C. neoformans es la prueba serolgica fngica basada en antgeno ms empleada. Se han
desarrollado los inmunoensayos unidos a enzima (EIA) para la antigenemia o antigenuria en el
diagnstico de histoplasmosis [30] y aspergilosis [31] en seres humanos, y para el diagnstico
de blastomicosis [32] en perros. Como con cualquier prueba serolgica, se debe valorar la reactividad cruzada, ya que muchos agentes fngicos comparten antgenos estructurales. La prueba
EIA para H. capsulatum puede tener una reaccin cruzada con varios agentes fngicos, como
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Penicillium
marneffei [33]. Actualmente, las puebas basadas en antgenos estn disponibles para C. neoformans, B. dermatitidis y Aspergillosis spp [18].
Con las puebas serolgicas basadas en anticuerpos, la sobreinterpretacin es un problema
importante. Los ttulos persistentes tras la exposicin con la eliminacin del agente son factores de confusin para el diagnstico preciso de blastomicosis y coccidioidomicosis. Pocas
pruebas serolgicas proporcionan un diagnstico definitivo. La serologa positiva debe considerarse evidencia de exposicin que apoya los hallazgos clnicos. Las muestras de suero
emparejado (2-3 semanas de diferencia) deben analizarse simultneamente. Un aumento o
descenso de cuatro veces el ttulo es una gran evidencia de enfermedad activa. Es importante destacar que las muestras emparejadas deben analizarse a la vez, debido a la variabilidad
interensayo de las puebas serolgicas. Esto requiere guardar una parte de la muestra de suero
inicial para derivarlo con una segunda muestra. La excepcin puede ser la prueba de ELISA
para pitiosis. Al emplear un valor positivo del 40% en comparacin con el suero de control
positivo analizado simultneamente con el suero del paciente, Grooters et al [34] demostraron una sensibilidad y una especificidad del 100% de esta prueba al comparar muestras de
perros clnicamente sanos, perros infectados por P. insidiosum, perros con enfermedad fngica no pitium y protozoica, y perros sin enfermedad gastrointestinal infecciosa. Adems,
esta prueba serolgica puede emplearse para el seguimiento posquirrgico, originando la reagudizacin de la enfermedad ttulos sricos en aumento.
Una nica prueba serolgica puede conducir a error a la hora de diferenciar la enfermedad
fngica de otras enfermedades inflamatorias y neoplsicas en zonas con enfermedades fngicas endmicas. En un estudio serolgico reciente de Coccidioides spp en el Suroeste de
Estados Unidos se encontraron ttulos de 1:16 en la inmunodifusin en gel agar positiva

Negativo
precozmente,
ttulos persistentes
confunden su
interpretacin

Negativo en
algunos casos
diseminados,
datos insuficientes
para el valor
predictivo de los
ttulos, los ttulos
persistentes
confunden la
interpretacin

Desconocida/
> 95%
Mnima

90%/90% [27]

Mnima

AGID

AGID

Coccidioides

AGID: inmunodifusin gel agar; CSF: lquido cerebroespinal.

Problemas

Metodologa
principal
Sensibilidad/
especificidad
Reactividad
cruzada

Blastomyces

Tabla 1
Pruebas serolgicas disponibles para determinados agentes fngicos

Mnimos, la prueba
puede realizarse en
suero, orina o CSF,
y puede emplearse
para continuar el
tratamiento

Aglutinacin en ltex
del antgeno
90-100%/97-100%
[29]
Mnima

Cryptococcus

Mnima

Mnima

Mnima, los titulos

pueden emplearse
para el seguimiento
del tratamiento

100%/100%

Desconocida

Escasa sensibilidad y
especificidad [28]
Blastomicosis,
peniciliosis,
coccidioidomicosis
Numerosos falsos
negativos,
especialmente en
el estadio precoz
de la enfermedad

