Virologia Relatorio

UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FRMACIA
RELATORIO DE ESTGIO
Catarina Carapucinha Cabeadas
MESTRADO EM ANLISES CLNICAS
2011
Relatrio e monografia apresentados Faculdade

de Farmcia da Universidade de Lisboa para
candidatura
ao
grau
de
Mestre
RELATRIO DE ESTGIO
INSTITUTO PORTUGUS DE ONCOLOGIA FRANCISCO GENTIL
ORIENTAO:
Dr. Maria Cesaltina Loureno
Dr. Cidlia Vieira
Dr. Carmo Ornelas
2011
RESUMO
O Estgio profissional em Anlises Clnicas parte integrante do plano de estudos do
Curso de Mestrado em Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade de
Lisboa. O estgio consistiu num perodo de trabalho nos laboratrios inseridos no
Servio de Patologia Clnica do Instituto Portugus de Oncologia (IPO) nas reas de
Bioqumica, Imunologia e Virologia; o estgio na valncia de Microbiologia foi feito no
laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira.
O presente relatrio tem como objectivo transmitir a experincia adquirida durante o
estgio nas vrias valncias laboratoriais de anlises clnicas. O relatrio encontra-se
dividido por valncias, fazendo referncia aos equipamentos e mtodos utilizados na
execuo das vrias anlises, ao interesse clnico da determinao de cada analito,
eventuais interferentes bem como ao controlo de qualidade implementado em cada
valncia.
ABSTRACT
The professional training in Clinical Analysis is integrated in plan of studies of the
Masters Course in Clinical Analysis of the Faculty of Pharmacy of the University of
Lisbon. The internship consisted of a period of work in the laboratories inserted in the
Service of Clinical Pathology of the Instituto Portugus de Oncologia (IPO) in the areas
of Clinical Biochemistry, Immunology and Virology; the internship at area of
Microbiology was done in the laboratory of microbiology at the Clnica de Diagnsticos
Dr. Fernando Teixeira. The purpose of this report is to transmit the experience gained
during the internship in various laboratory areas of clinical analysis. The report is
divided into the internship areas, making reference to the equipment and methods used
in the execution of the various analyses, the clinical interest of each analyte
determination, possible interferences as well as the quality control implemented in each
area.
NDICE
INTRODUO AO INSTITUTO PORTUGUS DE ONCOLOGIA FRANCISCO GENTIL ................. 1
1. PR-ANALTICA ............................................................................................................. 2
1.1.
Colheita ......................................................................................................... 2
1.2.
Preparao das amostras ................................................................................ 5
2. BIOQUMICA CLNICA .................................................................................................... 7

2.1.
Objectivo ....................................................................................................... 7
2.2.
Introduo ..................................................................................................... 7
2.3.
Mtodos ........................................................................................................ 7
2.4.
Interesse Clnico .......................................................................................... 16
2.5.
Calibrao ................................................................................................... 35
3. IMUNOLOGIA................................................................................................................ 36
3.1.
Objectivo ..................................................................................................... 36
3.2.
Introduo ................................................................................................... 36
3.1.
Sector de Imunoqumica .............................................................................. 36
3.2.
Serologia ..................................................................................................... 53
3.3.
Sector dos Marcadores tumorais .................................................................. 62
3.4.
Sector da Autoimunidade............................................................................. 64
4. VIROLOGIA .................................................................................................................. 70
4.1.
Objectivo ..................................................................................................... 70
4.2.
Introduo ................................................................................................... 70
4.3.
Herpesvrus ................................................................................................. 70
4.4.
Hepadnavrus............................................................................................... 74
4.5.
Flavivrus .................................................................................................... 76
4.6.
Retrovrus .................................................................................................... 77
4.7.
Papilomavrus .............................................................................................. 78
4.8.
Deteco Directa e Indirecta dos Agentes Virais .......................................... 80
5. CONTROLO DE QUALIDADE.......................................................................................... 93
5.1.
Controlo de qualidade interno ...................................................................... 93
5.2.
Avaliao externa da qualidade.................................................................. 109
INTRODUO CLNICA DE DIAGNSTICOS DR. FERNANDO TEIXEIRA ......................... 116

6. MICROBIOLOGIA ........................................................................................................ 117
6.1.
Objectivo ................................................................................................... 117
6.2.
Introduo ................................................................................................. 117
6.3.
Laboratrio de Microbiologia .................................................................... 118
6.4.
Produtos Biolgicos................................................................................... 130
6.5.
Controlo de qualidade ................................................................................ 186
7. CONCLUSO .............................................................................................................. 195

BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 196
Introduo ao Instituto Portugus de Oncologia Francisco Gentil
INTRODUO AO INSTITUTO PORTUGUS DE ONCOLOGIA FRANCISCO

GENTIL
O Instituto Portugus de Oncologia (IPO) foi fundado em 19 de Dezembro de 1923,
com a designao de Instituto Portugus para o Estudo do Cancro. O instituto foi criado
de acordo com vrios objectivos, entre eles: organizar a luta contra o cancro, praticar o
estudo do cancro, promovendo pesquisas cientficas e divulgando conhecimentos e
preceitos teis ao pblico.
O projecto teve como principal mentor o director do instituto at 1961, o Prof.
Francisco Gentil que cedo percebeu que o estudo do cancro e uma assistncia atenta,
personalizada de elevada qualidade aos doentes oncolgicos, exigia uma organizao
dependente, tal como acontecia noutros pases.
O Instituto Portugus de Oncologia de Lisboa, Francisco Gentil (IPOLFG) a actual
designao, sendo hoje uma unidade hospitalar distribuda por vrios edifcios.
Actualmente, o IPO divide a sua actividade entre a investigao, ensino, preveno,
diagnstico, tratamento e reabilitao no domnio da oncologia. O instituto dispe dos
meios de diagnstico e teraputica adequados ao cumprimento da sua misso, tanto nas
reas laboratoriais e de medicina nuclear, como nas teraputicas cirrgicas, mdicas e
pela radiao.
Os laboratrios, onde foi realizado o estgio nas diferentes valncias, encontram-se
inseridos no Servio de Patologia Clnica (SPC), coordenado pela Dr. Margarida
Silveira e, que por sua vez, se encontra includo no Departamento de Diagnstico
Laboratorial do IPO. O SPC engloba 5 laboratrios, cada um supervisionado por um
responsvel de laboratrio, e 3 reas de suporte. Os laboratrios so: Hematologia,
Bioqumica, Imunologia, Microbiologia, Virologia; As reas de suporte so: Gesto de
Qualidade, dirigida pelo responsvel de qualidade, responsvel pela coordenao do
sistema de gesto de qualidade dos diferentes laboratrios; rea de Urgncia que
assegura o atendimento dos doentes 24 horas por dia, 365 dias por ano; e Central de
Colheitas, que responsvel pela sequncia de actividades pr-analticas, como sendo a
colheita e a triagem de amostras.
O estgio descrito no presente relatrio foi realizado nos laboratrios de Bioqumica,
Imunologia e Virologia do SPC do IPO.
Relatrio de Estgio
Pr-Analtica
1. PR-ANALTICA
Nas anlises clnicas a fase pr-analtica de grande importncia por ser a etapa onde
ocorrem a maior parte dos erros e por isso h que detect-los a fim de evitar que se
repitam. Os erros podem ter origem na solicitao da anlise e na colheita. De seguida
encontram-se alguns erros/critrios de rejeio:
Identificao errada do paciente, troca de amostras;
Amostra rejeitada (o paciente no respeitou os requisitos da anlise ou a amostra
colhida no representativa);
Uso de anticoagulante errado;
Volume de amostra inadequado;
Hemlise e lipmias intensas, estase prolongada;
Transporte e armazenamento da amostra incorrecto;
Contaminao de tubo, frascos e tampas;
Amostra destruda/extraviada;
Tubo partido na centrifugao;
Colheita em falta.
1.1.
Colheita
A colheita de amostras uma das etapas mais importantes no mbito das anlises
clnicas pois afecta a qualidade e credibilidade dos resultados. Tanto a competncia do
laboratrio como a satisfao dos pacientes dependem muito da forma como a colheita
feita.
1.1.1. Colheita de sangue
O sangue o produto mais usado para anlise. A maior parte dos analitos de
interesse da bioqumica, por exemplo, encontram-se no plasma. Logo, a preparao do
sangue para anlise consiste em remover a poro que contm as clulas, o que
possvel atravs da centrifugao.
Antes de dar incio ao trabalho e entre cada colheita, o tcnico dever verificar se a
sala est em boas condies e se tem disponvel o material necessrio. Posteriormente,
dever proceder higienizao das mos, com gua e sabo ou soluo alcolica a 70
ou colocar luvas novas. Depois de colocado o garrote deve-se seleccionar a zona da
puno, segundo os seguintes critrios:
Relatrio de Estgio
Pr-Analtica
Seleccionar uma veia que seja facilmente palpvel;
No seleccionar o brao do lado de uma mastectomia;
Nunca puncionar uma fstula;
No seleccionar um local do brao onde o doente foi submetido a uma infuso

intravenosa;
No seleccionar um local com hematoma, edema ou contuso;
No seleccionar um local com mltiplas punes.
Aps desinfectar o local da puno com lcool a 70 e com o garrote colocado,

introduzir a agulha suave e rapidamente num ngulo de 15 a 45, no centro da veia 1-1,5
cm ao longo da veia. Assim que o sangue comea a fluir no tubo da butterfly ou na
seringa, pedir ao doente para abrir a mo. No caso de sistema butterfly, ajustar os tubos
ao adaptador at ficarem cheios. Retirar o garrote o quanto antes. Ao retirar a agulha da
veia colocar uma compressa embebida em lcool a 70 na zona puncionada. Colocar a
agulha ou a butterfly num contentor de perfurantes, tipo IV. Em caso de colheita com
agulha e seringa distribuir o sangue pelos tubos, evitando a hemlise, e colocar a
seringa num contentor tipo III.
Nas colheitas em crianas, o tcnico deve ser auxiliado por outro profissional, para
minorar quaisquer dificuldades na colheita, nomeadamente na imobilizao do brao da
criana. O acompanhante deve assegurar a imobilizao das pernas.
1.1.2. Colheita de urina

A colheita de urina relativamente fcil de executar pelo prprio paciente, a no ser
em casos especiais como bebs ou acamados, em que so usados sacos colectores.
Na seguinte tabela encontram-se os diferentes tipos de urina, colheita e qual o
objectivo da sua colheita. A urina assptica no se encontra descrita por pertencer
valncia de microbiologia (captulo 6).
Relatrio de Estgio
Pr-Analtica
Tabela 1-1 Tipos de urina analisados na Bioqumica, colheita e objectivos da sua colheita.
Tipo de urina
Colheita
Para que serve

Urina concentrada que contm os
metabolitos acumulados durante a
Primeira
urina Primeira urina da manh,
da manh (urina colhida

tipo II)
para
frasco
apropriado.
noite Assegura um maior tempo da

urina na bexiga sem variaes
dirias devido a alimentao e
actividade
fsica.
til
para
deteco de protenas e analitos

pouco comuns.
Urina colhida a qualquer
Urina aleatria
hora do dia para frasco

apropriado.
til para testes de diagnstico de

rotina.
Rejeitar toda a 1. urina da

manh e anotar a hora desta
mico. Recolher em frasco
Urina
apropriado, toda a urina, Para amostra representativa de um
temporizada
por exemplo, das 3 horas analito.

seguintes. O tempo depende
do tipo de analito em
estudo.
Rejeitar toda a 1. urina da
Urina
horas
de
24
manh e anotar a hora desta Semelhante anterior. Usada para

mico. Recolher em frasco analitos cuja taxa de excreo
apropriado, toda a urina das possa variar durante as 24 h.
24 horas seguintes.
1.1.3. Colheita de outros lquidos biolgicos

Lquidos como o lquido amnitico, sinovial, peritoneal, pleural cfalorraquidiano,
entre outros, so solicitados para a anlise de alguns analitos em especial. A sua colheita
, normalmente, feita por mdicos, por ser mais exigente.
Relatrio de Estgio
Pr-Analtica
1.2. Preparao das amostras

Os vrios tipos de amostra so recebidos na seco pr-analtica do servio de
Patologia Clnica do IPO e, a partir da, so encaminhados para a central automtica ou
para os vrios laboratrios. Na seguinte tabela encontram-se as vrias etapas e aces
realizadas na seco pr-analtica.
Tabela 1-2 Etapas e aces da fase pr-analtica.
Etapa
Aces
Avaliar a amostra de forma a verificar se cumpre os
Avaliao de critrios de critrios de aceitao. Caso se verifique um dos

aceitao/rejeio
de critrios de rejeio (acima descritos), a amostra dada

comofalta de produto no sistema informtico, de
amostras
maneira a solicitar nova colheita.

