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UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE INGENIERA
PROGRAMA INGENIERA DE ALIMENTOS
Asignatura
Tema
:

:
Biotecnologa
Fermentaciones
GUA DE LABORATORIO
CULTIVO DE LEVADURAS

1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
Aplicar conceptos bsicos de microbiologa industrial en la produccin de
levaduras a partir de un cultivo puro, mediante tcnicas que permitan
medir la cantidad de biomasa producida.
1.2 Objetivos Especficos

Analizar el comportamiento de las curvas de crecimiento variando un


componente del medio de cultivo (la fuente de carbono) durante el
proceso de fermentacin
Realizar una fermentacin aerbica para la produccin de levaduras
utilizando como sustrato un medio complejo como la melaza.
Identificar las diferentes variables que intervienen en el crecimiento
de la levadura.
Utilizar varios montajes para el desarrollo de la fermentacin.
Comparar el crecimiento de levadura en dependencia del tipo de
rgimen temporal de la fermentacin.
Analizar el comportamiento de las curvas de crecimiento de biomasa
mediante modelamiento matemtico.

2. INTRODUCCIN
Las levaduras son organismos heterotrficos que pueden usar azcares
y una variedad de compuestos orgnicos como fuente de nutrientes. Son
hongos unicelulares no filamentosos, de forma ovoide o esfrica y que
se reproducen por gemacin o por fisin.
El caldo de cultivo de las levaduras debe contener todos los nutrientes
necesarios para su desarrollo. Por ejemplo, para el crecimiento de la
levadura ms utilizada industrialmente, la Saccharomyces cerevisiae, se

empleaba predominantemente el trigo. Despus de la Primera Guerra


Mundial se empez a utilizar casi exclusivamente las melazas (de
remolacha y caa) que son ms apropiadas y econmicas. Las melazas
pueden cubrir las necesidades de las levaduras en carbohidratos y
tambin en gran parte las de nitrgeno, sales minerales y vitaminas. A la
melaza se le aaden sustancias nitrogenadas y fosforadas como
amonaco, sulfato o fosfato de amonio y, en ciertos casos, vitaminas
como la biotina.
Dependiendo de la cantidad de biomasa que se requiera, se escoge el
medio ms adecuado y as mismo el mtodo que sea ms til, ya que
para impedir la formacin de alcohol etlico se debe adicionar suficiente
oxgeno.
La levadura en la industria de alimentos e sutilizada para la elaboracin
de diferentes productos como pan, vino, quesos y vinagre.
3. MARCO TERICO
Las levaduras son organismos vivos que producen enzimas, las cuales
provocan cambios bioqumicos importantes en productos orgnicos
naturales. Son capaces de transformar los azcares en alcohol y dixido
de carbono. Se multiplican por gemacin o estrangulamiento cada tres
horas.
Las principales enzimas de las levaduras y sus funciones son:
Invertasa: Hidroliza el azcar de caa (sacarosa), el cual no puede ser
fermentado directamente por la levadura, en una mezcla de glucosa
y fructosa (conocida como azcar invertido), los cuales son ms
fcilmente asimilados.
Maltasa: Convierte el almidn, la malta y la maltosa en glucosa.
Zimasa: Esta enzima es de hecho la enzima fermentadora especfica
en al levadura. Ataca el azcar invertido y la glucosa que haban sido
previamente producidas por la accin de la invertasa y la maltasa,
transformndolas en dixido de carbono y en pequeas cantidades de
alcohol. Conjuntamente hace producir cantidades muy pequeas de
glicerol, cido succnico y rastros de alcoholes de ms alto peso
molecular, as como otras sustancias que mejoran el sabor del pan.
Enzimas proteolticas. A esta clase de enzimas se les atribuye el
poder de convertir protenas insolubles en compuestos nitrogenados
solubles.
Para obtener mayores rendimientos en la produccin de biomasa es
necesario propiciarle un medio ptimo para su desarrollo y reproduccin,