Falsos negativos
frecuentes

ELISA

Pythium

AGID

Aspergillus

AGID

Histoplasma

DIAGNSTICO FNGICO: TCNICAS ACTUALES Y FUTURAS

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SHARON M. DIAL

(AGID) en perros clnicamente normales [35]. Los ttulos de fijacin del complemento se han
empleado en el pasado para la serologa frente a Coccidioides spp. Por desgracia, hasta el
25% de las muestras de suero canino son anticomplementarias y no pueden titularse con este
mtodo. Como resultado, la mayora de los laboratorios con serologa de Coccidioides spp
emplean la prueba AGID.
Como con todas las puebas diagnsticas, la historia, los hallazgos de la exploracin fsica y
los resultados de pruebas diagnsticas son fundamentales para la interpretacin de una serologa positiva o negativa. La escasa especificidad de las pruebas serolgicas disponibles frente a
histoplasmosis niega esencialmente el valor de la serologa en esta enfermedad. El uso incrementado de agentes inmunosupresores para el tratamiento de la neoplasia y de la enfermedad
autoinmunitaria origina un gran campo frtil para el aumento de la enfermedad fngica en los
animales de compaa. Esto es evidente en medicina humana, y puede ocurrir tambin en medicina veterinaria [36]. En estos pacientes, un sistema inmunitario que no responda puede conducir a enfermedad seronegativa.

CULTIVO
El patrn oro para la identificacin especfica de la enfermedad fngica es el cultivo del organismo sospechado en lquidos o en tejidos. Adems, la sensibilidad es el aspecto principal que
depende slo del cultivo para el diagnstico. La sensibilidad para el cultivo de H. capsulatum
en la histoplasmosis pulmonar en los humanos vara del 15 al 85% segn el tipo de enfermedad
(enfermedad aguda frente a enfermedad crnica) [37]. La probabilidad de un cultivo con xito
de agentes fngicos depende de varias variables: la concentracin de los hongos en la muestra,
la integridad de la muestra, las necesidades del cultivo del agente fngico, y la experiencia del
laboratorio que realiza el cultivo.
El primer paso y el ms importante es la obtencin y derivacin de la muestra adecuada
para el cultivo. Al proporcionar al laboratorio una historia detallada, una fuente precisa, y el
diagnstico clnico, se puede contribuir enormemente al xito del cultivo y a la identificacin
del agente fngico. Aunque se emplean a menudo culturettes para el envo, las muestras para
el cultivo bacteriano y fngico no son el mtodo de eleccin de la mayora de los laboratorios
de microbiologa. Las muestras de lquidos corporales, orina y exudados pueden enviarse en
tubos de suero estriles (tapn rojo) y concentrarlos en el laboratorio para facilitar el cultivo
de los agentes. Se recomienda hasta 10 ml de lquido. La orina se ignora a menudo como
muestra para la identificacin de la enfermedad fngica diseminada. Se han recuperado elementos de Cryptococcus y Aspergillus en muestras de orina de perros con enfermedad diseminada [20,21,38]. Si la lesin es una masa, se debe derivar tejido fresco drmico, subcutneo, o interno en un contenedor estril para el cultivo. Es til derivar tejido fijado en
formalina para la histopatologa simultnea. Muchas especies fngicas crecen muy lentamente; la identificacin del organismo en cortes histolgicos justifica a menudo la retencin
de cultivos durante largos perodos de tiempo o provoca el empleo de medios enriquecidos
para facilitar la identificacin del agente. P. insidiosum, un oomiceto, es difcil de distinguir
de Zygomycetes en los cortes tisulares, y requiere un manejo especfico para disminuir el
efecto del sobrecrecimiento bacteriano sobre la viabilidad y crecimiento del organismo [39].
Se debe advertir al laboratorio de la posibilidad de infeccin con este agente, lo cual facilitar su crecimiento e identificacin.
La identificacin de agentes fngicos en los cultivos requiere paciencia. Los cultivos

