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(http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?
p=Aplicacion_anticuerpos&opc=tecnicas)
Los anticuerpos son protenas que son producidas por el sistema
inmunolgico en respuesta a molculas externas que entran en el
cuerpo, estas molculas externas son los llamados antgenos, y su
reconocimiento molecular por el sistema inmunolgico da como
resultado la produccin selectiva de anticuerpos que son capaces de
unirse especficamente a ese antgeno. Los anticuerpos son
producidos por los linfocitos B y circulan a travs de la sangre donde
se unen a su antgeno especfico, permitiendo ser eliminados de la
circulacin.
Esta habilidad del sistema inmunolgico animal para producir
anticuerpos para unirse especficamente a los antgenos nos permite
fabricar marcadores que nos permiten la deteccin de molculas de
inters
en
aplicaciones
de
investigacin
y
diagnstico.
Otra de las caractersticas de los anticuerpos que nos ayudan a
utilizarlos como herramientas de reconocimiento es su relativa
uniformidad y su buena estructura caracterizada que nos permite
purificarlos, marcarlos y detectarlos de una manera predecible y
reproducible
por
mtodos
generalizados.
Durante los 70 y 80 se generaron protocolos de produccin,
purificacin y modificacin para uso de deteccin especfica de
antgenos, y siguen relativamente vigentes. La produccin de
anticuerpos necesita la preparacin de animales, inyeccin del
antgeno en el laboratorio para provocar la alta produccin de
anticuerpo y su posterior recoleccin. Alternativamente las lneas
celulares de hibridomas producen monoclonales especficos para un
antgeno se pueden producir por fusin de una clula que secreta un
anticuerpo especfico con una lnea inmortal de mieloma.
La purificacin de anticuerpos incluye el aislamiento del anticuerpo
del suero (anticuerpos policlonales), fluido asctico, sobrenadante de
cultivo de una lnea celular de hibridoma (anticuerpo monoclonal). Los
mtodos de purificacin varan desde muy crudos (precipitacin de
las protenas de la muestra incluyendo cualquier anticuerpo
presente), a purificacin general (purificacin por afinidad de ciertas
clases de anticuerpos sin tener en cuenta la especificidad al antgeno)
hasta la especfica (purificacin por afinidad de los anticuerpos que se
unen especficamente a un antgeno en concreto. El nivel de
purificacin necesaria depende de la aplicacin para la cual queremos
utilizar el anticuerpo.
TIPOS DE ANTICUERPOS
Estructura de una inmunoglobulina
Clases de inmunoglobulinas
Las 5 clases primarias de inmunoglobulina son IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Estas se
distinguen por el tipo de cadena pesada que se encuentra en la molcula:
- Molculas IgG con cadena pesada conocidas como cadena -
PURIFICACIN DE ANTICUERPOS
Los anticuerpos son protenas, por lo que los mtodos de purificacin a partir de muestras
biolgicas (suero, fluido asctico o sobrenadante de cultivo) son formas especializadas de
los mtodos de purificacin de protenas. La purificacin se puede hacer en forma cruda,
es decir precipitando todas las inmunoglobulinas y otras protenas, o solo los anticuerpos
que puedan fijarse a un antgeno especfico.
La purificacin cruda de anticuerpos se puede hacer con diferentes mtodos como
precipitacin con persulfato de amonio, adsorcin tioflica o cromatografa de intercambio
inico. Estos mtodos son tiles dependiendo de la aplicacin en la que vayamos a utilizar
nuestro anticuerpo. En aplicaciones a mayor escala normalmente se utiliza el intercambio
inico para purificar un tipo de inmunoglobulina, en cambio en investigacin y en
produccin a pequea escala se utiliza ms la purificacin por afinidad.
La cromatografa por afinidad (purificacin por afinidad), un ligando es unido a un soporte
slido, como por ejemplo crosslinkado a gel de bolas de agarosa. La muestra fluida sa a
travs del soporte material permitiendo que las inmunoglobulinas se unan al ligando
inmovilizado. Mientras que los componentes que no se han unido se lavan y eluyen del
soporte. Posteriormente ponemos un buffer que nos cambie las condiciones del medio y
haga que se rompa la unin entre la inmunoglobulina y el ligando de manera que
podamos eluir nuestro anticuerpo en una forma purificada.