es por esto que se debe tener en cuenta las necesidades de carbono


como los azcares complejos o simples, de azufre las cuales se
satisfacen por la disponibilidad de sulfatos, de nitrgeno que puede ser
de fuentes orgnicas e inorgnicas y de vitaminas. Otros minerales
necesarios para su desarrollo son el potasio, el magnesio, el sodio, el
calcio y trazas de cobre, zinc, manganeso, hierro, yodo y molibdeno. El
rango de temperatura ptimo oscila entre 20 y 30C y su pH puede estar
entre 3,5 y 3,8.
Las levaduras se encuentran ampliamente difundidas en la naturaleza.
La mayora de ellas son saprfitas, algunas otras son parsitas que
producen enfermedades en personas, animales o plantas. Pueden vivir
en lugares ridos o en aquellos que tienen gran vegetacin y en medios
acuticos. Estos microorganismos resultan perjudiciales para los
alimentos cidos y de baja actividad acuosa en los cuales crecen con
mayor rapidez que las bacterias, causando grandes prdidas para el
productor o comerciante de frutas frescas, carnes, jugos, vegetales,
quesos, productos derivados de los cereales, encurtidos, alimentos
congelados y deshidratados cuyo almacenamiento se realiza en
condiciones inadecuadas.
En la mayora de los casos, el crecimiento en masa de las levaduras no
resulta apropiado para identificar estos microorganismos debido a que
cuando se desarrollan en medios de cultivo adecuados, las colonias de
levadura varan de aspecto, textura y margen. As algunas son lisas,
otras rugosas y otras son aplanadas, tienen bordes bien definidos o
irregulares. Las colonias jvenes tienen consistencia al de una pasta
hmeda y viscosa, la cual con el tiempo se vuelve ms espesa y seca. El
tipo de desarrollo en caldo nutritivo tambin proporciona informacin
significativa acerca del tipo de levadura. Algunas colonias se desarrollan
en la superficie de medios lquidos con crecimiento en forma de velo, de
pelcula o de espuma, y por ello se denominan levaduras oxidativas
formadoras de pelcula.
A escala industrial es muy empleada la levadura Saccharomyces
cerevisiae, cuyas clulas son propagadas en fermentadores grandes, los
cuales se llenan con levadura madre, con sustancias para el control del
proceso y con una solucin nutritiva (melaza), la cual al mismo tiempo
sirve como fuente de energa y de carbono, este ltimo esencial para la
estructura celular. Para combatir la fermentacin alcohlica y obtener a
su vez un crecimiento rpido de la levadura, se necesitan grandes
volmenes de oxgeno.
Las melazas son los jarabes residuales crudos obtenidos en la
produccin de azcar de caa o de remolacha. Es el licor madre que

queda cuando los compuestos orgnicos que no son azcares han


incrementado cercad de un tercio los slidos totales del jarabe.
La levadura cultivada se prepara en los laboratorios a fin de obtenerla
pura, de manera que slo contenga los mejores y los ms aptos
microorganismos. Se entiende por levadura seca a aquella cultivada y
separada del lquido nutritivo y sometido a prensado para quitarle el
exceso de humedad.
La levadura es ampliamente utilizada en la Industria de Alimentos. En
los productos de panadera produce la fermentacin de la masa inerte y
pesada a una masa porosa, ligera y elstica que al ser horneada es
apetitosa, fcilmente digerible y altamente nutritiva. En la fabricacin de
vinos son los agentes vivos que producen la fermentacin de los
azcares, del tipo de las hexosas, que se encuentran en el jugo (mosto)
de las uvas. Las levaduras tambin participan en la produccin de ron,
que es una bebida que se destila con jugo de caa de azcar
fermentado o con melazas. En la elaboracin de whisky, el mosto
obtenido a partir de malta de cebada, se enfra antes de agregar la
levadura y se deja fermentar de dos a tres das. Las levaduras juegan un
papel muy importante en la elaboracin de cerveza, que se prepara por
fermentacin de una solucin de carbohidratos a una temperatura
aproximada de 15C y se obtiene principalmente de cereales. Estos
verstiles microorganismos participan en la produccin de otros licores
como el shandy, la cidra, el perry y en la fabricacin de vinagre.
La temperatura ideal para el almacenamiento de la levadura es de 0 a
3C. No se debe almacenar junto con carne o productos lcteos, ya que
algunas bacterias de estos alimentos pueden atacar las clulas de las
levaduras debilitndolas.
Durante la fermentacin, se le debe proporcionar a la levadura un
ambiente ptimo para su desarrollo y crecimiento, controlando variables
como la temperatura, el pH, la aireacin, la agitacin, la cantidad de
sustrato, entre otras ms. Igualmente importante es escoger el tipo de
rgimen temporal de la fermentacin, ya que de ste depender la
cantidad de biomasa que se produzca.
El tipo de rgimen temporal ms sencillo que se utiliza para el cultivo de
levadura corresponde a la fermentacin por lotes (batch). En este tipo
de fermentacin, todos los nutrientes se agregan al biorreactor, el cual
permanece cerrado hasta el final del cultivo, con la excepcin de la
entrada y salida del aire necesario para la oxigenacin del medio.
Conforme se van dando las etapas de crecimiento, los microorganismos
van consumiendo las reservas de sustrato disponibles en el medio de