A entrada de produtos efectuada no sistema
informtico, atravs do cdigo de barras do produto.
Entrada do produto
Aps entrada os produtos so centrifugados e/ou

colocados nos respectivos suportes.
Os tubos de gel seco so centrifugados a 3500 rpm, 10
Centrifugao de produtos
(se aplicvel)
minutos aps formao completa do cogulo. Os tubos

com citrato de sdio (tubo de coagulao) so
centrifugados, a 3500 rpm, 10 minutos em centrfuga
refrigerada.
As amostras hemolisadas so analisadas tendo em conta
Rejeio aps centrifugao
o grau de hemlise apresentado e dos parmetros a

efectuar.
Orientao
para
os
das
amostras
diferentes
laboratrios
As amostras destinadas central automtica so

colocadas nos suportes dos equipamentos. As amostras
destinadas aos vrios laboratrios so colocadas em
suportes identificados, juntamente com as requisies.
Conservaes das amostras Aps as 16h, as amostras destinadas aos restantes

para
os
diferentes laboratrios so conservadas na central automtica. As
laboratrios aps as 16h00, amostras
Relatrio de Estgio
destinadas
central
automticas
so
Pr-Analtica
Etapa
Aces
em caso de avaria dos processadas at as 20h e aps esta hora apenas so

equipamentos ou no caso de processadas as amostras urgentes. Em caso de avaria
amostras
que
no
processadas diariamente.
so dos equipamentos ou no caso de anlise dos

imunossupressores e hemoglobina glicada, que no so
processados diariamente, procede-se sua conservao.
Relatrio de Estgio
Bioqumica Clnica
2. BIOQUMICA CLNICA
2.1. Objectivo
O estgio na valncia de Bioqumica Clnica parte integrante do plano de estudos
do Mestrado em Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade de
Lisboa. O estgio decorreu no Laboratrio de Bioqumica do Instituto Portugus de
Oncologia de Lisboa, Francisco Gentil sob a orientao da Dr. Cidlia Vieira.
2.2. Introduo
O Laboratrio de Bioqumica est inserido no Servio de Patologia Clnica do IPO e
tem como principais actividades o doseamento de molculas biologicamente
importantes presentes nos fluidos corporais como electrlitos e protenas bem como a
monitorizao de frmacos imunossupressores.
O laboratrio de Bioqumica apresenta como metodologias Espectrofotometria,
Turbidimetria,
Potenciometria
indirecta
(ISE)
Imunoensaios
como
Quimioluminescncia (CMIA) e Imunoensaio de Fluorescncia Polarizada (FPIA).
2.3.
Mtodos
2.3.1. Espectrofotometria
Fundamento
A espectrofotometria a medida da intensidade da luz, a determinados
comprimentos-de-onda e depende da capacidade que o analito tem em absorver a luz.
Esta metodologia baseia-se no facto de a intensidade da luz, ao passar pela amostra
(cromognio), diminuir por ser, em parte, absorvida. A concentrao do analito em
estudo proporcional fraco de luz no absorvida detectada pelo fotodetector.
Na seguinte tabela encontram-se os parmetros, cujo sinal resultante de uma reaco
enzimtica, de oxidao-reduo ou colorimtrica resulta numa alterao de absorvncia
detectada por espectrofotometria.
Equipamento
Architect C8000/Ci8200 da Abbott
Relatrio de Estgio
Bioqumica Clnica
Parmetros
Na tabela seguinte encontram-se os parmetros determinados por espectrofotometria,
bem como as amostras e metodologias.
Tabela 2-1 Parmetros, amostras e respectivas metodologias determinados por espectrofotometria
Parmetro
Amostra
Metodologia
Clcio
Soro, plasma e urina
Arsenazo III
Fsforo
Fosfomolibdato
Magnsio
Arsenazo
Ferro
Soro e plasma
Ferene S
cido rico
Uricase
Bilirrubina total
Soro e plasma
Reaco de Diazo
Bilirrubina directa
Soro e plasma
Reaco de Diazo
Colesterol
Soro e plasma
Enzimtica, colesterol esterase
Creatinina
Picrato alcalino
Glucose
Soro, plasma, urina e

LCR
Hexoquinase/G-6-PDH
Triglicridos
Soro e plasma
Glicerol fosfato oxidase
Ureia
Urease
Protenas Totais
Soro e plasma
Biureto
Albumina
Soro e plasma
Verde de Bromocresol
Soro e plasma
NADH (sem P-5-P)
Substrato de CNPG3
Soro e plasma
NADH (sem P-5-P)
Creatinina Quinase
Soro e plasma
NAC (N-acetil-L-cistena)
Fosfatase Alcalina
Soro e plasma
Para-nitrofenil fosfato
Alanina
Aminotransferase
Amilase
Aspartato
Aminotransferase
Gama-Glutamil
transferase
Soro e plasma
Substrato de L- -glutamil-3carboxi-4-nitroanilida
Lactato desidrogenase
Soro e plasma
Lactato a Piruvato (NADH)
Colesterol HDL
Soro e plasma
Detergente selectivo acelerador
Relatrio de Estgio
Bioqumica Clnica
Parmetro
Amostra
Metodologia
Colesterol LDL
Soro e plasma
Detergente selectivo lquido,

medido (Mtodo Directo)
2.3.1.1. Urina tipo II

Fundamento
No Laboratrio de Bioqumica do IPO, a urina tipo II analisada com base na
espectrofotometria de reflectncia. A luz emitida por uma lmpada LED, a um
determinado comprimento-de-onda, incide sobre as almofadas da tira, a um ngulo
pr-definido. A luz reflectida com uma intensidade dependente da cor formada pela
reaco entre os compostos da almofada e a urina e captada pelo fotodetector. Aps
converter a luz detectada para valores de reflectncia, o sistema compara-os com os
limites de referncia definidos para cada parmetro e transmite resultados semiquantitativos.
Equipamento
Urisys 2400 da Roche
Parmetros
Na seguinte tabela encontram-se os parmetros analisados no equipamento, bem
como as suas metodologias especficas.
Tabela 2-2 Parmetros e metodologias analisados na urina tipo II.
Parmetro
pH
Metodologia
Os ies H+ da urina reagem com a zona do teste que contm
indicadores vermelho de metilo, fenoftalena e azul de bromotimol.
Deteco de esterases granulocitrias que decompem um ster
Leuccitos
indoxlico em idoxil que, ao reagir com sal diaznico, produz cor

violeta.
Nitritos
Teste de Griess. O teste revela a presena de nitritos e,

indirectamente, de bactrias produtoras de nitritos.
Relatrio de Estgio
Bioqumica Clnica
Parmetro
Protena
Glucose
Corpos
Cetnicos
Urobilinognio
Bilirrubina
Metodologia
Baseado no princpio do erro proteico dos indicadores de pH. Teste
particularmente sensvel albumina.
Baseado na reaco especfica da glucose oxidase/peroxidase
Teste de Legal: O cido acetoactico e a acetona formam com o
nitroprussiato de sdio, em meio alcalino, um complexo de cor
violeta.
O sal diaznico da tira reage com urobilinognio, originando um
corante azico vermelho.
Ligao da bilirrubina a um sal diaznico da tira produzindo uma cor
rosa.
Reaco, semelhante peroxidase, da hemoglobina e mioglobina,
Eritrcitos
catalisa a oxidao do indicador atravs do perxido de hidrognio da

tira.
2.3.2. Turbidimetria
Fundamento
A turbidimetria a medida da diminuio de intensidade de luz incidente causada
pela disperso, reflexo e absoro do feixe de luz de uma dada intensidade. A
turbidimetria baseia-se no facto da quantidade de luz, que atravessa uma soluo de
partculas, diminuir medida que a turvao da soluo aumenta. Esta turvao
medida ao ngulo de 0 em relao luz incidente, tal como na espectrofotometria.
No mbito das anlises clnicas, a turbidimetria usada na quantificao de
imunoglobulinas e algumas protenas atravs da formao de imunocomplexos
insolveis que provocam turvao (imunoturbidimetria). Na quantificao dos
frmacos, molculas mais pequenas que as protenas, usado o imunoensaio
turbidimtrico homogneo do tipo microparticle-enhanced (PETINIA). O ensaio baseiase na competio entre o frmaco presente na amostra e o frmaco a revestir
micropartculas de ltex, relativamente a locais de ligao ao anticorpo. Os
imunocomplexos resultantes da conjugao entre o frmaco das partculas e o anticorpo
formam agregados maiores que os imunocomplexos formados pelo frmaco a analisar,
Relatrio de Estgio
10
Bioqumica Clnica
pelo que a turvao medida inversamente proporcional concentrao do frmaco da
amostra.
Na seguinte tabela encontram-se os parmetros analisados atravs do mtodo da
turbidimetria.
Equipamento
Parmetros
Os parmetros determinados pela metodologia de imunoturbidimetria so os
seguintes:
Em sangue total:
Hemoglobina A1c
Em soro plasma e urina:
2-Microglobulina
Em soro e plasma:
Protena C Reactiva
Transferrina
IgA
IgG
IgM
cido Valprico
Digoxina
Amicacina
Vancomicina
2.3.3. Potenciometria
Fundamento
No Laboratrio de Bioqumica Clnico, a potenciometria indirecta a metodologia
utilizada para determinar a concentrao dos electrlitos (Sdio, Potssio e Cloro) no
soro, plasma ou urina.
A potenciometria a medida do potencial elctrico entre dois elctrodos de uma
clula electroqumica, na ausncia de correntes elctricas apreciveis. O elctrodo de
Relatrio de Estgio
11
Bioqumica Clnica
referncia tem potencial constante, conhecido e insensvel composio da soluo a
analisar e o elctrodo indicador selectivo para o io a analisar. Ambos os elctrodos
esto ligados a um voltmetro, que compara o potencial medido com o potencial do
elctrodo de referncia. O potencial corresponde actividade do io e est directamente
relacionado com a sua concentrao na soluo, sendo expresso pela equao de Nernst.
No mbito das anlises clnicas, so usados elctrodos selectivos de ies (ion
selective electrodes, ISE), que permitem medir o potencial de um nico tipo de io, sem
interferncia dos restantes ies da soluo. Estes elctrodos so constitudos por
membranas de permeabilidade selectiva para a carga e tamanho do io analisar.
Outro equipamento que tem a potenciometria como metodologia o analisador de
pH e gases sanguneos O elctrodo de pH, sendo um ISE, constitudo por uma
membrana de vidro, sensvel e especfica para ies de hidrognio. O sensor de pCO2
trata-se de um elctrodo de pH, revestido por uma soluo de bicarbonato de cloro e
com uma membrana permevel ao CO2 gasoso que separa esta soluo da amostra. Para
alm da potenciometria, o RapidLab 348 tambm utiliza a amperometria na
determinao da pO2. Este equipamento, para alm de medir pH, pCO2 e pO2, calcula
tambm a concentrao de bicarbonato padro e real, excesso de base no sangue e
saturao de oxignio estimado.
Equipamentos
RapidLab 348 de Siemens
Amostra
Soro, plasma, urina (todos os electrlitos) e LCR (Cloro)
Sangue arterial heparinizado (pH e pCO2)
Parmetros
Sdio
Potssio
Cloro
pH
Presso parcial de dixido de carbono (pCO2)
Relatrio de Estgio
12
Bioqumica Clnica
2.3.4. Amperometria
A amperometria uma tcnica electroqumica utilizada para dosear a quantidade de
analito em soluo, atravs da aplicao de uma tenso fixa entre dois elctrodos numa
clula electroqumica, medindo a corrente que a atravessa. Quando a amostra entra em
contacto com os elctrodos, aplicada uma tenso conhecida ao ctodo, elctrodo
medidor. O analisador de pH e gases sanguneos usa esta metodologia para medir a
presso parcial de oxignio em sangue arterial heparinizado. O oxignio dissolvido na
amostra reduzido no ctodo enquanto a prata do nodo oxidada, sendo a quantidade
de oxignio reduzido directamente proporcional ao nmero de electres ganhos no
ctodo. Assim, medindo a alterao da corrente (fluxo de electres) entre o nodo e o
ctodo, determina-se a quantidade de oxignio presente na amostra.
2.3.5. Quimioluminescncia
Fundamento
A quimioluminescncia a designao para a emisso de luz quando um electro
passa de um nvel de energia superior ou excitado para um nvel energtico inferior. A
excitao causada por uma reaco qumica que envolve a oxidao de um composto
orgnico. Num imunoensaio quimioluminescente, uma molcula quimioluminescente
usada como marcador para detectar e quantificar reaces imunolgicas.
No Laboratrio de Bioqumica, muitos dos parmetros so determinados com a
tecnologia
de
imunoensaio
(em
dois
passos)
de
micropartculas
por
quimioluminescncia (CMIA). No primeiro passo ocorre a combinao e incubao

entre as micropartculas paramagnticas revestidas com o anticorpo e o analito da
amostra. Aps lavagem para eliminar o que no ficou ligado, adicionado o conjugado
de anticorpos marcado com derivado de acridnio, formando um complexo sandwich.
Para que haja produo de luz so adicionadas as solues activadora (NAOH) e practivadora (H2O2). A reaco quimioluminescente medida em unidades relativas de
luz (RLUs) em que existe uma relao directa entre a concentrao de antignio na
amostra e as RLUs detectadas pelo fotmetro.
Equipamento
Architect Ci8200 da Abbott
Relatrio de Estgio
13
Bioqumica Clnica
Parmetros
Na tabela seguinte encontram-se os parmetros analisados pela tecnologia CMIA.
Tabela 2-3 Parmetros determinados no laboratrio de Bioqumica, por quimioluminescncia, bem como o
respectivo equipamento e metodologias
Parmetro
Amostra
CEA
Soro e plasma
CA 125
Soro e plasma
CA 19-9
Soro e plasma
CA 15-3
Soro e plasma
SCC
Soro e plasma
AFP
Soro, plasma e lquido amnitico
PSA Total
Soro
Ciclosporina
Sangue total
Tacrolimus
Sangue total
Vitamina B12
Soro e plasma
cido flico
Soro, plasma e sangue total
Ferritina
Soro e plasma
Troponina I
Soro e plasma
CK- MB
Soro e plasma
2.3.6. Imunoensaio enzimtico homogneo competitivo