Proteica A, protena G y sus formas recombinantes, son componentes de la pared celular
bacteriana que se unen a la regin Fc de las inmunoglobulinas y son de lejos las ms
escogidas para purificar IgG por afinidad. La protena L es la tercera protena de origen
bacteriano que ha sido desarrollada para usarla en purificacin anticuerpos por afinidad,
se une a diferentes clases de inmunoglobulinas (por ejemplo IgG, IgM, IgA) siempre y
cuando tengan la cadena ligera Kappa. Algunas lectinas se unen especficamente a IgA
humana. Mannan binding protein (MBP) nos permite purificar IgM tanto humana como
de ratn.
Como en cualquier mtodo de purificacin, los buffers de unin como de elusin son
componentes importantes en la purificacin de anticuerpos cuando se usan los ligandos
comentados anteriormente. Generalmente, la fuerza inica y el pH son los factores ms
importantes afectando la eficiencia de unin y consecuentemente la elusin de las
inmunoglobulinas de estos ligandos. Sin embargo, la temperatura y otros componentes
son tambin importantes en casos particulares.
Para purificar anticuerpos especficos contra antgenos, hemos de inmovilizar el antgeno
a un soporte y lo utilizamos para purificar por afinidad las inmunoglobulinas que se unan
a l.
PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Produccin de anticuerpos policlonales
El proceso de produccin de policlonales es relativamente sencillo, se inmuniza el animal
y el sistema inmunolgico de este responde al antgeno para producir anticuerpos contra
la molcula inyectada. Sin embargo, esta produccin depende de este sistema biolgico
complejo, los resultados no son predecibles. Los animales individualmente e incluso de la
misma identidad gentica, responden de manera diferente generando anticuerpos
diferentes contra la molcula inyectada. Sin embargo con el conocimiento bsico de
cmo responde el sistema inmunolgico a la inyeccin de una molcula exterior y con las
El sistema inmune
El sistema inmune es un sistema de vigilancia diseado para proveer proteccin al
inquilino de invasores externos. La vigilancia se produce por protenas y clulas que
circulan por el organismo para identificar y destruir clulas externas, virus o
macromolculas.
La proteccin inmune es proveda por un sistema dual compuesto por la respuesta
celular inmune y por la respuesta humoral inmune. La respuesta celular inmune es
producida por los linfocitos T y no puede ser transferida de un individuo a otro por
transfusin de suero. La inmunidad humoral envuelve las protenas solubles
encontradas en suero (anticuerpos) que se pueden transferir cuando el suero es
transfusionado.
Inmunogenicidad
- Antgenos e inmungenos
Una generacin satisfactoria de anticuerpos depende de la unin de linfocitos B,
procesando y presentando el antgeno al linfocito helper T, el cual seala la clula B
a producir y secretar anticuerpos. Un antgeno es cualquier molcula ques es
identificada como no propia por los componentes del sistema inmune. Un
inmungeno es un antgeno que es capaz de provocar una respuesta inmune
incluyendo la produccin de anticuerpos va respuesta inmune. Todos los
inmungenos son antgenos pero no todos los antgenos son inmungenos. Es
importante tenerlo en cuenta porque para producir anticuerpos es importante
convertir los antgenos en inmungenos en el caso de que no sean antes de
inyectarlos al animal, y para ello los unimos qumicamente a otras molculas
inmungenas.
- Haptenos y eptopos
Pptidos otras molculas pequeas que se usan como antgenos les llamamos
haptenos. Son antignicos, no inmunognicos. Los haptenos pueden hacerse
inmunognicos unindolos a un carrier.
Un eptopo es el sitio especfico del antgeno donde se une el anticuerpo. Para
antgenos muy pequeos, prcticamente la estructura completa puede actuar como
eptopo. Dependiendo de su complejidad y tamao, un antgeno puede causar la
produccin de diferentes anticuerpos dirigidos a varios eptopos. Los anticuerpos
policlonales son mezclas de inmunoglobulinas y colectivamente se unen a mltiples
eptopos en el antgeno. Los anticuerpos monoclonales por definicin contienen un
solo clon de anticuerpo y es especfico en su unin a un eptopo en particular.
Anticuerpos especficos se pueden generar contra casi una nica estructura, natural
o sinttica, siempre que sea posible presentarla al sistema inmune de forma que
sea inmunognica. Los anticuerpos resultantes se pueden unir a eptopos
compuestos de molculas enteras, grupos funcionales particulares de molculas
grandes, grupos de aminocidos funcionales en estructuras terciarias de protenas,
una nica estructura en lipoprotenas, glycoprotenas, RNA, DNA o polisacridos.
Los eptopos puedn ser tambin partes de estructuras celulares, bacterias, hongos
o virus.