cultivo hasta que stas se agotan, los microorganismos entran en la fase


estacionaria y de muerte y la fermentacin se da por terminada.
Este tipo de fermentacin presenta el inconveniente de que las
cantidades de biomasa obtenidas no son las mximas posibles debido al
fenmeno de represin catablica. Para evitar que esto suceda, el
cultivo de levadura se puede llevar a cabo en un rgimen de lotes
alimentados (fed-batch). En este tipo de operacin, la alimentacin de
nutrientes se realiza de manera intermitente o continua con el fin de
controlar la concentracin de sustrato en el caldo de cultivo. De esta
manera se logra alargar la fase exponencial de produccin de biomasa y
as aumentar la cantidad de la misma que se puede obtener durante
cada operacin del biorreactor. El proceso de produccin comienza
como si fuera un cultivo por lotes convencional; cuando el sustrato
limitante del crecimiento ha sido consumido, se agrega de nuevo al
caldo permitiendo un crecimiento mayor de biomasa. El suministro de
sustrato se puede repetir
varias veces, o se puede agregar
continuamente al caldo una corriente de alimentacin de sustrato, sin
retirar lquido del biorreactor, el cual debe disponer de espacio libre para
la adicin del medio de cultivo fresco.
Los cultivos de alimentacin intermitente se utilizan ampliamente en la
produccin de levadura de panificacin para superar la represin
catablica y para controlar la demanda de oxgeno. Tambin se utiliza de
forma rutinaria en la produccin de penicilina.
4. CULTIVO POR LOTES DE LEVADURA EN UN MEDIO COMPLEJO
Para el cultivo de levaduras a nivel industrial se utilizan medios
complejos. En calidad de medio de cultivo complejo se utiliza melaza de
caa de azcar, la cual se complementa con sustancias que sirvan como
fuente de nitrgeno, fsforo y hierro. El medio resultante tiene la
composicin que se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Composicin de un medio de cultivo complejo para lel cultivo de
levadura.
Componentes
Melaza
Solucin de FeCl3 al 10%
Fosfato trisdico
rea
Agua destilada c.s.p

Cantidad
80 g
1,5 ml
1,0 g
1,5 g
500 ml

4.1 Materiales y Equipos


Beaker de 1000 mL
Erlenmeyer de 1000 mL
2 erlenmeyers de 250 mL
Picnmetro
Embudo
Termmetro
Refractmetro
Centrfuga
pH-metro
4.2 Reactivos e Insumos

Placa cern
Agitador de vidrio
Gasa
Algodn
Mechero de gas
Biorreactor
Incubadora
orbital

de

agitacin

Melaza*
Levadura Comercial
Solucin de cloruro frrico al 10%
Fosfato trisdico
rea
cido clorhdrico diluido (aproximadamente al 3,5%)