Fundamento
O imunoensaio enzimtico homogneo competitivo baseia-se na competio entre o
frmaco presente na amostra e o frmaco exgeno marcado com a enzima glucose-6fosfato desidrogenase (G6PDH) relativamente a locais de ligao ao anticorpo
(anticorpos monoclonais de ratinho anti-frmaco).
Uma vez que a actividade da G6PDH diminui medida que o frmaco da amostra se
une aos anticorpos, a concentrao do frmaco na amostra pode ser quantificada em
termos de actividade enzimtica. A G6FDH activa converte o NAD em NADH
originando uma alterao na absorvncia, medida espectrofotometricamente.
Relatrio de Estgio
14
Bioqumica Clnica
Equipamento
Architect Ci8200 da Abbott
Amostra
Soro e plasma
Parmetros
Carbamazepina
Fenitona
Fenobarbital
Teofilina
2.3.7. Imunoensaio de Fluorescncia Polarizada

Fundamento
O imunoensaio de fluorescncia polarizada (FPIA) trata-se de um imunoensaio de
fluorescncia competitivo homogneo em que o analito (Ag) compete com o antignio
marcado com fluorescena (Ag-F), pelos locais de ligao ao anticorpo (Ac). Este
imunoensaio depende do tamanho molecular, ou seja, quanto maior a molcula, menor
a sua rotao, pelo que a luz absorvida emitida no mesmo plano, ocorrendo
polarizao. No caso de a amostra conter baixa concentrao de analito, h alta
concentrao do complexo Ac-Ag-F e a polarizao alta. Se a amostra contm alta
concentrao de analito, h baixa concentrao do complexo Ag-F-Ac e a polarizao
baixa. Neste imunoensaio, o sinal (luz polarizada) inversamente proporcional do
analito na amostra.
Equipamento
TDxFLx da Abbott
Amostra
Soro e plasma
Relatrio de Estgio
15
Bioqumica Clnica
Parmetros
Metotrexato
2.4. Interesse Clnico

2.4.1. Electrlitos e Ies
Electrlitos e ies so pequenas partculas carregadas positivamente, caties ou
negativamente, anies. Estas partculas so encontradas em todos os fluidos, quer intra
ou extracelularmente. So responsveis pela manuteno da presso osmtica,
homeostase e so importantes em muitos processos metablicos.
Electrlitos
Os electrlitos ajudam no equilbrio hdrico e cido-base do corpo. Normalmente, a
determinao de electrlitos como sdio, potssio e cloro pedida numa s anlise
ionograma - para avaliar o balano electroltico geral. O ionograma importante em
casos como edema, fraqueza, confuso, arritmias cardacas, presso sangunea elevada,
insuficincia cardaca, doena heptica e renal.
Na tabela 2-7, encontra-se uma breve descrio de cada electrlito, os intervalos de
referncia para adultos e as diversas situaes patolgicas.
Tabela 2-4 Descrio, intervalos de referncia e situaes patolgicas dos electrlitos determinados no
laboratrio.
Parmetro
Descrio
Valores elevados () e valores

baixos ()
Principal catio extracelular responsvel por

manter a distribuio normal de gua e - Desidratao, Sndrome de
Sdio
presso osmtica no compartimento de Cushing, Diabetes insipidus.

fludo extracelular. Os seus nveis no sangue - Diarreia e vmitos, Doena
so controlados pela excreo e reabsoro de Addison, doena renal.
nos rins.
- Choque, falha circulatria,
Principal catio intracelular responsvel pela doena renal.
Potssio
contraco muscular e por manter o - Diarreia e vmitos, uso de

batimento cardaco normal.
medicamentos
diurticos,
alguns cancros.
Relatrio de Estgio
16
Bioqumica Clnica
Principal
anio
extracelular.
Mesmas
funes que sdio. Juntamente com o sdio

Cloreto
um constituinte osmoticamente activo, por

isso, alteraes nas suas concentraes
reflectem alteraes nas concentraes do
- Desidratao.
- Valor baixo de sdio no
sangue, vmitos.
sdio.
Gasimetria arterial
A gasimetria arterial uma anlise clnica que determina o pH e as concentraes de
oxignio, dixido de carbono e, assim, determina o equilibro cido-base. Esta anlise
importante, por exemplo, na monitorizao de terapia em pacientes com respirao
assistida, em que administrada uma mistura de gases cujas quantidades dependem dos
resultados desta anlise. Na tabela seguinte encontram-se descritos os analitos
determinados na gasimetria arterial, a razo para a sua determinao e os respectivos
valores de referncia.
Na tabela 2-8, encontra-se uma breve descrio de cada parmetro determinado na
gasimetria.
Tabela 2-5 Descrio, determinao e valores de referncia dos analitos determinados na gasimetria arterial.
Parmetro
pH
Descrio
O pH exprime a actividade dos ies de hidrognio numa soluo. Permite a
deteco de desequilbrios cido-base.
O dixido de carbono produzido durante o metabolismo celular e
libertado no sangue, onde transportado para os rins e pulmes para ser
pCO2
excretado. Transportado sob a forma de bicarbonato (HCO3-), CO2

dissolvido e cido carbnico (H2CO3). Juntamente com o pH constitui uma
ferramenta de diagnstico na avaliao da funo respiratria
A pO2 exprime a eficcia das trocas de oxignio nos pulmes; depende da
pO2
presso parcial de oxignio no alvolo, capacidade de difuso pulmonar

desse gs, existncia de Shunt anatmicos e da relao ventilao/perfuso
pulmonar. Permite a avaliao do grau de hipoxmia.
Bicarbonato
Principal anio com poder tampo. Manuteno do nvel de pH no sangue.
Relatrio de Estgio
17
Bioqumica Clnica
Parmetro
Descrio
[HCO3-]
Juntamente com os valores de pH, podem ajudar a determinar se os
(calculado)
Excesso de
Base
desequilbrios de acidose ou alcalose so de origem metablica

O excesso de base uma expresso emprica que permite estimar o nmero
de equivalentes de bicarbonato de sdio ou de cloreto de amnio
necessrios para corrigir o pH do paciente para o normal.
Na tabela seguinte encontram-se descritas as vrias situaes que podem levar a

acidose ou alcalose respiratria e acidose ou alcalose metablica
Tabela 2-6 Situaes de desequilbrio cido-base
Situaes
Acidose
respiratria
Alcalose
respiratria
Problemas respiratrios que levem reteno

de CO2 Hipoventilao
Perda excessiva de CO2 - Hiperventilao
Acidose
Diabetes,
metablica
diarreia.
Alcalose
metablica
Insuficincia
cardaca,
renal,
Perda lquida de ies H+, por exemplo,

vmitos
pCO2
pH
[HCO3-]
Normal
Normal
Normal
Normal
Outros ies
Muitos outros ies, no fazendo parte do ionograma, so testes comuns no mbito
das anlises clnicas uma vez que tambm eles fazem parte de muitos tecidos e funes
metablicas.
Na Tabela 2-7, encontra-se uma breve descrio de cada io e as diversas situaes
patolgicas.
Relatrio de Estgio
18
Bioqumica Clnica
Tabela 2-7 Descrio, objectivo da sua determinao, valores de referncia e situaes patolgicas dos produtos
dos ies.
Parmetro
Valores elevados () e valores baixos
Descrio
()
Mineral necessrio na formao do

Clcio
osso e coagulao do sangue;

importante na funo nervosa e
muscular.
ingesto excessiva de vitamina D.

- Hipoparatiroidismo, deficincia de
vitamina D, doena renal crnica,
pancreatite.
Mineral importante no metabolismo

sseo, produo de energia e
Fsforo
- Hiperparatiroidismo, alguns cancros,
funo nervosa e muscular. Ajuda

no diagnstico de problemas do
metabolismo do clcio
- Insuficincia renal, overdose de

vitamina D, alto consumo de fosfato.
- Uso excessivo de diurticos ou
anticidos, hiperparatiroidismo.
Mineral essencial para a actividade

de muitas enzimas, principalmente,
Magnsio
as que convertem energia em

funo muscular. Importante na
estrutura
ssea.
follow-up
de
- Doena renal, desidratao severa.

- M absoro, pancreatite, diarreia,
alcoolismo.
valores baixos de clcio e potssio.
Ferro
Componente
importante
hemoglobina
da - Transfuses sanguneas mltiplas,
mioglobina. injeces
de
ferro,
hemocromatose
Componente de muitas enzimas hereditria.

envolvidas
energtico.
no
metabolismo - Dieta pobre em ferro, perda de

sangue.
2.4.2. Metabolitos
A formao e degradao de molculas biolgicas so o centro da vida, pois todo o
ser vivo usa molculas como fontes de energia, na formao de clulas e tecidos e como
sensores metablicos no controlo dos metabolismos. Por dia, milhares de molculas so
formados e degradados nos processos metablicos. O interesse clnico destas molculas
deve-se ao facto de reflectirem o estado nutricional, a eliminao dos produtos residuais
e o controlo metablico.
Relatrio de Estgio
19
Bioqumica Clnica
Metabolismo energtico
Na tabela seguinte encontram-se descritos produtos do metabolismo energtico e as
respectivas situaes patolgicas cujos valores podem elevados e baixos.
Tabela 2-8 Descrio, objectivo da sua determinao, valores de referncia e situaes patolgicas das
molculas participantes no metabolismo energtico.
Parmetro
Valores elevados ()
Descrio
e valores baixos ()
A principal fonte de energia de muitos tecidos;

Glucose
regulada
pela
insulina,
cortisol
glicognio.
Determinado na prova de tolerncia glucose para

diagnstico de diabetes.
- Diabetes, Doena
de Cushing, stress.
Excesso
insulina,
de
fome,
insuficincia adrenal
Molcula de hemoglobina ligada covalentemente a

HbA1c
uma molcula de glucose. Nos doentes diabticos, d

uma estimativa do controlo da glucose at 3 meses
- Diabetes
depois. (tempo de vida de um glbulo vermelho)

Necessrio para a funo do glbulo vermelho.
Vitamina
B12
Importante
na
funo
nervosa.
Permite
Algumas
a leucemias.
identificao de deficincia quando a concentrao - M nutrio, m

de ferro baixa e h presena de glbulos vermelhos absoro,
grandes (anemia macroctica)
anemia
perniciosa.
Necessrio para a funo do glbulo vermelho;

importante na diviso celular; muito importante no - Anemia perniciosa.
cido
flico
desenvolvimento do feto. Deficincia pode causar - M nutrio, m

defeitos no tubo neural. Medido juntamente com absoro
vitamina B12 para determinar a causa da anemia doena
(exemplo:
celaca
macroctica; monitorizao da terapia para baixar os alcoolismo)

valores de cido flico.
Produtos de degradao
Na tabela seguinte encontram-se descritos produtos de degradao e as respectivas
situaes patolgicas cujos valores podem elevados e baixos.
Relatrio de Estgio
20
Bioqumica Clnica
Tabela 2-9 Descrio, objectivo da sua determinao, valores de referncia e situaes patolgicas dos produtos
de degradao.
Parmetro
Descrio
Produto proveniente da destruio da
hemoglobulina, excretado pelo fgado para
Bilirrubina
total
a blis. A bilirrubina libertada para o

sangue na forma livre ou glicuroconjugada.
Determinada para a avaliao da funo
heptica.

baixos ()
- Hepatite, cirrose, doenas
hemoltica (ex:
incompatibilidade fetomaternal), obstruo dos ductos
hepticos e biliares.
Hidrossolvel, excretado pelo sistema

