PRACTICA N 1 ESTERILIZACIN, MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRAS Y

AISLAMIENTOS
Rivera Andrs Felipe 99070715801; Martnez Erlis Yadit 1045137129; Suarez Angie
Natalia 1019086781; Barrera Lilian Yenifer 1094243483; Sandoval Isney Valeria
97081608931
Departamento De Microbiologa, Facultad De Ciencias Bsicas, Universidad De Pamplona
(Km 1 Va Bucaramanga, Pamplona, Norte De Santander)

RESUMEN
El objetivo de esta prctica fue aplicar los mtodos utilizados para la esterilizacin de
medios de cultivo, materiales, y accesorios utilizados en el laboratorio, preparar medios de
cultivo siguiendo los lineamientos bsicos de asepsia y estableciendo el papel de cada
componente del medio en el cubrimiento de las diferentes necesidades nutricionales de
los microorganismos y aplicar y distinguir las tcnicas y mtodos de siembra en
microbiologa. Para la esterilizacin se us papel kraff enrollando las pipetas y cubriendo
totalmente las cajas de petri en conjunto, se introdujeron en un horno a 180c, luego de la
esterilizacin se hicieron los clculos necesarios para la preparacin de medios de cultivo
(Agar, caldo) teniendo en cuenta el volumen necesario para la preparacin (20ml cajas,
10ml tubos), teniendo los medios de cultivo preparados se hizo siembra por agotamiento,
masiva, puncin en caja, por estra en tubo inclinado, picadura de tubo y siembra mixta en
tubo, se us E. coli, E. coli + Salmonella, Pseudonoma spp, se obtuvieron colonias
separadas, grandes cantidades de clulas y se observo el crecimiento en los tubos solo
por los lugares donde pas el asa, el tubos lquidos se mostro un cambio de translucido a
turbio, prueba positiva de crecimiento de microorganismos.
INTRODUCCION
Para trabajar en un laboratorio de
microbiologa se requieren tcnicas
especficas y diferentes a las que se
utilizan en otras disciplinas.
Es
imprescindible trabajar en condiciones
aspticas: el material e instrumental que
se va a utilizar, as como los medios de
cultivo, deben ser sometidos a algn
procedimiento
de
esterilizacin,
eliminndose de ellos cualquier posible
organismo.
Tienen
importantsima
aplicacin los procedimientos, tcnicas y
productos que suprimen o disminuyen la
vitalidad
de
los
microorganismos

patgenos. No existe un procedimiento

de esterilizacin y desinfeccin aplicable
a todos los casos. El mtodo de
esterilizacin ser seleccionado para
cada caso teniendo en cuenta la
naturaleza fsica del objeto y la
naturaleza biolgica del contaminante.
Como rara vez se conoce la poblacin de
microorganismos sobre un objeto que
debe ser tratado, debemos presuponer
que se encuentran presentes las formas
microbianas
ms
resistentes:
las
endosporas. El mtodo de esterilizacin
a emplearse debe ser previamente
valorado. Actualmente existen valores
tabulados de tiempo de exposicin,

temperatura
y
concentracin
de
principios activos para los mtodos de
esterilizacin ms usados que nos
permiten elegir el ms adecuado para
cada caso. En la eleccin debe tenerse
en cuenta tambin el uso posterior que le
ser dado (o no) al objeto a esterilizar.
CALOR HMEDO: la desnaturalizacin
y coagulacin se facilita en presencia de
agua pues se rompen los puentes de
hidrgeno entre los grupos C = O----HN
que constituye la estructura secundaria y
se agrega (tambin mediante puente de
hidrgeno) una molcula de agua a cada
extremo de esas uniones rotas.
CALOR SECO: Deshidrata las bacterias,
virus, etc. y facilita la coagulacin o
desnaturalizacin de las protenas.
RADIACIONES:
Luz
ultravioleta:
solamente para aire o para superficie o
capas muy delgadas de lquidos pues no
penetra. Se usa para consultorios, salas,
laboratorios, cmaras, quirfanos. No
atraviesan el vidrio. (1)
MEDIOS
DE
CULTIVO:
Los
microorganismos en general pueden vivir
y multiplicarse sobre substratos nutritivos
preparados
en
el
laboratorio,
denominados medios de cultivo. Los
Medios de Cultivo son preparados
estriles que contienen sustancias
necesarias para el desarrollo de los
microorganismos.
Todos los microorganismos requieren
agua, carbono, nitrgeno, hidrgeno,
calcio, fsforo y hierro como elementos
vitales. Los microorganismos exigentes
requieren
adems
factores
de
crecimiento
como
aminocidos,
vitaminas, purinas y otras sustancias que
no son capaces de sintetizar.

CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO
1.
Contener
sustancias
nutritivas
necesarias para el desarrollo de los
microorganismos
(tales
como
aminocidos,
carbohidratos,
polialcoholes, vitaminas, minerales).
2. Tener un pH que permita un desarrollo
ptimo, por lo general las bacterias
patgenos necesitan un pH neutro o
ligeramente alcalino (7.0 7.4), en
cambio las levaduras y hongos requieren
un pH cido (5.0).
3. Estar previamente esterilizados o
preparados en condiciones aspticas.
4. Estar protegidos de la contaminacin
ambiental por tapones de algodn card,
tapones de goma, tapas metlicas o
roscas
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
1.
Medios
Lquidos:
se
utilizan
preferentemente para favorecer el
desarrollo
bacteriano
de
clulas
estresadas. En determinadas ocasiones
no se pueden sustituir por los medios
slidos, por ejemplo en la sntesis de
exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc. Ejemplo: Agua peptonada, Caldo comn,
Caldo
Cerebro
Corazn,
Caldo
Saboureaud, etc.
2. Medios Slidos: se utilizan para
obtener bacterias aisladas por la
formacin de colonias sobre la superficie
del medio de cultivo y para el estudio de
la morfologa de las colonias, lo que no
permiten los medios lquidos. Se
diferencian porque tienen una sustancia
de sostn, que puede ser agar-agar. -

Ejemplo: Agar Comn, Agar SS, Agar

Cerebro Corazn, Agar Saboureaud, etc.
3. Medios Semislidos: se utilizan para
estudiar la motilidad de las bacterias.
Tienen un menor porcentaje de Agar, por
lo que no solidifican totalmente a la
temperatura ambiente. - Ejemplo: Agar
MIO, Agar SIM. (2)
SIEMBRAS: Sembrar o inocular es
introducir artificialmente una porcin de
muestra (inculo) en un medio adecuado,
con el fin de iniciar un cultivo microbiano,
para su desarrollo y multiplicacin. Una
vez sembrado, el medio de cultivo se
incuba a una temperatura adecuada para
el crecimiento.
Siembra por agotamiento: Con ste
procedimiento se puede conseguir una
buena separacin de las colonias y
aislarlas fcilmente. Para ello se funde el
medio de cultivo, se vuelca en caja de
Petri y se deja solidificar. Con el asa
previamente
esterilizada
se
toma
material de un cultivo heterogneo y se
descarga sobre la superficie del medio
formando estras.
Siembra por puncin: Con un asa
bacteriolgica se toma el material que se
quiere sembrar y se lo introduce en el
tubo, con medio semislido. Introducir la
aguja hasta el fondo, formando un canal
de puncin, trayecto por el cual la
retiraremos luego.
Siembra por estras en superficie: Se
siembra el material en la superficie del
Agar inclinado en un tubo de ensayo, all
se extiende por toda la superficie con el
asa bacteriolgica, previamente esteriliza
da ycargada con el material a sembrar, h
aciendo estras no muy amplias, pero
tampoco muy estrechas. Se inicia por la