Carriers
Una protena carrier es cualquier protena usada para unirse con pptidos u otros
haptenos que no son suficientemente grandes o complejo por s mismos para inducir
una respuesta inmune para producir anticuerpos. El carrier, como es grande y
complejo, confiere inmunogenicidad al hapteno conjugado, resultando la produccin
de anticuerpos de eptopos del hapteno y el carrier. Muchas protenas se pueden usar
como carriers y se escogen basndonos en inmunogenicidad, solubilidad y
disponibilidad de grupos funcionales en los cuales podemos conjugar el hapteno. Los
dos ms usados comnmente son Keyhole Limpet Hemocayanin (KLH) y Bovine
Serum Albumin (BSA).
En una respuesta inmune tpica los anticuerpos son producidos por linfocitos B
(normalmente en conjuncin con clula T-helper y clulas presentando-antgeno). En
la mayora de los sistemas carrier-hapteno, las clulas B producirn anticuerpos que
son especficos para ambos, el hapteno y el carrier. En el sistema clsico haptenocarrier, Los linfocitos T reconocen el carrier y coopera con las clulas B las cuales
induce una respuesta anticuerpo-especfica al hapteno.
Una respuesta anticuerpo se dirigir contra eptopos a ambos, carrier y hapteno, es
muy importante planificar cuidadosamente como los anticuerpos especficos al
hapteno van a ser identificados y purificados del suero inmunizado final. Para crear el
inmungeno mejor, puede ser beneficioso preparar el conjugado con difertentes
carriers y con diferentes ratios de unin hapteno-carrier.
Adyuvantes
Para aumentar la respuesta inmune a un inmungeno, se puede utilizar varios aditivos
llamados adyuvantes. Cuando se mezcla y se inyecta con un inmungeno, un adyuvante
aumentar la respuesta inmune. El adyuvante no es el sustituto del carrier porque
aumente la respuesta inmune al inmungeno porque no puede hacer que el hapteno sea
inmunognico. Los adyuvantes son estimuladores no especficos de la respuesta inmune,
ayudando a anclar o secuestrar el material inyectado y causando un aumento dramtico
en la respuesta de anticuerpo.
Hay muchos adyuvantes populares, incluyendo los Freunds complete adjuvant (FCA).
Este reactivo consiste de una emulsin agua-aceite y mycobacterium muerto. La
emulsin de agua-aceite localiza el antgeno durante un largo periodo de tiempo, y el
mycobacterium atrae los macrfagos y otras clulas apropiadas al sitio de inyeccin. El
FCA es usado en las inyecciones iniciales. Las siguientes inyecciones usan inmungeno en
una emulsin con FCA que no contiene el componente mycobacterial. FCA son muy
efectivos, pero ponen en riesgo al animal y el experimento por la toxicidad del
componente mycobacterial.
Imject Alum es igualmente efectivo y una alternativa ms conveniente a los FCA. La
preparacin de la muestra con los Imject Alum es simplemente mezclar el antgeno con
la solucin de adyuvante, y a continuacin la inyeccin.
Otra alternativa a los FCA es el Adjuprime Immune Modulator. Es un adyuvante
carbohidratado no txico y fcil de administrar en una sola fase acuosa. Estas
caractersticas nicas le hace ms fcil y seguro de usar que el FCA. El adjuprime es una
diana de macrfagos y adyuvante de liberacin sostenida de antgeno. Prporciona un
amplio espectro macromolecular y antgenos oligopptidos a la superficie celular del
macrfago y estimula la respuesta humoral al antgeno. El Adjuprime genera una
respuesta de anticuerpo equivalente al FCA sin la respuesta inflamatoria asociada.
Proceso
Los animales normalmente utilizados son conejos, ratones, ratas, cobayas, gallinas,
cabras, caballos, ovejas, vacas y llamas.
Uno de los factores importantes en la produccin de policlonales es el background, y
para reducirlo lo ms importante es utilizar animales libres de patgenos y que no hayan
sido inmunizados anteriormente. Otro factor es el estrs antes y durante la
inmunizacin, y para reducir este factor es importante anestesiar el animal en la
inyeccin, extraccin de la sangre y mantenerlo en una sala limpia y acondicionada.
Cada productor de anticuerpos puede tener su propio programa y puede variar entre 60
y 100 das de inmunizacin.