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deben madurar y formar cuerpos fructferos, conidios y artrosporas caractersticos, para permitir la identificacin morfolgica del hongo. Para algunas especies fngicas, se necesitan
los medios especficos para promover la produccin de un estadio asexual y su morfologa
caracterstica. Adems, ciertas especies de hongos son tan parecidas que se han estudiado
las caractersticas de crecimiento en diferentes medios para la identificacin definitiva de las
especies [40].
La fase tisular de la mayora de los hongos patgenos supone poco riesgo para los pacientes
con enfermedad activa. La excepcin es el hongo saproftico Sporothrix schenckii, un agente de
enfermedad zoontica que puede transmitirse a los individuos que manejan al paciente si no se
toman las medidas de precaucin adecuadas. Por el contrario, una vez que se ha aislado el agente en los medios microbiolgicos y ha formado esporas o conidias, existe una gran posibilidad
de inhalacin por parte del personal de laboratorio. Se recomienda que el cultivo fngico se deje
slo para el laboratorio diagnstico (todos excepto las dermatofitosis). Todos los cultivos fngicos de la Arizona University se sellan para limitar la exposicin del personal de laboratorio a
las partculas potencialmente infecciosas. Los cultivos se abren expresamente para su examen
en una campana de biocontencin, ya que es fcil la aerosolizacin de las esporas cuando se
abren las lminas de cultivo. El hongo se trata con formalina antes de la evaluacin microscpica. La identificacin de las estructuras fngicas es similar a la de la citologa; el conocimiento individual se desarrolla a travs de la experiencia. Todos estos factores aconsejan confiar el
aislamiento fngico y la identificacin a un miclogo con experiencia, en vez de crear un laboratorio de micologa dentro de la propia clnica.

INMUNOHISTOQUMICA
En la ltima dcada, la inmunohistoqumica (IHC) se ha convertido en un mtodo ordinario para la deteccin e identificacin de agentes infecciosos en tejidos de biopsia y necropsia en medicina veterinaria. La mayora de los agentes identificados con este mtodo son
bacterias, virus y protozoos. Existe un mayor nmero de laboratorios diagnsticos veterinarios que ofrecen la IHC como mtodo para determinados organismos fngicos en los
tejidos derivados para histopatologa ordinaria. Actualmente, los laboratorios diagnsticos
de la Michigan State University y de la Kansas State University ofrecen pruebas IHC
para enfermedades fngicas, como aspergilosis, blastomicosis, histoplasmosis, coccidioidomicosis y candidiasis. Aunque los informes de la literatura veterinaria son escasos, dado
que cada vez ms laboratorios desarrollan IHC como parte de su oferta diagnstica ordinaria, su utilidad se ha documentado mejor. As, se ha documentado la IHC para la deteccin
e identificacin de pseudomicetoma atribuible a Microsporum canis [41] y pitiosis equina
[42] y canina [43].
El principio de la IHC es similar al de ELISA indirecta en los cortes tisulares. La sensibilidad y la especificidad de la tincin con IHC depende, en gran medida, de los anticuerpos
primarios dirigidos contra el antgeno objetivo. Los anticuerpos individuales varan de
forma importante en afinidad por el antgeno, y tienen diferentes niveles de reactividad cruzada para antgenos asociados o similares. Los laboratorios individuales deben estandarizar
y validar todas las tinciones IHC. La American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians Subcommittee on Immunohistochemistry ha desarrollado unas guas para la
estandarizacin de la IHC. Aunque se puede emplear la IHC como nica prueba, en la mayora de casos, la IHC y la histopatologa normal deben valorarse en pareja para proporcionar