partems profunda de la superficie inclin

ada y se termina la estra en la parte ms
cerca de la boca del tubo.
Siembra masiva: con un asa estril
introducindola en el tubo que contiene
la muestra a sembrar, luego frote toda la
superficie del Agar. Le evaluacin del
crecimiento en las placas de Agar se
hace a travs de la observacin de
colonias
agrupadas
en
grandes
cantidades.
Siembra mixta en tubo: Se realiza en
forma combinada en picadura hasta el
fondo del tubo deslizando el asa por la
superficie marcando estras.
Siembra en medio liquido en tubo: se
toma el inoculo y se lleva al fondo del
tubo realizando movimientos circulares
en todo el tubo para esparcir el
microorganismo. (3)
MATERIALES Y METODOS
En la prctica de esterilizacin se uso
dos fiolas (pequea, grande) 6 pipetas, 6
cajas de petri, a las fiolas se les elaboro
un tapn con algodn, gasa, y papel
aluminio enrollando esto con cinta de
enmascarar en el pico de la fiola, las
cajas de petri se envolvieron en conjunto
con papel kraff usando la cinta de
enmascarar, esto se llevo a calor
hmedo en el horno a 180c por unas
horas. Tambin se realizaron clculos
para el uso de hipoclorito y sus distintas
aplicaciones con la esta frmula:
V1C2=V2C2
Para la preparacin de medios de cultivo
se realizaron los clculos respectivos
teniendo en cuenta la informacin de los
medios, usando el autoclave para la
sedimentacin y homogenizacin, esta

se uso por unas horas. Luego se sirvi

en las cajas de petri esperando unos
minutos para que se enfriara y as poder
sembrar en ellos.
Se hizo siembra por agotamiento y
siembra masiva usando el asa redonda,
se hizo siembra por puncin con asa
bacteriolgica, se hizo siembra en Agar
inclinado en tubo, siembra mixta, siembra
por picadura de tubo y siembra en medio
liquido, todas estas siembras se
elaboraron con el uso del mechero,
esterilizando el asa al rojo vivo,
flameando la boca del tubo antes y
despus de tomar el inoculo, las cepas
que se usaron para cada siembra fueron
tres
tubos
cada
uno
contenido
individualmente
con
E.
coli,
E.
coli+Salmonella y Pseudonomas.

Se hizo puncin con E. coli en un tubo

semislido.
Se inoculo E. coli en un tubo con caldo
tioglicolato.
Se hizo siembra de hongos en caja
(OGY) y caja (SABOURAUD), haciendo
picadura con asa bacteriolgica llevando
el inoculo desde un pan hacia la caja de
petri, con puncin profunda.

RESULTADOS Y ANALISIS
SIEMBRAS Y AISLAMIENTOS

SIEMBRA MASIVA

S. AISLAMIENTO

Cada estudiante hizo una siembra por

agotamiento y una siembra masiva a
partir del tubo E. coli.
Se hizo una siembra por grupo sobre
Agar (centrimide) realizando luna y
estrellas a partir del tubo Pseudonomas
spp.
Se inoculo el nombre a partir del tubo E.
coli, sobre Agar (EMB)
Se realizo una siembra por agotamiento
sobre Agar (Rambach) a partir del tubo
E. coli+Salmonella.
Se inoculo E. coli en un tubo con caldo
nutritivo,
Se hizo puncin de E. coli en un tubo de
Agar nutritivo recto.
Se hizo siembra mixta de E. Coli en un
tubo de Agar inclinado.

AGAR NUTRITIVO
En la siembra masiva se obtuvieron
colonias de clulas aisladas, y en la
siembra masiva se logro obtener grandes
cantidades de clulas.
ANLISIS:
Estas siembras fueron posibles ya que
fueron ellas en medios de cultivo (Agar
Nutritivo) y este medio se usa para todo
tipo de bacterias ya que permanece
slido incluso a relativamente altas
temperaturas. Adems, el crecimiento
bacteriano en este Agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor
las colonias pequeas.

su funcion es detectar y aislar

Salmonella spp, siendo asi las colonias
oscuras el E. coli y las claras la
Salmonella.