Bilirrubina
biliar para o intestino onde metabolizada
- Obstruo dos ductos
directa
a estercobilinognio. Permite a avaliao
hepticos e biliares, Sndrome
(conjugada)
da capacidade do fgado para conjugar a
de Dubin-Johnson
bilirrubina e excret-la.
Produto proveniente da degradao das
cido rico
purinas e excretado pelos rins. Permite a

avaliao da inflamao da articulao.
- Gota, doena renal,

leucemia.
- Disfuno renal devido a:
Creatinina
Produto proveniente da degradao no
toxicidade por frmacos,
msculo da creatina; excretada pelos rins.
diabetes mal controlada ou
Permite avaliao da funo renal,
fluxo sanguneo insuficiente
monitorizao do tratamento para doena
nos rins devido a choque ou
renal.
insuficincia cardaca
congestiva.
Ureia
Produto proveniente da degradao
- Disfuno renal, stress,
proteica, formado no fgado e excretado
dieta rica em protena.
pelos rins. Determinada juntamente com a
- Dieta pobre em protena,
creatinina para avaliar a funo renal.
doena heptica.
Relatrio de Estgio
21
Bioqumica Clnica
2.4.3. Protenas
As protenas so macromolculas polmeros formados por aminocidos essenciais
que fazem parte de todas as clulas, fluidos e rgos.
As protenas que so o foco da Bioqumica so aquelas que circulam no sangue:
protenas do plasma, protenas de transporte, protenas do sistema imunitrio, enzimas e
protenas da coagulao. Contudo, existem outras protenas que tm, principalmente,
funes intracelulares e por isso, a sua presena no sangue pode reflectir algum dano
celular.
Protenas de transporte e gerais

Na tabela seguinte encontram-se descritas as vrias protenas de transporte e gerais
determinadas no laboratrio, bem como as razes da sua determinao, intervalos de
referncia para adultos e situaes patolgicas.
Tabela 2-10 Descrio, objectivo da sua determinao, valores de referncia e situaes patolgicas das
protenas de transporte e gerais.
Parmetro
Valores elevados () e
Descrio
valores baixos ()
Medio da quantidade de protenas, - Desidratao, infeces,

Protenas totais principalmente albumina e globulinas, no alguns cancros como os
soro ou plasma.
mielomas e linfomas.
Normalmente o valor de protenas na urina

Protenas
muito baixo. Determinada para avaliao
urinrias
da funo renal e monitorizao de

frmacos nefrotxicos.
Insuficincia
(sndrome
renal
nefrtico),
diabetes
Maior protena do sangue. Forma-se no - Desidratao, infeco.

liga-se
transporta
muitas - Jejum, queimaduras,
Albumina,
fgado,
soro/plasma
substncias. Indicador de estado de sade e doena

nutricional.
renal,
doena
heptica.
A albumina uma protena muito grande

Albumina
para passar do plasma para a urina. A sua
urinria
presena na urina indica algum problema
- Doena renal.
na filtrao glomerular do rim.
Relatrio de Estgio
22
Bioqumica Clnica
Parmetro
Descrio
valores baixos ()
A -2 M constitui a cadeia leve dos HLA
Alguns
de classe I. Exprime-se em todas as clulas mielomas,

-2microglobulina
e encontram-se em todos os lquidos das clulas B, infeces por

biolgicos: soro, saliva, sinovial, LCR e CMV e VIH, lpus, doena
mielomas.
maioritariamente
Sndrome
Excesso
intracelular. inflamao,
de
de
ferro,
transfuses
Normalmente testado com o ferro e sanguneas mltiplas

transferrina para avaliar o status do ferro.
Principal protena transportadora de ferro;
formada no fgado. Permite a avaliao no
status do ferro
Capacidade
Crohn,
Sjogren
Protena de armazenamento do ferro,
Transferrina
leucemias
nucleadas, particularmente nos linfcitos B linfides crnicas, linfomas
urina. Determinada para monitorizao de de
Ferritina
cancros,
- Deficincia em ferro.
Anemia
hemoltica,
anemia perniciosa, hepatite.

- Deficincia em ferro,
infeco, doena heptica.
Capacidade de reserva da transferrina para
latente da
transporte adicional de ferro. Determinada - Tratamento de excesso
fixao do
para monitorizao do tratamento da de ferro
ferro (UIBC)
Protena C
Reactiva
(PCR)
toxicidade do ferro
Protena produzida como resposta a uma - Infeco ou processo
infeco ou processos inflamatrios
Protenas
intracelulares
principalmente
Troponina I
no
inflamatrio.
encontradas
msculo
cardaco;
libertadas quando h danos nas clulas - Enfarte do miocrdio

cardacas. Auxilia o diagnstico de um
ataque cardaco (enfarta do miocrdio)
Imunoglobulinas
As imunoglobulinas so anticorpos essenciais na defesa do organismo contra
substncias estranhas. A defesa ocorre atravs do reconhecimento das estruturas
Relatrio de Estgio
23
Bioqumica Clnica
antignicas especficas nas protenas, vrus ou bactrias. O reconhecimento e ligao
das imunoglobulinas a estas estruturas desencadeiam uma srie de reaces (resposta
imunitria) com o objectivo de destruir o antignio.
As imunoglobulinas podem ser designadas de monoclonais ou policlonais.
Imunoglobulinas monoclonais so produzidas por uma nica linha de clulas T e tm
exactamente a mesma composio qumica, sequncia e estrutura. Imunoglobulinas
policlonais a designao para agregados de imunoglobulinas monoclonais produzidas
por diferentes linhas de clulas T. Nveis elevados de imunoglobulinas policlonais
ocorrem em infeces e inflamaes, reflectindo uma resposta imune mais ampla;
enquanto nveis elevados de imunoglobulinas monoclonais so encontrados em
situaes como mieloma mltiplo, Macroglobulinmia de Waldenstrom e alguns
linfomas.
Na tabela seguinte encontra-se a descrio das imunoglobulinas.
Tabela 2-11 Descrio e intervalos de referncia das imunoglobulinas estudadas no laboratrio.
Parmetro
Descrio
IgA
Protege as membranas mucosas; encontrada na saliva, lgrimas e suor.

Constitui cerca de 10-15% das imunoglobulinas do sangue.
IgG
Confere imunidade a longo prazo; atravessa a placenta para dar

proteco passiva ao feto. Constitui 75-80% das imunoglobulinas do
sangue.
IgM
IgM a imunoglobulina maior e a primeira a formar-se em resposta a

uma infeco; responsvel por activar factores do complemento para
destruir invasores. Constitui cerca de 10-15% das imunoglobulinas do
sangue.
Enzimas
As enzimas so protenas que catalisam reaces qumicas sem sofrerem degradao
ou alteraes. No corpo humano actuam principalmente dentro das clulas e so
responsveis por regular as reaces metablicas. A sua presena no sangue pode ser
ento resultado da fuga de enzimas da clula causada por dano celular.
Na tabela seguinte encontra-se descrito o significado clnico de cada enzima e as
respectivas situaes patolgicas.
Relatrio de Estgio
24
Bioqumica Clnica
Tabela 2-12 Descrio, objectivo da sua determinao, valores de referncia e situaes patolgicas de enzimas.
Parmetro
ALT
baixos ()
Principalmente encontrada no fgado.

Permite a avaliao da doena heptica.
Grande
AST
Descrio
parte
presente
no
fgado,
corao e msculo esqueltico. Permite

a avaliao da doena heptica.
Encontrada nos ossos, intestino, rins e
ALP
fgado. Permite a avaliao de doenas

sseas e hepticas
GGT
- Hepatite, cirrose, Sndrome de

Reye, hepatoma, dano heptico
induzido por drogas.
- Doena heptica, ataque
cardaco, trauma.
- Doena heptica, ssea e em
perodos de crescimento sseo.
- Baixo fosfato, hipotiroidismo,
anemia perniciosa.
Presente no fgado e noutros tecidos. - Obstruo biliar, doena

Indicador desordem heptica
heptica alcolica
Grande parte distribuda por tecidos

como corao, pulmes, fgado, rins,
LD
msculo esqueltico. Existe em 5

formas, de LD-1 a LD-5, predominando
diferentemente pelos tecidos. Indicador
- Ataque cardaco, doena

heptica, pulmonar, trauma
- Deficincia em ferro.
geral do dano tecidular

Enzima do msculo. Diferentes formas
da
enzima
so
especficas
para
diferentes tipos de tecido. CK-BB - Dando muscular, exerccio

CK
encontrada principalmente no tecido e extremo, trauma.

tecido neurolgico; CK-MB no tecido - Baixa massa muscular.
cardaco; CK-MM no tecido muscular.
Indicador de dano muscular.
Enzima
Amilase
digestiva
segregada
pncreas,
glndulas
responsvel
pela
pelo
salivares; - Pancreatite aguda, ductos
degradao
de pancreticos bloqueados.
triglicridos. Auxilia no diagnstico da -Algumas doenas hepticas.

pancreatite,
Relatrio de Estgio
25
Bioqumica Clnica
Marcadores tumorais
Os marcadores tumorais so protenas selectivamente produzidas e libertadas por
clulas tumorais mas no, normalmente, por clulas normais. O seu interesse clnico
deve-se ao facto de poderem ser usados para rastreio, auxlio no diagnstico,
determinao da fase da doena, monitorizao da terapia e previso da recada.
Contudo, nem todos os marcadores tumorais podem ser, por exemplo, utilizados no
rastreio de populaes, pelo que a maioria usado principalmente para monitorizao
da teraputica e previso da recada.
Na tabela seguinte encontra-se descrito o significado clnico de marcador tumoral,
tipos de cancro em que est presente, razes da sua determinao, valores de referncia
para adultos.
Tabela 2-13 Descrio de marcadores tumorais, objectivo da sua determinao, valores de referncia e tipos de
cancro em que esto presentes
Parmetro
Cancro em que
Descrio e utilidade
est presente.
Glicoprotena, encontrada no citoplasma das clulas

PSA
epiteliais dos ductos da glndula prosttica. Rastreio de

doentes assintomticos; Confirmao de diagnstico;
Prstata
Monitorizao de terapia; Previso de recada.
CEA
Glicoprotena normalmente encontrada nas clulas
Colorectal, tracto
epiteliais embrionrias e fetais. Monitorizao de
gastrointestinal,
tratamento; Preveno de recada.
pulmo, mama
Antignio glicoproteico de superfcie do tipo mucinoso

CA 125
encontrado nos epitlios fetais e no epitlio brnquico.

Confirmao
de
diagnstico;
Monitorizao
de
tratamento; Preveno de recada.
Ovrios e
Carcinoma do
endomtrio
Antignio glicoproteico do tipo mucina, produto do

CA 15-3
gene MUC-1. Determinao da fase da doena.
Mama, ovrios
Monitorizao do tratamento. Determinao de recada.

Antignio glicolipdico encontrado nos epitlios do
CA 19-9
tracto gastrointestinal fetal em muitas clulas de

mucosas do adulto. Monitorizao de tratamento.
Pncreas, clon
Preveno de recada.
Relatrio de Estgio
26
Bioqumica Clnica
Parmetro
SCC
Descrio e utilidade
Cancro em que
est presente.
Glicoprotena, fraco do TA-4, molcula descoberta a
Pele, esfago,
partir do cancro do colo do tero. Monitorizao de
bexiga, prstata,
tratamento
pulmes, etc.
Glicoprotena sintetizada no fgado, saco embrionrio e

AFP
tracto gastrointestinal fetal. Substitui a albumina na
Fgado, ovrios,
manuteno da presso osmtica. Monitorizao do
testicular
tratamento. Preveno de recada.
2.4.4. Lpidos e Lipoprotenas

Os lpidos so biomolculas constitudas por carbono, hidrognio e oxignio,
caracterizadas como insolveis em gua e solveis em solventes no polares como o
lcool. As lipoprotenas so complexos de lpidos-protenas nos quais os lpidos so
transportados na corrente sangunea. No mbito das anlises clnicas, os lpidos e as
lipoprotenas so principalmente usados como indicadores do risco de doena
cardiovascular. Alguns destes parmetros podem estar elevados como resultado de
doenas como hipotiroidismo, diabetes ou doena renal, pelo que a interpretao dos
resultados das anlises tem que ter em conta vrios factores a fim de evitar tratamentos
desnecessrios.
Na tabela seguinte encontra-se descrito o significado clnico dos lpidos e
lipoprotenas.
Relatrio de Estgio
27
Bioqumica Clnica
Tabela 2-14 Descrio, objectivo da sua determinao, valores de referncia e situaes patolgicas para os
lpidos e lipoprotenas.
Parmetro
Descrio
baixos ()
Lpido esteride importante, formado

Colesterol
total
no fgado e usado na produo de

hormonas
esterides
paredes
celulares.
Hipotiroidismo,
diabetes
descontrolado, doena renal.