4.3 Montaje
Se usar el Erlenmeyer de 1000 ml como Biorreactor de laboratorio, se
acondicionar un tapn microbiolgico para evitar contaminacin y se
incubarn a 30 C en una incubadora de agitacin orbital.
Biorreactor opcional:
Se utilizar un montaje de biorreactor de laboratorio de entre 1 y 3 L.
Para ello se emplearn frascos de los volmenes indicados con tapas
metlicas que cierren hermticamente. Se acondicionar un sistema de
aireacin que constar de una bomba de acuario con la cual se pretende
adicionar el suficiente aire para el desarrollo del proceso de cultivo de
levadura. El aire se conducir al biorreactor por un sistema de
mangueras. Se debe disponer de una vlvula de paso a la entrada del
biorreactor para controlar el flujo de aire entrante. De la bibliografa
disponible se debe definir cul debe ser el dimetro de los orificios de la
rejilla de burbujeo del sistema de aireacin.
Como uno de los objetivos del biorreactor es poder obtener fcilmente
muestras cuyo volumen oscile entre los 40-50 mL, se debe acondicionar
una jeringa con capacidad de 50 ml, para que por succin se obtengan
las distintas muestras. Igualmente se deben ubicar pinzas de presin
que estrangulen la manguera por donde se succionan las muestras
durante el tiempo en que stas no se tomen.
6

La tapa del biorreactor debe tener varios orificios que permitan la


entrada y salida de gases, la toma de muestras y la disposicin del
sistema de agitacin (en caso de necesidad). En la Fig. 1 se muestra
una vista superior del biorreactor. Completar el esquema del biorreactor
con su vista frontal y rotular la grfica como Fig. 2.
El sistema de agitacin consta de un motor de 12 voltios con el cual se
garantizar la buena homogenizacin del caldo de cultivo en el
biorreactor durante el proceso de fermentacin.
Sistema de
Aireacin

Sistema de

Tapn

Agitacin

Toma de
Muestras

Tapn

Fig. 1. Vista superior del biorreactor utilizado para el cultivo de levadura.


4.4 Procedimiento

Pesar 80 g de melaza (150-160 g/l de solucin a preparar).


Disolver en 500 ml de agua.
Adicionar los complementos nutricionales (fosfato trisdico, rea y
cloruro frrico) de acuerdo a las cantidades indicadas en la Tabla 1.
Ajustar el pH de la solucin anterior aproximadamente a un valor de
4,0. Para tal fin, utilizar la solucin de cido clorhdrico.
Esterilizar el mosto as obtenido por calentamiento hasta cerca de la
temperatura de ebullicin durante 15 minutos. Dejar enfriar el mosto
a temperatura ambiente. Si se llega a producir sedimentacin de
slidos suspendidos, filtrar el lquido. Tomar los grados Brix del mosto.
Enfriar hasta 37C y tomar 150 ml, adicionar la levadura en una
cantidad del 10-20% referida al peso de las melazas adicionadas y
agitar hasta que se disuelva completamente. Esta nueva solucin
recibe el nombre de levadura activada.
Adicionar la levadura activada a la miel diluida y acidificada restante.

Introducir el volumen de medio de cultivo (aproximadamente 500 mL)


al Biorreactor, el cual deber estar
previamente lavado y
desinfectado.
Se recomienda que el sistema de aireacin del
biorreactor (En caso de usar biorreactor aireado) sea puesto en
marcha antes de introducir el caldo de cultivo, debido a que con esto
se evita la inundacin de las mangueras que transportan el aire. En el
momento de poner en marca la fermentacin se debe hacer uso de la
vlvula de paso con la cual se puede graduar el flujo de aire.
Tapar el biorreactor y disponer los tapones microbiolgicos (ver Fig.
1). Dejar encendido el sistema de aireacin durante 48 horas.
Despus de las primeras cuatro horas de cultivo, tomar una muestra
de 10 mL en forma asptica utilizando el sistema de toma de
muestras. Se debe agitar vigorosamente el contenido del biorreactor
a fin de homogenizar el medio lquido y poder tomar as muestras
representativas. Luego centrifugar la muestra por 5 minutos
aproximadamente (6000 6500 rpm) hasta que se observe la
separacin de biomasa del medio, sacar el sobrendate y determinar
la concentracin de azcares por el mtodo de fenol sulfrico (anexo
1), aforar la biomasa en el fondo al volumen inicial con agua
destilada, llevarla a una celda para espectrofotmetro de 1 cm y
determinar la Absorbancia a 640 nm usando como blanco agua
destilada, determinar la concentracin de biomasa segn la curva de
calibracin preparada con soluciones de concentracin conocida de
levadura. En el caso que la absorbancia de las muestras no se
encuentre dentro del rango de linealidad de la curva de calibracin,
se recomienda realizar una dilucin 1/10 de las mismas.
Si no se cuenta con el espectrofotmetro, se puede medir la
concentracin de biomasa, resuspendiendo el pellet de levadura en
agua, llevarlo a una cpsula de porcelana y secar hasta peso
constante y calcular el parmetro como peso seco.
Determinar la concentracin de la biomasa obtenida en los intervalos
de tiempo elegidos, garantizando un nmero representativo de
lecturas (mnimo 10). Anotar los resultados obtenidos en la Tabla 2.