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ms informacin.
Como con todas las pruebas diagnsticas, la integridad de la muestra es esencial para el
diagnstico. Un factor que puede afectar a la tincin IHC es el tiempo que el tejido ha estado en
formalina. Una unin cruzada de protena antignica con formalina interfiere con la identificacin del antgeno por parte del anticuerpo primario en el proceso de la IHC. Un amplio intervalo de tiempo de exposicin a formalina origina interferencias significativas con las interacciones individuales anticuerpo-antgeno. Si se han mantenido los tejidos en formalina antes de
derivarse para la valoracin histopatolgica, el tiempo en formalina debe incluirse en la historia. En la mayora de los laboratorios de referencia, los tejidos se procesan en 24 horas tras recibir la muestra.
Existen muchas variables que deben definirse en el marco del laboratorio para cada tincin de IHC, como el tipo de corte tisular previo al tratamiento que puede ser necesario para
potenciar la afinidad del anticuerpo primario por el antgeno, el tiempo de incubacin del
anticuerpo primario, y el sistema de deteccin empleado. Estos problemas, como la tincin
inespecfica o una tincin excesiva, pueden dificultar la interpretacin de las tinciones de
IHC. Un buen ejemplo de la reactividad cruzan entre los anticuerpos y los agentes infecciosos es el anticuerpo policlonal del bacilo Calmette-Gurin (BCG) frente al componente de
la pared celular de Mycobacterium bovis. Este anticuerpo es altamente reactivo frente a
varios agentes infecciosos bacterianos y no bacterianos, como B. dermatitidis, Coccidioides
spp, Cryptococcus spp, H. capsulatum, Malassezia spp, Sporothrix spp, Pythium spp, Prototheca spp, dermatofitos, y Phaeohyphomycetes [44,45]. El anticuerpo del BCG puede ser
til para identificar los hongos que no se tien bien con las tinciones tradicionales, como
GMS o PAS (fig. 12), y como tincin estudio para las lesiones que pueden contener varios

Fig. 12. Masa gstrica de un perro. Micela de amplitud variada de Pythium insidiosum
(marrn) teida con anticuerpo BCG policlonal anti-Mycobacterium bovis. El perro era serolgicamete positivo por el mtodo ELISA, y los cortes de la masa tambin se tieron positivamente
para P. insidiosum con IHC (anti-M. bovis de conejo policlonal, 1:1.000; sustrato de diaminobenzidina [DAB], Dako [Carpinteria, CA]; contratincin de hematoxilina, ampliacin original
31.000). (Esta figura se encuentra en color al final del libro)

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agentes etiolgicos.
Una ventaja principal de la IHC sobre el cultivo y las tecnologas puramente moleculares es
la identificacin visual del organismo en el contexto del tejido enfermo. La interpretacin del
cultivo sin la visualizacin histolgica de los elementos fngicos en los tejidos es difcil cuando estn involucrados agentes oportunistas, ya que estos agentes pueden ser contaminantes. La
valoracin histolgica puede proporcionar simplemente un contexto inflamatorio que indique
la posibilidad de enfermedad fngica. Ocurre lo mismo con los mtodos moleculares. Encontrar ADN de Aspergillus en un raspado corneal es una evidencia mucho ms fuerte de queratitis fngica cuando existe una evidencia histolgica o citolgica de inflamacin tpica asociada
a enfermedad fngica. Una web de Internet excelente para revisar el nmero de laboratorios que
ofrecen actualmente IHC para el diagnstico de enfermedades infecciosas es la base de datos
de IHC desarrollada y mantenida por el laboratorio diagnstico de la South Dakota State University [46].