- Doena heptica, fome, anemia.
HDL remove o excesso de colesterol

do tecido para o disponibilizar; HDL
Colesterol
HDL
elevado
tem
sido
associado
proteco contra a doena da artria

coronria. til na avaliao do risco
Terapia
de
estrognios,
consumo de lcool.
- Tabaco
cardiovascular.
LDL transporta o colesterol do
fgado para o tecido perifrico. LDL - Dieta rica em gordura saturada,
Colesterol
LDL
contribui para a formao de placas desordens
hereditrias
do
que entopem artrias e levam metabolismo do colesterol.

doena cardaca coronria. til na - Alto consumo de fibras.
avaliao do risco cardiovascular.
Forma qumica dos cidos gordos
Triglicridos
para o transporte e armazenamento

no tecido adiposo. til na avaliao
do risco cardiovascular.
- Hipotiroidismo, alcoolismo,
doena
heptica,
diabetes
descontrolado.
2.4.5. Monitorizao de Frmacos

O conhecimento dos nveis de certos frmacos no sangue crucial para o controlo do
tratamento de certas doenas para evitar problemas de toxicidade ao nvel renal ou
heptico.
Os frmacos a monitorizar so aqueles que tm uma janela teraputica estreita, ou
seja, um intervalo de concentraes estreito no qual o frmaco activo, eficiente sem
provocar toxicidade. A determinao dos nveis destes frmacos requerida quando
esperado que se tenha atingido a concentrao mxima srica e quando se espera ter
Relatrio de Estgio
28
Bioqumica Clnica
atingido a mnima, normalmente, imediatamente antes de ser administrada a prxima
dose.
A determinao dos nveis dos parmetros da tabela. Permitem ento ao mdico
seguir o tratamento, ajustando-o s necessidades do paciente.
Na tabela seguinte encontra-se descrito a aco de cada frmaco e o intervalo
teraputico a ter em conta.
Tabela 2-15 Intervalo teraputico e respectivo objectivo dos vrios frmacos avaliados na monitorizao
teraputica.
Parmetro
Aco
cido Valprico
Tratamento de convulses
Amicacina
Antibitico
Carbamazepina
Controlo de convulses
Ciclosporina
Imunossupressor
Digoxina
Fenobarbital
Fenitona
Tratamento de fibrilhao auricular

crnica e insuficincia cardaca.
Sedativo e tratamento de epilepsia
Tratamento de arritmias ventriculares
e convulses
Tacrolimus
Imunossupressor
Teofilina
Antiasmtico
Vancomicina
Antibitico para tratar infeces

resistentes a outros antibiticos
2.4.6. Urina tipo II

O exame urina tipo II implica um exame fsico-qumico e microscpico da,
preferencialmente, primeira urina da manh.
O exame fsico-qumico da urina usado com os seguintes objectivos:
Identificar sintomas de doena renal e do tracto urinrio. Parmetros de
diagnstico:
Leuccitos
Nitritos
Protena
Relatrio de Estgio
29
Bioqumica Clnica
Eritrcitos
pH.
Identificar sintomas de desordens do metabolismo dos carbohidratos (diabetes
mellitus). Parmetros de diagnstico:
Glucose
Cetonas
Identificar sintomas de doenas hepticas e hemolticas. Parmetros de
diagnstico:
Urobilinognio
Bilirrubina.
Monitorizao de tratamento. A monitorizao de tratamento atravs das tiras de
teste permite que o clnico siga os resultados da terapia e, caso necessria, introduza
alteraes na estratgia teraputica.
Exame fsico
No exame fsico da urina tipo II so avaliados aspecto, cor e odor.
O aspecto pode variar entre lmpido, ligeiramente turvo ou muito turvo ou leitoso e
pode dever-se presena de eritrcitos, leuccitos, bactrias ou cristais
A cor da urina pode variar entre transparente e preta. Na tabela seguinte encontramse algumas causas e associaes clnicas para as diferentes cores que a urina pode
apresentar.
Tabela 2-16 Causas e associaes clnicas das diferentes coloraes que a urina pode apresentar.
Cor
Causa
Associao clnica
Poliria
Diabetes mellitus
Bilirrubina
Bilirrubinemia
Hemoglobina; Mioglobina
Hemoglobinria; Mioglobinria
Vermelha
Porfirinas
Porfiria
Verde
Blis
Sem cor ou
amarelo plido
Laranja
Castanho
avermelhado
Relatrio de Estgio
30
Bioqumica Clnica
Cor
Preta
Causa
Associao clnica
Hemoglobina; Melanina;
Hemlise massiva no caso da malria;
Homogentisato
Melanoma; Alcaptonria
O odor da urina tambm pode variar com o estado de sade do doente. A ttulo de
exemplo, uma urina com odor doce/frutado deve-se presena de cetonas e
caracterstica de doentes com diabetes mellitus.
Exame Qumico
Na seguinte tabela encontram-se descritos os vrios parmetros avaliados no exame
qumico da urina tipo II.
Tabela 2-17 Parmetros analisados no exame qumico da urina tipo II, factores de influncia e interferncia,
significado clnico e intervalo de referncia.
Parmetros
Factores de influncia e
Significado clnico
interferncia
cido
acidose
diabtica,
jejum,
insuficincia renal, acidose tubular renal,

pH
- Dieta pobre em carne;
acidose respiratria.
- Dieta vegetariana
Alcalino vmitos, deficincia severa de

potssio,
diurticos,
infeco
do
tracto
urogenital.
- Forte cor da urina,
alguns antibiticos.
Leuccitos
- Altos valores de
glucose e de protenas.
Alguns antibiticos.
Nitritos
Protena
Glucose
- Presena de bactrias.
- cido ascrbico.
Infeces bacterianas, a leveduras fungos,

vrus
nefropatias
parasitas;
causadas
glomerulopatites,
por
analgsicos,
intoxicaes.
Infeco bacteriana do tracto urinrio
- Actividade fsica; Doenas renais (pouco especfico, fazer

gravidez
idosos.
Relatrio de Estgio
Gravidez;
diagnstico diferencial)
febre; Diabetes mellitus (ajuda no diagnstico e
monitorizao)
31
Bioqumica Clnica
Parmetros
Factores de influncia e
Significado clnico
interferncia
- Bactrias
Corpos
Cetnicos
Urobilinognio
Bilirrubina
Eritrcitos
Fenilcetonas,
ftalenas, compostos de
enxofre, jejum, febre.
- Forte cor da urina.
- Luz
lipognese,
descompensao
metablica em diabetes mellitus

Distrbio da funo heptica; aumento da
degradao da hemoglobina devido a doena
hemoltica primria ou secundria.
- Luz, cido ascrbico.
Liplise,
Menstruao,
actividade fsica
Aumento de presso intracanalicular devido a

obstruo intra ou extraheptica.
Glomerulonefrite; clculo urinrio; cistite;
pielonefrite; carcinoma da bexiga; adenoma
da prstata; tumor renal.
Exame microscpico/sedimento urinrio

Eritrcitos
Discos redondos sem ncleo, com dupla margem. Mais de 30% de eritrcitos
dismrficos indicam origem glomerular.
Figura 2-1 Vrios tipos de eritrcitos dismrficos (x1000)
Relatrio de Estgio
32
Bioqumica Clnica
Leuccitos
Os leuccitos presentes na urina so maioritariamente granulcitos Intervalo de
referncia: 0-5/campo.
Figura 2-2 Leuccitos, eritrcitos e bactrias (x1000)
Clulas epiteliais pavimentosas
Clulas epiteliais escamosas so de origem uretral ou genital externa e so

consideradas contaminao.
Clulas epiteliais transicionais so mais pequenas que as anteriores provm de

tracto urinrio eferente.
Clulas epiteliais renais so distinguidas pelo seu grande ncleo redondo,

provm dos tubulos encontram-se muitas vezes junto de leuccitos. So as
nicas com significado clnico.
Figura 2-3 Clulas epiteliais pavimentosas (x1000)
Cilindros
Cilindros contm protenas e provm dos tbulos renais;
Cilindros hialinos so transparentes, so formaes de protena Tamm-Horsfall,

uma mucoprotena produzida pelos tbulos distais. No tm significado clnico
Normalmente esto presentes na urina a seguir a exerccio fsico, imobilizao
prolongada, febre.
Relatrio de Estgio
33
Bioqumica Clnica
Cilindros granulares presentes normalmente na glomerulonefrite crnica. A

matriz constituda por clulas lisadas e protenas plasmticas.
Cilindros eritrocitrios so constitudos por eritrcitos embebidos numa matriz

homognea. Apontam para uma origem renal de hematria.
Cilindros epiteliais consistem em epitlio tubular descamativo e so indicativo

de necroses tubulares.
Figura 2-4 Cachos de eritrcitos (x1000)
Microrganismos
Bactrias podem ser contaminao mas juntamente com leucocitria so

indicativo de infeco;
Trichomonas melhor observadas a fresco para se observar o seu movimento.
Figura 2-5 Bactria numa clula epitelial pavimentosa. (x1000)
Artefactos
O reconhecimento de artefactos essencial para evitar interpretaes erradas.
Gotas de gordura so contaminao devido a cremes, resduos de supositrios ou

lubrificantes de cateteres.
Cristais so, normalmente, considerados artefactos porque so causados pelo pH

alterado devido refrigerao da urina. Os cristais apenas tm significado
clnico quando so cristais de cistina, leucina e tirosina.
Fungos so contaminao pois as infeces fngicas so raras.
Relatrio de Estgio
34
Bioqumica Clnica
Fibras so contaminantes
2.5. Calibrao
A calibrao trata-se de um procedimento que permite fazer correspondncia entre o
sinal analtico obtido no equipamento, com a concentrao do parmetro. A calibrao
feita atravs da anlise, nas mesmas condies que as amostras, do sinal obtido por uma
srie de solues com concentraes conhecidas de analito. Os resultados so expressos
numa curva de calibrao. Atravs da interpolao (ligao dos pontos atravs de uma
linha de ajuste) da curva estabelecido um sinal esperado para a faixa de concentraes
do analito que se situam entre o calibrador de concentrao menor e maior. Assim, o
sinal obtido pela amostra pode ser comparado com esta curva a fim de se determinar a
sua concentrao.
Os limites inferior e superior da curva dependem das propriedades do mtodo e das
propriedades do equipamento. No entanto, podem ser estabelecidos pelo laboratrio ou
pelo fabricante os limites de deteco pelo que, quando um sinal se encontra fora desses
limites, a concentrao do analito no pode ser determinada com confiana. No entanto,
o resultado pode ser dado como inferior ou superior aos limites mnimo e mximo
mensurveis, respectivamente. Alternativamente, a amostra pode ser diluda para que a
sua concentrao esteja dentro dos limites mensurveis. O valor obtido tem de ser
multiplicado pelo factor de diluio para determinar a concentrao original da amostra.
Nos laboratrios do IPO, a periodicidade da calibrao determinada pelas
especificaes da tcnica, do equipamento e do fornecedor. A calibrao necessria
especialmente em situaes como mudana de lote de reagente, expirao da curva de
calibrao, alterao da tcnica, controlo de qualidade no conforme e quando so
feitos procedimentos de manuteno como a mudana de uma lmpada do equipamento.
A
calibrao
Relatrio de Estgio
encontra-se
ordenada
por
equipamento.
35
Imunologia
3. IMUNOLOGIA
3.1.
Objectivo
O estgio na valncia Imunologia faz parte integrante do plano de estudos do

Mestrado em Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa. O
estgio decorreu no Laboratrio de Imunologia do Servio de Patologia Clnica do
Instituto Portugus de Oncologia de Lisboa, Francisco Gentil sob a orientao da Dr.
Maria Cesaltina Loureno.
O objectivo do presente relatrio apresentar o local do estgio, fazendo referncia
aos parmetros executados, equipamentos utilizados, respectivas metodologias e
controlo de qualidade.
3.2.
Introduo
O Laboratrio de Imunologia est inserido no Servio de Patologia Clnica do IPO e

tem como principais actividades o diagnstico e monitorizao de doenas de
proliferao plasmocitria, patologias autoimunes, avaliao imunitria, serologia
infecciosa, determinao de alguns marcadores tumorais e avaliao proteica de alguns
lquidos biolgicos.
O laboratrio encontra-se organizado nos seguintes sectores:
Imunoqumica nefelometria, electroforese, imunofixao e tcnicas manuais;
Serologia tcnicas manuais, microelisa;
Autoimunidade imunofluorescncia, microelisa e immunoblot;
Marcadores tumorais electroquimioluminescncia.
3.1. Sector de Imunoqumica

3.1.1. Nefelometria
Fundamento
O mtodo de nefelometria, tal como a turbidimetria (explicada no captulo 2) baseiase na turvao provocada pelos imunocomplexos formados entre o analito a estudar e o
anticorpo anti-analito (imunonefelometria). Estes imunocomplexos so capazes de
dispersar ou reflectir a luz incidente para um detector coloca num ngulo diferente da
luz incidente. A intensidade de luz dispersa directamente proporcional da
concentrao de analito existente na amostra e esta determinada por comparao com
Relatrio de Estgio
36
Imunologia
padres de concentrao conhecida. Na tabela seguinte encontram-se as protenas
individuais estudadas no laboratrio de imunologia, tipo de amostra e metodologia
usada.
Equipamento
BN ProSpec (Siemens)
Amostra
Soro, urina, LCR e outros lquidos biolgicos.
Parmetros e interesse clnico

Nas tabelas seguintes encontram-se as protenas determinadas no Laboratrio de
Imunologia por nefelometria e o respectivo interesse clnico, ordenadas por regies da
electroforese do soro.
Tabela 3-1 Interesse clnico protenas da regio da pr-albumina e albumina.
Parmetro
Descrio
(Amostra)
baixos ()
Anti-inflamatrios,
Glicoprotena de transporte de sndrome

Pr-albumina
(Soro)
nefrtico,
stress,
hormonas tiroideias, da protena depresso.

de ligao de retinol (Rbp) e da - Resposta de fase aguda,
vitamina A. Marcador nutricional.
doena heptica, desnutrio

calrico-proteca.
Protena
mais
abundante
do - Desidratao aguda (raro).
plasma. Transporta clcio, cidos - Resposta de fase aguda,