4.5. Resultados
Consignar en la Tabla 2 los datos correspondientes a las concentraciones
de biomasa y a los valores de grados Brix durante la marcha de la
fermentacin. Se recomienda tomar muestras cada cuatro horas. En
caso de no ser posible tomar las muestras cada cuatro horas, justificar la
disminucin en el nmero de muestras durante las 48 horas de
fermentacin.

En la segunda columna de la Tabla 2 se relacionan los pesos de biomasa


seca obtenidos despus de secar completamente hasta peso constante
el papel filtro luego de la centrifugacin de la muestra.
Las tablas deben ser llenadas a mano directamente en la presente gua
de laboratorio, y no en hojas aparte.
Construir la curva de la cintica de formacin de biomasa en funcin del
tiempo, indicando las fases de crecimiento celular. Anexar a esta gua la
grfica obtenida marcndola como Figura 3.
Tabla 2. Seguimiento de la fermentacin para la obtencin de levadura a
partir de un medio complejo basado en melaza.
Tiempo (h)

4h

Absorbancia de las muestras

Concentracin celular
(g/L en peso seco)

Concentracin de
azcares g/L del caldo
de fermentacin

4.6. Anlisis de Resultados


4.1.
4.2.

Explique las formas de reproduccin de las levaduras.


Relacione en la Tabla 3 la composicin promedio de la melaza de
caa.
Tabla 3. Composicin promedio de la melaza de caa.
Componente

Concentracin
(%)

4.3.

Qu funcin cumplen en el medio de cultivo cada uno de los


complementos nutricionales?
4.4. Por qu es importante acidificar la melaza? Por qu los valores
de pH no deben ser menores a 4,0?
4.5. Qu transformaciones ocurren durante la esterilizacin del
mosto? Cmo afectan estas transformaciones la calidad del
medio y la capacidad de crecimiento de las levaduras?
4.6. Con base en la Figura 3, indique los tiempos en los cuales se
verifica cada una de las fases de crecimiento de la levadura.
4.7. Argumente qu tipo de fermentacin present el cultivo de
levadura. Confronte con la teora y d posibles explicaciones si no
hay coincidencia con la prctica.
4.8. Si se considera a los erlenmeyers como biorreactores, clasifique el
sistema de fermentacin de acuerdo a los siguientes criterios: por
fase, por rgimen temporal y por suministro de energa.
4.9. Proponga un modelo matemtico que describa el comportamiento
del cultivo de levadura.
4.10. La eficiencia del proceso se puede expresar de acuerdo a la
siguiente ecuacin:
= (cantidad de producto formado / cantidad de materia prima
utilizada) * 100%
Calcule la eficiencia del proceso con base en la cantidad inicial
de azcar empleada en el medio de cultivo.
5. MODELAMIENTO DE LA CINTICA DE FERMENTACIN
La ecuacin logstica es un modelo sencillo que se ajusta muy bien al
comportamiento de cultivos de microorganismos en medios lquidos.
Considerando lo anterior, se modelarn los datos obtenidos en el cultivo
de levadura utilizando este modelo.
5.1. Requerimientos
Para esta parte del laboratorio se requiere un computador con el
software MS Excel, el cual puede llevar a cabo la mayor parte de los
clculos. Es posible hacer las grficas manualmente, pero es necesario