Antgeno/inyeccin
Ratn
40 microgramos
Rata
50
Cobaya
50
Cabra
400
Oveja
400
Llama
400
Gallina
200
Conejo
100
Da
14
28
Inyeccin
Sangrado
Preinmune
38
56
66
87
20 ml
60 ml
2 ml
Da
14
28
Inyeccin
Yema de
Huevo
Preinmune
38
56
66
87
Huevos*
(*) Los huevos se recogen entre el dia 38 y el 87 y se mezclan por semana y por
gallina.
Da
14
28
Inyeccin
Sangrado
Pre-inmune
38
350 ul
Inmunizacin.
Fusin.
Screening y amplificacin del hibridoma.
Clonacin e isotipado
Produccin del monoclonal
Vamos a describir un programa estndar, el cual puede ser modificado segn las
necesidades.
Fase I: Inmunizacin.
En este paso utilizamos ratones de una edad aproximada de 6-8 semanas. Para poder
servirnos de referencia de la efectividad de la inmunizacin cogemos suero preinmune
del ratn en el da 0. A cada uno de los ratones se le suministra 4 inyecciones con una
cantidad de 50 ug de antgeno por inyeccin y por animal. En todas las inyecciones
utilizamos la misma cantidad de volumen de antgeno como de Freunds complete
adjuvant (FCA). La primera inyeccin en el da 0, el resto de las inyecciones cada 3
semanas.
A los 10 das de la ltima inyeccin seleccionamos por elisa cual es el ratn con una
mejor respuesta inmune.
Este proceso puede durar unas 11 semanas.
Fase II: Fusin.
mantener las clulas alineadas y de tiempo para que maduren y se unan los
citoplasmas.
d. En el cuarto paso es despus de la maduracin de la unin de las membranas
las clulas se cultivan para promover su viabilidad y su crecimiento.
Escreening y amplificacin del hibridoma
- Las IgG producidas por los hibridomas se testan contra el antgeno deseado.
- Las colonias positivas se expanden y se testan otra vez contra el antgeno.
- En este punto tambin podemos testar otros antgenos u otras regiones de nuestro
antgeno para ver posibles reacciones cruzadas que nos puedan interferir en
nuestro ensayo final.
Por ejemplo las tcnicas para testar los IgG pueden ser Elisa, western blot e
inmunofluorescencia.
Esta fase puede durar aproximadamente 5-7 semanas.
Clonacin e isotipado
Los hibridomas especficos seleccionados se clonan por dilucin limitada, es decir
diluimos los pocillos que nos han dado positivos en la fase anterior y volvemos a
sembrar, para que en cada pocillo solo quede un clon. Para seleccionar el clon de
inters podemos hacer el escreening como en la fase 3, primero contra el antgeno
utilizado en la inmunizacin y posteriormente los positivos contra otros antgenos.
Una vez seleccionado el clon, a continuacin vemos la subclase de cada uno de los
monoclonales por un test de Elisa.
Fase 5: Produccin de monoclonal
En esta fase es cuando obtenemos nuestro anticuerpo monoclonal en grandes
cantidades, se puede realizar de dos maneras diferentes:
1. Inmunizacin de ratones.
2. Cultivo celular.
1. Inmunizacin de ratones:
Se trata de inyectar el hibridoma en la zona peritoneal del ratn para que
produzca anticuerpos del hibridoma introducido, de manera natural. Al cabo de
10-15 das podemos extraer el medio asctico del ratn y purificar el anticuerpo.
Aproximadamente podemos obtener unos 5-10 ml de fluido por cada uno de los
ratones inmunizados.
2. Cultivo celular
Este es un sistema In Vitro donde no utilizamos animales para producir nuestros
anticuerpos monoclonal.
Cultivamos nuestro hibridoma seleccionado en un frasco de cultivo con los
nutrientes adecuados, de esta forma los hibridomas expresan el anticuerpo
monoclonal al medio de cultivo donde lo recogeremos y purificaremos. Los
anticuerpos los recogeremos cada 5-7 das y cambiaremos el medio para aportar
nuevos nutrientes.
Otro tipo de produccin In Vitro es con un sistema en continuo de nuestros
hibridomas y el medio de cultivo. Se usa la tecnologa de Holow -Fibre, los
les adhieren los hibridomas en los poros, y debido a su gran superficie nos
permite tener un gran nmero de clulas en cultivo, unido a la gran capacidad de
los bioreactores, podemos producir monoclonales en cantidades importantes.
Tambin podemos hacer pequeas producciones en el laboratorio con partculas
en suspensin con los llamados Cellspin, un sistema de agitacin para mantener
las partculas en suspensin y producir nuestro anticuerpo a escala media.