Albumina
(Soro, plasma
ou LCR)
gordos, bilirrubina, hormonas, etc. inflamao,
desnutrio
Contribui para a manuteno da calrico-proteica,

presso
osmtica.
Marcador analbuminmia
nutricional. Reflecte a capacidade doena

de sntese do fgado.
Relatrio de Estgio
heptica,
gentica.,
edema
ascites.
37
Imunologia
Parmetro
Descrio
(Amostra)
baixos ()
Albumina presente na urina. A

Microalbumina
(Urina)
membrana basal do glomrulo - Danos na barreira de

renal no permite normalmente a filtrao glomerular
sua passagem.
Tabela 3-2 Interesse clnico protenas da regio das 1-globulinas.
Parmetro
Valores elevados () e valores baixos
Descrio
(Amostra)
()
Protena (glicoprotena) da
1- antitripsina
(Soro)
fase aguda com actividade

anti-protesica. Inactiva a
elastase e colagenase dos
neutrfilos
- Resposta de fase aguda, doena

heptica, estrognios.
- Deficincia gentica, sndrome do
desconforto
pancreatite
respiratrio
severa,
neonatal,
doenas
que
impliquem perda de protenas.
Glicoprotena da regio 1
sintetizada
1
microglobulina
(Urina)
no
fgado.
Filtrada no glomrulo e
reabsorvida
proximal.
tbulo - Leso tubular, nefropatias.
no
Associada
resposta
imunitria
humoral e celular.
Tabela 3-3 Interesse clnico protenas da regio das 2-globulinas.
Parmetro
Descrio
(Amostra)
baixos ()
Glicoprotena inibidora de
2
proteases.
macroglobulina
hormonas
componentes
do
(Urina)
Transporta
inibe
sistema
complemento e hemostase.
Relatrio de Estgio
- Estrognios.
Pancreatite,
lcera
pptica
coagulao intravascular disseminada,

fibrinlise, resposta de fase aguda.
38
Imunologia
- Resposta de fase aguda (tardia),
Haptoglobulina
(Soro)
Liga-se
transporta
oxihemoglobina
livre
a anti-inflamatrios, stress, depresso,

no sndrome nefrtico.
plasma.
Hemlise
intravascular,
eritropoiese ineficiente, crianas.
Ceruloplasmina
(Soro)
Resposta
de
fase
aguda,
Protena de fase aguda. estrognios.

Principal
de - Doena de Wilson, Sndrome de
protena
transporte do cobre no soro.
Menke,
insuficincia
heptica,
sndrome de perda de protenas.

Tabela 3-4 Interesse clnico protenas da regio das -globulinas.
Parmetro
Descrio
(Amostra)
baixos ()
Forma inactivada de C3b.

O C3 o componente mais - Resposta de fase aguda (tardia),
abundante e est presente obstruo biliar.
nas vias de activao do - Doena autoimune (Lupus
Complemento C3c
(Soro ou plasma)
complemento clssica e eritematoso

alternativa.
sistmico,
Factor glomerulonefrite
aguda
essencial para a lise celular membrano-proliferativa,

mediada
pelo coagulao
LES),
e
spsia,
intravascular
complemento, opsonizao disseminada.

e fagocitose.
Protena
da
regio
Complemento C4
Factor essencial na via de
(Soro ou plasma)
activao do complemento
clssica.
Relatrio de Estgio
- Resposta de fase aguda (tardia).

-. Deficincia gentica (associada a
deficincia de IgA). LES, spsia e
angioedema
hereditrio,
crioglobulinmias.
39
Imunologia
Tabela 3-5 Interesse clnico protenas da regio das -globulinas.
Parmetro
Descrio
(Amostra)
Constitui
cerca
de
valores baixos ()
10-15%
das - Proliferao policlonal ou
imunoglobulinas do soro. Migra na oligoclonal:

IgA (Soro,
plasma)
hepatopatias,
regio -. A IgA secretria (dmero) infeces agudas ou cnicas,

encontrada nas lgrimas, suor, saliva, doenas
leite e secrees gastrointestinais e infeces
auto-imunes,
intra-uterinas
ou
brnquicas. Tem papel antimicrobiano. perinatais (soro do cordo

Existe em 2 subclasses: IgA1 e IgA2.
umbilical).
Primeira imunoglobulina produzida na monoclonal:

IgM (Soro,
plasma)
infeco
primria
Proliferao
plasmocitomas,
terceira macroglobulinemia
de
imunoglobulina mais abundante do Waldenstrom, e a doena das

cadeias
soro. Activa o complemento.
pesadas.
Concentraes aumentadas de
Principal
IgG (Soro,
plasma,
urina)
produzida IgG
imunoglobulina
na
pelas clulas plasmticas. Neutraliza proteinria
urina
indicam
glomerular
no
toxinas, activa o complemento e tem selectiva.

funo antimicrobiana. Encontram-se - Insuficincias imunitrias
caracterizadas 4 subclasses: IgG1, IgG2, secundrias (tumores malignos
avanados, leucemia linftica
IgG3 e IgG4.
ou mieloma mltiplo).
Constitui
IgD (Soro
ou plasma)
apenas
1%
das
imunoglobulinas do soro. Juntamente

com a IgM a principal imunoglobulina - Mieloma de IgD
expressa pelos linfcitos B. Receptor de
antignio da superfcie celular.
Normalmente ligada aos mastcitos
IgE
pelo que a sua concentrao no soro

baixa. IgE responsvel pelo quadro
clnico observado em alergias.
Relatrio de Estgio
- Mieloma de IgE, doenas

parasitrias, imunodeficincias
herdadas.
40
Imunologia
Parmetro
Descrio
(Amostra)
valores baixos ()
As concentraes de protenas sricas

no LCR pelo que a deteco de
IgA, IgG e
variaes
podem
indicar
processos
IgM (LCR)
inflamatrios., perturbaes da barreira
- Sntese intratecal
e sntese de intratecal, usando a relao

LCR/soro para albumina.
Constituintes
da
imunoglobulina.
molcula
Produzidas
de
numa
proporo constante de 2:1. O da

produo de Igs monoclonais ou de
Cadeias
leves livres
cadeias leves livres monoclonais altera

esta
proporo.
Ao
contrrio
das - Gamapatia monoclonal
e ligadas - imunoglobulinas completas, as cadeias (mieloma mltiplo)

e (Soro)
leves livres so filtradas no glomrulo e

reabsorvidas a nvel tubular logo, a sua
presena na urina (protena de Bence
Jones)
indcio
de
gamapatia
monoclonal.
3.1.2. Electroforese
3.1.2.1. Electroforese das protenas sricas
Fundamento
A electroforese uma tcnica que consiste na migrao de partculas ou solutos
carregados, em meio lquido, sob a influncia do campo elctrico. Nesta tcnica, as
protenas carregadas migram em bandas, normalmente num meio de suporte poroso,
como o gel de agarose, depois de a amostra ser misturada com soluo tampo. As
bandas das protenas so quantificadas por densitometria. O fundamento da
electroforese de protenas consiste no facto de as protenas, em soluo aquosa, se
comportarem tanto como cidos ou bases, consoante o pH do tampo. As protenas, em
soluo aquosa, possuem grupos carregados positivamente, (resduos NH3+) e grupos
carregados negativamente (resduos COO-). A pH cido, o excesso de H+ vai impedir a
Relatrio de Estgio
41
Imunologia
dissociao de cido
carboxlico (COOH), mantendo a protena carregada
positivamente, pelo que a sua migrao ocorre para o ctodo. A pH alcalino (o usado)
sai um proto de NH3+ passando a NH2, deixando a protena carregada negativamente,
pelo que a sua migrao ocorre para o nodo. Alm disso, a mobilidade electrofortica,
no s depende da carga mas tambm do peso molecular das protenas, migrando mais
depressa as que tm menor peso molecular. A resoluo da electroforese depende do
potencial elctrico aplicado, temperatura, pH (composio e fora inica de tampo),
tipo de meio de suporte, quantidade e modo de aplicao da amostra e tempo corrida.
Na electroforese de protenas sricas, as protenas so separadas em meio alcalino
(pH 9,1) e coradas com negro de amido, sendo o excesso de corante eliminado em meio
cido. No final obtido um perfil electrofortico (Figura 3-1) das protenas sricas em 5
bandas: albumina, 1-globulinas, 2-globulinas, -globulinas, -globulinas.
Figura 3-1 Perfil electrofortico das protenas sricas.
Amostra
Soro
Equipamento e reagentes
Aplicador de amostras automtico Hydraplus (Sebia);
Aparelho de electroforeses semi-automtico Hydrasis (Sebia);
Densitmetro/scanner com software Phoresis (Sebia);
Relatrio de Estgio
42
Imunologia
Kit HYDRAGEL 54 PROTEIN (E) da Sebia.
Parmetros
As protenas sricas visualizadas e quantificadas por electroforese so:
Albumina;
1-globulinas - 1-antitripsina, 1-glicoprotena cida, 1-fetoprotena;
2-globulinas - 2-macroglobulina, haptoglobulina e ceruloplasmina.
-globulinas transferrina, ferritina, protenas do complemento C3 e C4;
-globulinas imunoglobulinas e protena C reactiva (PCR).
Em soros frescos, poder ser possvel visualizar uma 6 banda junto banda (2) ou
imediatamente antes da banda da albumina, correspondente pr-albumina. A
quantificao relativa (em percentagem) das fraces proteicas feita por densitometria.
Interesse clnico
Na seguinte tabela encontra-se a descrio e interpretao de cada banda visualizada
no gel.
Tabela 3-6 Descrio e interesse clnico de cada banda da electroforese de protenas sricas (Bula).
Banda
Interpretao
Banda homognea e bem definida. Duplicao da banda ocorre no caso
Albumina
de bisalbuminmia, uma condio gentica hereditria. Diminuio da

banda juntamente com diminuio de e aumento de 2 globulinas
poder indicar proteinria selectiva no sndrome nefrtico.
Banda homognea e bem definida. Duplicao pode indicar variante
1-globulina gentica ou componente monoclonal. Aumento da banda juntamente

com 2 sugere reaco de fase aguda.
2-globulina Banda larga e intensa. Variaes associadas reaco de fase aguda.
-globulina
Banda difusa. Protena Bence Jones apresenta mobilidade .
Relatrio de Estgio
43
Imunologia
Banda
Interpretao
Banda difusa com intensidade maior no centro. Um aumento equivale a
hipergamaglobulinmia
policlonal
devido
ao
aumento
de
imunoglobulinas. Vrias bandas finas podem corresponder ao padro

-globulina
oligoclonal transitrio no incio da doena infecciosa. Um aumento

difuso da zona ocorre na cirrose, e uma ligao e cirrose alcolica.
Uma banda fraca no inicio da banda pode corresponder PCR numa
reaco de fase aguda.
3.1.2.2. Electroforese de hemoglobinas

As hemoglobinas (Hb) humanas so tetrmeros constitudos por dois pares de
diferentes globinas (duas do tipo e duas do tipo ). Um adulto normal possui Hb A
(22), Hb A2 (22) e hemoglobina fetal (Hb F) residual (22). No entanto, devido a
mutaes genticas, podem ocorrer variantes estruturais de hemoglobina ou
diminuio/anulao da expresso de um gene. Nas mutaes missense ocorre alterao
estrutural da protena, o que leva a uma variante de hemoglobina, designada de
hemoglobinopatia do tipo qualitativo, como o exemplo das Hb S, Hb C, Hb D. Nas
mutaes frameshift, nonsense e splicing, ocorre ausncia ou diminuio de sntese de
uma cadeia globnica, o que leva a ocorrncia de talassmia, sendo as patologias
designadas de hemoglobinopatias do tipo quantitativo. A persistncia hereditria de
hemoglobina fetal tambm se trata de uma hemoglobinopatia do tipo quantitativo.
Fundamento
A electroforese de hemoglobinas consiste na separao, em meio alcalino (pH 8,5),
das hemoglobinas normais (A e A2) permitindo a deteco das variantes de
hemoglobina (HbS, HbC, HbE e HbD) e das anomalias do tipo talassmia que
apresentam alteraes quantitativas das hemoglobinas normais. A electroforese feita
com hemolisado de eritrcitos. As hemoglobinas so coradas com uma soluo de negro
de amido e o excesso de corante removido com uma soluo de cido. As electroforeses
resultantes so avaliadas por densitometria, o que d uma quantificao relativa e
precisa das hemoglobinas com interesse particular, como o caso da HbA2 no
diagnstico da -Talassmia.
Relatrio de Estgio
44
Imunologia
Na figura seguinte encontram o perfil electrofortico das hemoglobinas que podem
ser visualizadas:
Figura 3-2 Perfil electrofortico das hemoglobinas normais e anormais. A0- fraco no glicosilada da
hemoglobina A normal do adulto. A1- fraco glicosilada da hemoglobina A normal do adulto.
Amostra
Amostras de sangue colhidas com anticoagulante.
Kit HYDRAGEL7 HEMOGLOBIN (E) da Sebia.
Interpretao
Nas tabelas seguintes est descrito o interesse clnico da determinao e
quantificao das hemoglobinopatias qualitativas (tabela 1-7) e hemoglobinopatias
quantitativas (tabela 1-8) estudadas no laboratrio de imunologia.
Tabela 3-7 Descrio e fentipo de algumas hemoglobinopatias qualitativas.
Hemoglobinopatia
Mutao
Fentipo/Patologia
Heterozigotia - indivduos clinicamente
GAG>GTG (cido
Hb S
Glutmico > Valina)

no codo 6 do gene
da -globina
normais;
Homozigotia
anemia
hemoltica
crnica com gravidade varivel: vasoocluses recorrentes, AVC, necrose da

cabea do fmur e hmero, lceras nas
pernas.
Relatrio de Estgio
45
Imunologia
Hemoglobinopatia
Mutao
Fentipo/Patologia
Heterozigotia indivduos clinicamente
normais;
GAA>CAA (cido Homozigotia fentipo clnico suave

Glutmico
Hb D
> devido a uma anemia hemoltica suave.
Glicina) no codo Alguns apresentam esplenomeglia;

121 do gene da - Hb D + -talassmia fentipo de
globina.
talassmia suave a moderada;

Hb D + Hb S - anemia hemoltica
crnica tipo drepanocitose mais suave.
GAG>AAG (cido Heterozigotia fentipo normal ou

Hb C
glutmico > Lisina) ligeira microcitose.

no codo 6 do gene Homozigotia
-globina
anemia
hemoltica
crnica, microcitose
GAG>AAG, (cido
glutmico > Lisina) Heterozigotia
Hb E
Talassmia
com
no codo 26 do gene microcitose e hipocromia.