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como mnimo disponer de una calculadora cientfica que realice clculos


de regresin lineal.
5.2. Procedimiento

Tomar como punto de partida los datos de la Figura 3. Trazar una


curva suave que describa el comportamiento de los datos
experimentales, o bien, introducir los valores en una hoja de Excel,
graficar los datos de biomasa vs. tiempo, ajustar la curva con una
regresin polinomial, introducir la ecuacin del polinomio obtenido en
otra columna de la hoja electrnica y graficar de nuevo contra el
tiempo, obteniendo no ya puntos aislados sino una curva suavizada.
Diferenciar grficamente la curva suavizada con el fin de obtener una
aproximacin de las velocidades de formacin de biomasa (dX/dt).
Para ello se asumir que los datos de la quinta columna de la Tabla 4
dan una buena aproximacin de dX/dt para intervalos de una hora.
Completar la Tabla 4. Construir la curva de la variacin de la
velocidad de formacin de biomasa en funcin del tiempo de
fermentacin graficando los datos de la quinta columna contra
los datos de la primera columna (dX/dt vs. t). La curva as obtenida se
marcar como Figura 4.
Graficar los datos de la sexta columna contra los datos de la segunda
columna para obtener la curva (1/X)* (dX/dt) vs. X. Esta curva
representa la linearizacin de la ecuacin logstica, la cual se marcar
como Figura 5.
Realizar la regresin lineal de los datos de la Figura 5, con el fin de
obtener la ecuacin de la recta que mejor represente los puntos de la
grfica. Puede ser necesario excluir algunos de los puntos iniciales o
finales. Se recomienda hacer la regresin en una calculadora
cientfica o usar el Asistente para Grficos de Excel, el cual tiene la
opcin de ajustar los puntos a una recta y mostrar la ecuacin de la
misma. Con base en la ecuacin de la recta se hallan los parmetros
de la ecuacin logstica ( y ).
Con los valores de los parmetros, resolver la ecuacin logstica y
construir una nueva grfica en donde con una lnea continua se
muestre la curva de la biomasa en funcin del tiempo, X = f (t),
obtenida con base en el modelo matemtico propuesto. Esta curva se
marcar como Figura 6.
En la misma Figura 6, graficar los puntos experimentales originales
(los valores de la Tabla 2) sin unirlos con ninguna lnea.
Confronte los datos experimentales de concentracin de biomasa
(Xexp) y los arrojados por el modelo (Xmod) de acuerdo a la Tabla 5. La
cuarta columna corresponde al porcentaje de error de los valores de
la segunda y tercera columnas, calculados mediante la frmula:

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= (Xexp -Xmod)/ Xexp * 100%


5.3. Resultados
Complete la Tabla 4 y la Tabla 5 y anexe las Figuras 3 a 6. Identifique la
presencia de mximos en la Figura 4 y de porciones rectas en la Figura
5. Evale visualmente (cualitativamente) la aproximacin de los puntos
experimentales a la curva arrojada por el modelo matemtico.

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Tabla 4. Determinacin de los parmetros cinticos de la ecuacin


logstica.
t
(h)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38

X
(g/L)

X/ t
-

(1/X)*( X/
t)
-

39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Tabla 5. Comparacin de los datos experimentales y los arrojados por el
modelo.
Tiempo
(h)
0

Xexp

Xmod

(g/L)

(g/L)

promedio =
5.4. Anlisis de Resultados
5.4.1. Interprete la Figura 2 haciendo nfasis en la presencia de mximos
y su relacin con la fase de crecimiento.
5.4.2. Indique la ecuacin de regresin para la Figura 3. Igualmente
muestre el coeficiente de regresin. Cul es el sentido fsico de
este coeficiente?
5.4.3. Cmo se justifica la exclusin de puntos de la figura 3 con el fin
de mejorar los resultados de la regresin lineal?
5.4.4. Cul es la utilidad de los modelos matemticos de
fermentaciones?
5.4.5. Qu otros modelos matemticos pueden aplicarse a los datos
experimentales obtenidos?

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5.4.6. Cmo se verifica en forma estricta si un modelo matemtico


describe adecuadamente el crecimiento celular en una
fermentacin?
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Formule las conclusiones y recomendaciones relacionadas con el
desarrollo de la presente prctica.
Anexar la portada a la presente gua indicando los integrantes del grupo
de trabajo.
8. BIBLIOGRAFA
Relacione todas las fuentes bibliogrficas utilizadas para el desarrollo y
la presentacin del informe de la presente prctica, incluyendo
direcciones de Internet de acuerdo a las normas ICONTEC 2002.

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