AGAR EMB
En esta siembra se obtuvo lo que se
queria ya que el microorganismo tenia
que crecer solo por donde el asa pasara
y asi fue dando como resultado un color
negro platinado.
ANLISIS:
Este crecimiento se dio ya queeste
medio es utilizado para el aislamiento
selectivo de bacilos Gram negativos de
rpido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales como el E. coli
demostrandolo en el resultado de sus
colonias, verdosas con brillo metalico y
centro negro azulado.

S. AGOTAMIENTO

FIGURA LUNA Y ESTRELLAS

AGAR CENTRIMIDE
En la siembra en el agar centrimide de
lograron observar las figuras hechas,
usando la lampara de luz azul dando
como resultado un pasa de luz
fluorescente.
ANLISIS:
este crecimiento selectivo se dio ya que
este medio de cultivo aporta al desarrollo
de Pseudomonas y estimula la formacin
de pigmentos. Es ste un medio hay
peptona de gelatina que aporta los
nutrientes para el desarrollo microbiano.
el cloruro de magnesio y el sulfato de
potasio promueven la formacin de
piocianina, pioverdina, piomelanina y
fluorescena, por eso es que esta
siembra es fluorescente.

AGAR RAMBACH
En esta siembra se dieron colonias
naranjas y azules como se queria lograr,
se lograron obtener colonias aisltadas.
ANLISIS:
Esta siembra obtuvo colonias de
diferente color ya que se us E.
coli+Salmonella y este tipo de medio de
cultivo es cromognico lo que dice que

TUBOS SOLIDOS, SEMISOLIDOS Y

LIQUIDOS.

En los tubos en los cuales se hizo la

siembra de E. coli, se pudo observar un
excelente resultado, se vio el cambio de
los tubos translucidos a turbios y el
crecimiento de microorganismos por
donde se paso el asa en los tubos con
AN.

ANLISIS:
-

En los tubos de caldo glicolato se

dieron estos tipos de crecimiento
ya que este medio recomendado
para usar en ensayos de control
de esterilidad, tambin se usa por
su capacidad de favorecer el
desarrollo de una gran variedad
de microorganismos aerobios y
anaerobios.
(Agar Nutritivo) y este medio se
usa para todo tipo de bacterias ya
que permanece slido incluso a
relativamente altas temperaturas.
Adems,
el
crecimiento
bacteriano en este Agar lo hace
en la superficie, por lo que se
distinguen
mejor
las colonias pequeas.

como la humedad o vapor de los

tubos que impidieron la
perfeccion.
Se aplicaron y distinguieron las
diferente tecnicas y metodos de
siembra empleados en
microbiologia.
Algunas de las siembras por
agotamiento no se obtuvieron
colonias aisladas ya que interfirio,
el vapo y agua de las cajas y
algunas contaminaciones por falta
de uso de las tecnicas
adecuadas, como el trabajo cerca
al mechero y el manejo correcto
de las cajas de petri.
BIBLIOGRAFA

CONCLUSIONES

se ejecutaron siembras en caja

de petri masivas y por
agotamiento, obteniendose
buenos resultados ya que estos
medios de cultivo son completos
en su medio constitutivo y aporta
los nutrientes necesarios de
cualquier bacteria.
Se lograron siembras en tubos
por las tecnicas de picadura,
estra y mixta. Donde se
observaron creciemientos pero
tambien algunas inconsistencias
por aspectos fisicos abversos

(1)https://es.wikipedia.org/wiki
/Esterilizaci%C3%B3n_(micro
biolog%C3%ADa)
(esterilizacin) citado
19/09/2015
(2)https://libroslaboratorio.files
.wordpress.com/2012/09/medi
os-de-cultivo-en-unlaboratorio-demicrobiologc3ada.pdf
(medios de cultivo) citado
19/09/2015
(3)https://conalepfelixtovar.wo
rdpress.com/2012/09/26/tecni
cas-y-metodos-deaislamiento-y-seleccion-demicroorganismos/ (siembras
y aislamientos) citado
19/09/2015