-globina. Sntese Homozigotia - Anemia moderada com
da
globina
por microcitose e hipocromia acentuadas.
afectar o splicing
Relatrio de Estgio
46
Imunologia
Tabela 3-8 - Descrio e fentipo das hemoglobinopatias quantitativas.
Hemoglobinopatia
Descrio
Fentipo
Talassmia
Sntese deficiente da cadeia

-globina, com reduo de
tetrmero 22. As cadeias
- talassmia
-globina
em
excesso
precipitam nos precursores

eritrocitrios
formando
corpos de incluso.
muito
major
grave,
anemia
eritropoiese
ineficaz.
HbA2
normal
ou
pode
estar
ligeiramente
aumentada.
Talassmia minor geralmente
assintomtico.
hematolgico
Quadro
tpico:
GV,
microcitose, hipocromia, HbA2>

3,5%.
Sntese deficiente da cadeia Deleces:

-globina, com reduo de -/ Assintomtico ou ligeira
tetrmero 22. As cadeias microcitose, hipocromia e Hb A2
em excesso agregam-se normal.
- Talassmia
formando
homotetrmeros --/
Ligeira
anemia,
4 (HbH) que precipitam microcitose e hipocromia e Hb

medida que o eritrcito A2 normal.
envelhece. Anemia devido --/- anemia microctica e
reduo do tempo de vida hipocrmica moderada a grave.
dos eritrcitos.
--/-- - Incompatvel com a vida.
Nveis elevados de Hb F
devido
Persistncia
hereditria de
hemoglobina F
(HPFH)
deleces
nos
genes e -globina ou
mutaes
pontuais
nos
promotores dos genes globnicos,

ligao
impedindo
de
Parmetros
hematolgicos
normais com Hb F aumentada.
factores
silenciadores de expresso
desses genes na vida adulta.
Relatrio de Estgio
47
Imunologia
3.1.3. Imunofixao
3.1.3.1. Imunofixao do soro
Fundamento
A imunofixao executada com o objectivo de identificar as bandas monoclonais
detectadas na electroforese das protenas sricas. Estas bandas, normalmente situadas na
zona ou globinas, correspondem a imunoglobulinas monoclonais, marcadores de
gamapatias (cadeias pesadas (IgG), (IgA) e (IgM) e cadeias leves e (livres e
ligadas)).
A imunonofixao consiste na separao das protenas por electroforese e posterior
fixao com antisoro monospecfico (anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, anti-kappa e antilambda) que depositado directamente sobre a superfcie do gel, ao longo do eixo de
migrao electrofortica, para que ocorra a formao do imunocomplexo. Os complexos
antignio-anticorpo resultantes so retidos na estrutura porosa do gel e corados com
violeta cido, sendo o excesso removido em meio cido. De maneira a identificar de
forma precisa a natureza das bandas monoclonais, as amostras so testadas
simultaneamente em seis pistas. Uma pista usada como referncia (ELP), usando-se
um antisoro poliespecfico de forma a produzir um padro de referncia electrofortico
de protenas enquanto as restantes cinco pistas permitem a caracterizao das bandas
monoclonais graas aos antisoros especficos.A interpretao feita atravs da
observao visual das bandas coradas.
Kit HYDRAGEL 4 IF da Sebia.
Amostra
Soro
Interpretao
As bandas possveis de se observar na imunofixao do soro so:
Ausncia de banda monoclonal - zona corada difusa de imunoglobulinas
policlonais em todas as pistas, sendo caracterstica de um soro normal. Uma
Relatrio de Estgio
48
Imunologia
hipergamaglobulinmia caracterizada por uma zona difusa fortemente corada, sem
apresentar bandas estreitas.
Presena de uma banda monoclonal - Banda estreita detectada com um dos
antisoros anti-cadeias pesadas (, , ) e/ou com um dos antisoros anti-cadeias leves,
ou . A banda monoclonal detectada, geralmente estreita e bem visvel, deve estar
localizada ao mesmo nvel de migrao que a banda presente na pista de referncia
(ELP). Ausncia de reaco com qualquer dos antisoros anti-cadeias pesadas e reaco
com um dos antisoros anti-cadeias leves pode dever-se a:
Presena de uma cadeia leve livre (confirmada com o antisoro anti-cadeias leves
livres);
Gamapatia a IgD ou IgE (confirmada com o antisoro anti-cadeias pesadas e ).
Presena de duas ou mais bandas monoclonais - A presena de duas ou mais

bandas monoclonais pode-se dever a:
Proliferao de vrios clones de clulas B, que se caracteriza pela presena de

duas cadeias pesadas (idnticas ou diferentes) e duas cadeias leves (idnticas ou
diferentes)
Polimerizao de imunoglobulinas em que se verificam vrias bandas na pista de

uma mesma cadeia pesada e na pista de uma mesma cadeia leve (necessrio
despolimerizar e repetir a imunofixao para confirmar a presena de uma
anomalia monoclonal);
Gamapatia oligoclonal caracterizada pela presena de mltiplas bandas de um ou

mais tipos de cadeias pesadas e por um ou dois tipos de cadeias leves.
Casos especiais Uma fraco do tipo monoclonal observada na electroforese do

soro (faixa ELP) mas no confirmada por imunofixao pode dever-se a presena de
fibrinognio. Uma fraco do tipo monoclonal observada em todas as pistas e ao mesmo
nvel pode dever-se a presena de crioglobulina ou de IgM polimerizada.
3.1.3.2. Imunofixao de Bence-Jones

A protena Bence Jones a designao para cadeias leves livres detectadas na urina.
Nas gamapatias monoclonais os plasmcitos neoplsicos podem produzir cadeias leves
livres em grande quantidade. Estas protenas, de baixo peso molecular, tm uma semivida de 2-6 horas e so rapidamente filtradas pelo glomrulo renal e posteriormente
Relatrio de Estgio
49
Imunologia
reabsorvidas pelos tbulos proximais dos nefrnios, s aparecendo na urina quando a
sua quantidade est muito aumentada de forma a saturar os mecanismos de reabsoro.
Fundamento
A imunofixao de Bence-Jones usada para detectar e identificar as protenas
Bence Jones, ou cadeias leves livres monoclonais ( ou ) no soro e urina. O
fundamento idntico ao da imunofixao do soro, diferindo apenas nos antisoros
aplicados que so: antisoro trivalente anti-cadeias pesadas (Ig G), (Ig A) e (Ig M),
anti-cadeias leves e (livres e ligadas), anti-cadeias leves livres e .
Amostra
Soro e urina
Kit HYDRAGEL 4 IF da Sebia.
Interpretao
Os resultados possveis so:
Presena de protena de Bence Jones - banda monoclonal de cadeias leves (livres e
ligadas) ou (pistas K ou L) e outra nas cadeias leves livres (Kf e Lf).
Presena de uma paraprotena do soro eliminada na urina associada protena
de Bence Jones:
Uma banda monoclonal detectada com o antisoro trivalente;
Duas bandas nas cadeias leves (livre e ligada)
Uma banda numa das cadeias leves livres (pista Kf, por exemplo) e outra noutra
cadeia leve livre (Lf) e uma banda detectada por um dos antisoros anti-cadeia
leve livre.
A presena de uma paraprotena do soro na urina, no estando presente uma

protena de Bence Jones - banda monoclonal detectada com o antisoro trivalente; uma
banda monoclonal que migrou ao mesmo nvel da anterior detectada com um dos
Relatrio de Estgio
50
Imunologia
antisoros anti-cadeias leves (livre e ligada) e ausncia de banda na pista do antisoro anticadeia leve livre correspondente.
A presena de uma protena de Bence Jones polimerizada - vrias bandas
reveladas com um dos antisoros anti-cadeias leves livre e ligada ou vrias bandas, que
migram ao mesmo nvel, detectadas com o antisoro anti-cadeia leve livre
correspondente.
3.1.3.3. Imunofixao do LCR

Fundamento
A imunofixao do LCR permite a comparao da migrao electrofortica das IgG,
IgA e IgM e das cadeias leves ligadas e no soro e LCR do mesmo doente e tm
como objectivo pr em evidncia um perfil oligoclonal especfico das imunoglobulinas
do LCR. A tcnica um procedimento de imunofixao realizado com anti-soros antiIgG marcados com uma enzima, aps electroforese em gel de agarose. Um perfil
diferente das imunoglobulinas no LCR e no soro ou a presena de bandas
suplementares, monoclonais ou oligoclonais no LCR, permite concluir que houve uma
sntese intratecal de imunoglobulinas associada na maioria dos casos classe IgG.
A imunofixao do LCR permite o diagnstico de doenas desmileinizantes do SNC,
especialmente a esclerose mltipla.
Kit HYDRAGEL 3 CSF da Sebia.
Amostra
Soro e LCR
Interpretao
Os resultados possveis encontram-se na seguinte figura:
Relatrio de Estgio
51
Imunologia
Figura 3-3 Perfis possveis de imunofixao no soro e LCR. 1- Normal; 2- Esclerose mltipla; 3 Esclerose
mltipla e inflamao cerebral na doena sistmica; 4 Inflamao sistmica; 5- Mieloma ou gamapatia monoclonal.
Adaptado de sebia
3.1.4. Estudo das protenas do LCR

A maioria das protenas do LCR (80%) provm do plasma por ultrafiltrao e as
restantes so sintetizadas de novo pelas clulas dos plexos corides.
A elevao das protenas no LCR pode indicar uma ruptura da barreira hematoenceflica (BHE) e/ou sntese intratecal de imunoglobulinas. A alterao da
permeabilidade da BHE ocorre por exemplo no caso de meningite, encefalite, tumor e
hemorragia intracraniana.. A sntese intratecal de imunoglobulinas ocorre em doenas
do sistema nervoso central (SNC) como a esclerose mltipla, neurosfilis, linfoma, etc.
Para determinar a origem dos nveis elevados de IgG, IgA ou IgM, efectua-se o
doseamento das imunoglobulinas e da albumina, por nefelometria, no soro e LCR e
Relatrio de Estgio
52
Imunologia
calcula-se a razo imunoglobulina/albumina e o ndice de imunoglobulina. Uma vez que
a albumina no produzida no SNC, valores elevados de imunoglobulinas e albumina
indicam leso da BHE e a razo ser semelhante do LCR normal. Pelo contrrio, se
houver produo intratecal, a razo imunoglobulina/albumina encontra-se aumentada.
3.2.
Serologia
3.2.1. Serologia para Salmonella

A Salmonella um bacilo gram negativo, transmitido atravs da ingesto de comida
e gua contaminada, responsvel por intoxicaes alimentares, febres tifides e
paratifides.
A febre tifide causada por Salmonella typhi e as febres paratifides por
Salmonella paratyphi A, B ou C.
O gnero Salmonella subdividido em mais de 1500 sertipos, com diferentes
combinaes de antignios. Os antignios podem ser divididos em dois tipos: somticos
e flagelares. Os antignios somticos so o antignio O, presente em todas as espcies
de Salmonella e o antignio vi, presente apenas na S. typhi e S. paratyphi C. Os
antignios flagelares H esto ligados aos flagelos.
3.2.1.1. Reaco de Widal