TCNICAS MOLECULARES
Cada vez ms clnicos en medicina humana y veterinaria consideran las pruebas diagnsticas
basadas en PCR como ordinarias. Para la mayora, el desarrollo de tcnicas moleculares en
medicina veterinaria se ha centrado en la enfermedad bacteriana y vrica. Sin embargo, en la
literatura veterinaria y humana existe un mayor nmero de comunicaciones sobre el empleo de
estas pruebas en organismos ms complejos, como protozoos u hongos. Puede accederse al
boom de tcnicas diagnsticas mediante PCR a travs de Internet, en la web del laboratorio de
diagnstico por IHC de la South Dakota State University [47]. Actualmente, estn disponibles
pruebas especficas para Candida spp y Blastomyces spp y una prueba de PCR panfngica
para las pruebas diagnsticas. Las tcnicas para el diagnstico molecular fngico se han empleado principalmente para los patgenos de las plantas [48]. Las principales ventajas de los
mtodos moleculares basados en PCR son la sensibilidad, el desarrollo de tcnicas innovadoras con PCR a tiempo real, y la velocidad. El principal inconveniente es el control de calidad de
la prueba diagnstica.
El empleo de pruebas moleculares en el contexto mdico humano est siendo sometida
a examen para desarrollar un mtodo adecuado de control de calidad y estandarizacin
de mtodos [48-50]. La sensibilidad de estas tcnicas, la contaminacin de las muestras y
la comunicacin posterior de falsos positivos son los principales inconvenientes dentro
del contexto del laboratorio; son necesarias prcticas de laboratorio estndar cuidadosas para garantizar resultados precisos. Adems, cuando se comparan las muestras biolgicas con cultivos puros pueden contener sustancias inhibitorias que pueden originar falsos
negativos [48,51]. Los primers especficos empleados en PCR pueden ser menos que
especficos, con una ampliacin de ADN que no es el ADN diana, originando resultados
difciles de interpretar.
Por otra parte, el continuo desarrollo de protocolos estandarizados y probados para la identificacin de patgenos fngicos puede progresar, adems de la necesidad del clnico de un
diagnstico ms exacto. El desarrollo de un protocolo de PCR para cualquier agente es un proceso de tres pasos: 1) primers de diseo para identificar el segmento diana de ADN especfico
del agente; 2) optimizacin del ADN total de la muestra biolgica, y 3) determinar las condiciones ptimas para la ampliacin del ADN diana por los primers.
Existen varios abordajes para optimizar el resultado. La seleccin de un ADN diana con

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mltiples copias en el genoma puede potenciar la sensibilidad. Anidar una reaccin mediante dos procesos de ampliacin empleando primers universales cuyo objetivo es un tipo de
organismo, es otra posibilidad. En los diagnsticos fngicos, los primers universales son las
zonas del ADN ribosmico del espaciador transcrito interno altamente conservado (ITS) que
limita ms genes ribosmicos especficos de especie: 25S, 18S y 5.8S. Empleando dos de las
cinco zonas de ITS conocidas como reaccin inicial, los primers ms especficos para los
genes ribosmicos 18S o 5.8S pueden anidarse para proporcionar la especificidad necesaria. Por otro lado, la ampliacin inicial del producto originada por el empleo de primers
ITS puede secuenciarse y compararse con las bases de datos genmicas disponibles. Se ha
descrito la deteccin de Aspergillus fumigatus [52], C. neoformans [53], Pythium y Lagenidium [54], y H. capsulatum [55] en muestras clnicas con el gen de ADN ribosmico 18S o
las zonas ITS.
Es importante saber que la identificacin mediante la secuenciacin con ADN del gen 18S
o ITS no siempre es definitiva. La capacidad de identificar un organismo fngico depende de
que el ADN del hongo en cuestin se haya secuenciado previamente y derivado a las bases
de datos genmicas. Millar et al [56] comunicaron el posible error de identificacin de un
cultivo fngico desconocido como C. immitis cuando la identificacin se basaba slo en la
secuencia de ADN 18S. Este error se produca porque la secuencia de ADN de 18S para
Chrysosporium keratinophilum no estaba disponible en la base de datos genmica, y estos
dos hongos eran idnticos en la secuencia de la zona de 18S en un 99,4%. La secuencia para
el ADN 5.8S era ms especfica; la muestra clnica tena una identidad en la secuencia del
100% en la secuencia de ADN 5.8S publicada de C. keratinophilum y slo del 84,7% en la
secuencia del ADN 5.8S publicada para C. immitis. Este caso sugiere que la identificacin
fngica basada en la secuenciacin de ADN debera incluir la comparacin de, por lo menos,
dos zonas de ADN.
A diferencia de la identificacin de los agentes fngicos en los tejidos, los mtodos basados
en PCR se emplean habitualmente para confirmar la identificacin de los hongos en el cultivo.
Debido al riesgo del personal de laboratorio al manejar los cultivos tras haber formado las
estructuras asexuales especficas morfolgicamente, se han desarrollado sondas de ADN que
pueden emplearse en cultivos inmaduros para identificar el agente fngico. Las sondas de ADN
son segmentos de ADN marcados, complementarios, y de una sola cadena, especficos para una
nica zona de ADN fngico, normalmente el gen de ARN ribosmico. El principio de la prueba es parecido al de la prueba de ELISA. La sonda de ADN marcada y de nica cadena se
emplea en el lugar del anticuerpo marcado y se alinea con el ADN complementario, si existe,
en la muestra que se analiza. Gen-Probe (SanDiego, CA) ha desarrollado equipos de identificacin fngica para Blastomyces, Coccidioides e Histoplasma empleando sondas de ADN marcadas con quimioluminiscencia. Estos equipos que emplean sondas de ADN pueden tener un
mayor empleo futuro en laboratorios microbiolgicos que identifiquen ordinariamente patgenos fngicos.
La tecnologa de microarray emplea la PCR a fondo. Hay tcnicas de microarray en
los que las sondas especficas de ADN de varios agentes infecciosos se fijan a pequeas
zonas en una fase slida, como un portaobjetos de cristal, y as las muestras clnicas pueden analizarse para varios organismos simultneamente. Esta tcnica se ha desarrollado
para el anlisis de antgenos bacterianos [57] y vricos [58] en nuestras clnicas en seres
humanos. Actualmente, la tcnica de microarray en micologa se ha centrado en el examen

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del genoma de determinados patgenos para la identificacin de genes relacionados con la

patogenicidad [59] y determinacin de la expresin gnica durante las fases de crecimiento saproftico y parasitario [60]. A medida que se conoce mejor el genoma de los patgenos
fngicos, el desarrollo de sondas especficas de especie debe facilitar que la tcnica de microarray se emplee tambin para la deteccin de enfermedad mictica en muestras
clnicas.

RESUMEN
El diagnstico de la enfermedad fngica es un reto que requiere una especial atencin a la historia y los signos clnicos, adems de una capacidad astuta para interpretar los datos de laboratorio. Dado que la enfermedad fngica puede imitar otras enfermedades infecciosas y neoplsicas en su presentacin clnica, el clnico debe conocer las enfermedades fngicas habituales
en su regin, adems de las de otras zonas del pas. Los mtodos tradicionales para la identificacin del patgeno fngico mediante citologa, histopatologa, el cultivo y el empleo de la
serologa para confirmar la exposicin a determinados agentes han servido al veterinario durante dcadas, y deberan seguir siendo tiles durante muchas ms. Sin embargo, existen nuevas
tcnicas que proporcionan mtodos adicionales para identificar patgenos fngicos determinados en muestras en las que los mtodos tradicionales fracasaban. La IHC puede ayudar cuando
no existe tejido fresco para el cultivo, y las tcnicas de PCR pueden ser tiles para la identificacin de agentes en muestras con escaso nmero de organismos. Con el continuo desarrollo de
tcnicas moleculares, nuevos mtodos, como el microarray, permiten la direccin de varios
agentes de infecciosos en muestras clnicas, y puede que esto sea en un futuro tan habitual como
los mtodos tradicionales. Sin embargo, todos los resultados de las pruebas diagnsticas deben
interpretarse en el contexto del paciente.
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