Fundamento
No laboratrio de imunologia o diagnstico da febre tifide e paratifide feito
atravs da Reaco de Widal. A tcnica consiste na aglutinao directa em placa entre
antignios somticos (O) e flagelares (H) de Salmonela typhi, grupo D e Salmonella
paratyphi, grupo A e B e as aglutininas do soro do paciente, usando diluies de soro
1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320.
Equipamento/material/reagentes
Teste de antignios febris (BD);
Placas de vidro para tcnicas de aglutinao directa.
Amostra
Soro
Relatrio de Estgio
53
Imunologia
Interpretao
A aglutinao positiva pode ocorrer em pacientes saudveis devido a imunizao
prvia causada por uma infeco do passado ou a presena de antignios relacionados
(reaco cruzada). No entanto, a titulao nestes casos , no geral, menor e sem grandes
variaes. No caso de infeco activa ou imunizao recente, as titulaes detectadas
so mais elevadas e tendem a aumentar, pelo que necessrio avaliar duas ou mais
amostras de soro colhidas em intervalos de 3 a 5 dias do incio da doena. Um aumento
progressivo do ttulo de anticorpos a principal evidncia de infeco activa ou
imunizao recente.
3.2.2. Serologia para Treponema pallidum

A sfilis, infeco sexualmente transmissvel, causada pela espiroqueta Trepronema
pallidum. A infeco , normalmente, adquirida por contacto sexual, podendo tambm
ser transmitida ao feto (infeco congnita) no caso de infeco primria durante a
gravidez. Trata-se de doena de evoluo crnica que se caracteriza pelo aparecimento
de leses granulomatosas ulceradas na pele e mucosas na regio genital, perianal,
inguinal e, eventualmente, noutros rgos internos.
A doena, na ausncia de diagnstico e tratamento, tem a seguinte evoluo: sfilis
primria caracterizada pelo aparecimento de uma leso ulcerada, no dolorosa, de base
endurecida, com secreo serosa escassa (cancro duro); sfilis secundria, em que
predominam as manifestaes sistmicas, que se podem complicar afectando o sistema
nervoso e cardiovascular na fase terciria.
O diagnstico da sfilis pode ser feito atravs da deteco de anticorpos que reagem
in vitro com uma suspenso coloidal de lpidos (mtodos no treponmicos) ou com
antignios de Treponema pallidum (mtodos treponmicos).
3.2.2.1. Testes no treponmicos

Os mtodos no treponmicos so inespecficos e detectam anticorpos IgG e IgM
contra lpidos (cardiolipina, lecitina e colesterol) da superfcie celular de Treponema
pallidum. Os testes mais usados so o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory).
Ambos medem a floculao dos antignios lipdicos com o soro dos doentes infectados.
O RPR utiliza partculas de carvo activado com os antignios adsorvidos levando a
uma reaco visvel a olho nu. Os testes no treponmicos so utilizados na
Relatrio de Estgio
54
Imunologia
monitorizao da eficcia da teraputica com antibiticos e no diagnstico da
neurosfilis. Permitem diagnosticar sfilis apenas a partir da 2 ou 3 semana psinfeco. Podem ocorrer falsos positivos devido ao aparecimento de anticorpos
antilipidicos, em resposta a doenas no treponmicas, pelo que requerem a
confirmao dos resultados pelos mtodos treponmicos. Com estes testes, os resultados
tornam-se negativos 6 a 20 meses aps tratamento eficaz.
3.2.2.2. Testes treponmicos

Os testes treponmicos utilizam como antignio Treponema pallidum, sendo mais
especficos que os anteriores. Os testes usados so o FTA-ABS (Fluorescent
Treponemal Antibody Absortion), o TPHA (Treponema Pallidum Haemaglutination) e a
metodologia imunoenzimtica (ELISA).
O TPHA um imunoensaio, em microplaca, que utiliza as propriedades aglutinantes
especficas dos anticorpos anti-Treponema. A presena de anticorpos anti-Treponema
nas amostras de soro provoca hemaglutinao do reagente revelador (hemcias de
galinha sensibilizadas com antignios de T. pallidum) que se traduz na formao de um
halo mais ou menos alargado de cor vermelho acastanhado que cobre a cpula da placa.
Deste teste podem resultar ocasionalmente falsos positivos, devido a situaes como
toxicodependncia, lepra, mononucleose infecciosa e doenas autoimunes.
O teste ELISA usado para a determinao quantitativa in vitro de anticorpos
IgG/IgM anti-Treponema pallidum em soro ou plasma humano. O teste em tudo
semelhante ao mtodo ELISA explicado noutros captulos.
3.2.2.3. Diagnstico
O diagnstico clnico de Sfilis no deve realizar-se tendo em conta o resultado de
um nico ensaio, mas deve resultar de um conjunto integrado de dados clnicos e
laboratoriais. De acordo com as ltimas guidelines publicadas, o laboratrio de
imunologia estabeleceu o seguinte protocolo para o diagnstico serolgico da sfilis:
Teste de diagnstico
Testes recomendados EIA (IgG e IgM) ou TPHA.
No so recomendados testes no-treponmicos como testes de rastreio devido ao
elevado nmero de falsos negativos associados ao fenmeno pr-zona. O laboratrio
Relatrio de Estgio
55
Imunologia
optou por um teste de MicroElisa (IgG e IgM) por ser sensvel na infeco primria e
automatizado (MAGO da Diamedix).
Teste confirmatrio
Testes recomendados TPHA (Quilaban).
Aps o diagnstico, recomendado como teste confirmatrio, um teste treponmico
diferente do usado no rastreio (de preferncia com sensibilidade semelhante e maior
especificidade).
Monitorizao teraputica
Teste recomendado teste no treponmico semi-quantitativo.
O laboratrio optou pelo teste RPR. O follow-up deve ser feito 1,2,3,6 e 12 meses
aps o incio do tratamento e o ttulo deve diminuir quatro vezes nos primeiros 6 meses
3.2.3. Serologia para Brucella

A brucelose, tambm conhecida por febre do Mediterrneo, febre de Malta, febre de
Gibraltar, febre de Chipre, doena de Bang e febre ondulante uma infeco bacteriana
causada pelo bacilo gram negativo intracelular Brucella. A Brucella endmica de
animais de quinta como a vaca, cabra carneiro e porco. A doena transmitida aos
humanos atravs de contacto directo com os animais infectados ou atravs da ingesto
de leite ou produtos lcteos contaminados. A brucelose muitas vezes assintomtica,
sendo a manifestao mais frequente a febre acompanhada de cefaleia, mialgias,
artralgias, astenias, calafrios e suores.
Na luta contra a doena, o organismo induz a resposta inflamatria que termina na
formao de granulomas principalmente no fgado, bao, ndulos linfticos e medula
ssea. Pode haver orquite intersticial com reas de fibrose e atrofia fibride,
endocardite, leses granulomatosas no miocrdio e envolvimento do crebro (sintomas
psiconeurticos), rins e pele. O perodo de incubao dura 10 a 14 mas a doena pode
ser assintomtica, podendo, aps um perodo de incubao de uma a trs semanas, ou
at de vrios meses, surgir manifestaes iguais s encontradas em todas as doenas
febris: febre contnua ou intermitente, artralgia, fraqueza, fadiga, perda de peso, falta de
apetite, dor de garganta e tosse seca que surgem subitamente em trs dias ou mais
gradualmente, em uma semana.
Relatrio de Estgio
56
Imunologia
A 3 espcies de Brucella patognicas para o Homem so a B. abortus, que infecta a
vaca, B melitensis que infecta a cabra e B. suis que infecta o porco.
O diagnstico da brucelose normalmente dirigido para a Brucella abortus e pode
ser feito atravs de isolamento e identificao da bactria a partir de hemoculturas ou
mieloculturas (valncia de microbiologia) ou com base nos anticorpos anti-Brucella que
o organismo produz
3.2.3.1. Pesquisa de anticorpos totais anti-Brucella abortus (BrucellaCapt)

Fundamento
A pesquisa de anticorpos totais anti-Brucella consiste na deteco de anticorpos
aglutinantes e no aglutinantes ou incompletos em relao Brucella abortus. Os
anticorpos incompletos so da classe IgG e IgA e surgem de forma persistente em nveis
sricos elevados na brucelose crnica, pelo que a sua pesquisa utilizada na deteco
das formas crnicas de brucelose. Estes anticorpos no apresentam capacidade de
aglutinao, pelo que necessrio adicionar um anticorpo anti-imunoglobulina humana
de forma a detectar reaco. O teste consiste num mtodo de imunocaptura e
aglutinao executado em
microplacas
com poos em
U revestidos com
imunoglobulinas anti-humanas. A aglutinao positiva quando h captura dos

anticorpos do soro da amostra pela imunoglobulinas da placa e quando h ligao dos
anticorpos com o antignio posteriormente adicionado.
Amostra
Soro
3.2.3.2. Reaco de Huddleson

Fundamento
A reaco de Huddleson uma reaco de aglutinao directa em placa para a
deteco de anticorpos aglutinantes (aglutininas). O teste consiste na aglutinao directa
entre as aglutininas do soro do paciente e o antignio homlogo, neste caso, B. abortus
do reagente. um teste rpido, recomendado para pesquisar presena de anticorpos
anti-Brucella essencialmente da classe IgM mas tambm IgG no soro dos doentes com
suspeita clnica de brucelose.
Relatrio de Estgio
57
Imunologia
Amostra
Soro
Interpretao
A aglutinao positiva pode ocorrer em pacientes saudveis devido a imunizao
prvia causada por uma infeco do passado ou a presena de antignios relacionados
(reaco cruzada). No entanto, a titulao nestes casos , no geral, menor e sem grandes
variaes. No caso de infeco activa ou imunizao recente, as titulaes detectadas
so mais elevadas e tendem a aumentar.
3.2.4. Serologia para Streptococcus pyogenes

O gnero Streptococcus engloba um grupo de cocos gram positivo, normalmente
dispostos em cadeia ou em pares. O Streptococcus do grupo A de Lancefield, conhecido
como Streptococcus pyogenes o principal agente causal de infeces bacterianas da
garganta (faringite e tonsilite) e da pele (piodermite e impetigo). Alm disso
responsvel por sequelas no supurativas como a escarlatina, febre reumtica,
endocardite bacteriana e glomerulonefrite aguda.
Esta bactria possui uma elevada virulncia, muitas vezes mediada pela protena M,
no entanto podem ainda ser produzidas toxinas e enzimas que vo aumentar a
resposta.inflamatria.
3.2.4.1. Determinao do ttulo de anticorpos anti-estreptolisina O (TASO)

O Streptococcus pyogenes produz vrias protenas, algumas com actividade
enzimtica, entre as quais, a estreptolisina O. A estreptolisina O uma protena
hemoltica no estado reduzido mas que rapidamente inactivada na presena de
oxignio. Trata-se de uma protena fortemente antignica.
Fundamento
A estreptolisina O um parmetro sensvel que se encontra elevado em 80 a 85% dos
casos de doena. A resposta de anticorpos s ocorre na segunda ou terceira semana aps
uma infeco aguda e atinge o mximo aps 4 a 5 semanas. O mtodo de deteco da
estreptolisina O imunonefelometria reforada com partculas de polistireno ltex. As
partculas de poliestireno carregadas com estreptolisina O, ao reagirem com os
Relatrio de Estgio
58
Imunologia
anticorpos anti-estreptolisina O, formam agregados, que dispersam a luz radiada. A
concentrao do analito ento proporcional intensidade de luz dispersa que
detectada por um espectrofotmetro.
Equipamentos e reagentes
BN ProSpec (Siemens)
Amostra
Soro
3.2.5. Serologia para Aspergillus

O Apergillus um fungo saprfito capaz de causar da doena no Homem. A espcie
mais comum de causar infeco Aspergillus fumigatus, para alm de A. flavus, A.
niger. A doena causada pela inalao dos esporos de Aspergillus e manifesta-se
consoante o estado imunolgico do hospedeiro, desde asma extrnseca, aspergilose
broncopulmonar alrgica, apergiloma pulmonar a aspergilose invasiva ou disseminada.
A aspergilose invasiva ou disseminada uma condio que afecta, mais
frequentemente, pacientes imunodeprimidos. Trata-se de uma patologia muitas vezes
fatal que se apresenta, inicialmente, como pneumonia aguda que, posteriormente,
dissemina para o tracto gastrointestinal, crebro, fgado, rins, corao e pele.
3.2.5.1. Deteco do antignio galactomananos do Aspergillus

No laboratrio de imunologia, o diagnstico de aspergilose invasiva consiste na
deteco do antignio galactomanano, um componente da parede do Aspergillus, atravs
da tcnica ELISA-sandwich Platelia executada no equipamento Evolis Twin Plus (BioRad). Inicialmente procede-se a um tratamento prvio das amostras de soro pelo calor
em presena de EDTA para dissociar os complexos imunes e precipitar as protenas que
possam interferir com o teste. Os resultados so semi-quantitativos e apresentados sob a
forma de um ndice a partir do qual possvel estabelecer um resultado qualitativo
(positivo ou negativo). O resultado no deve ser utilizado isoladamente mas sim em
conjunto com os dados clnicos que suportem a interpretao.
Relatrio de Estgio
59
Imunologia
3.2.6. Serologia para Echinococcus granulosis
A hidatidose causada por o parasita helminta, Echinococcus granulosis. Trata-se de
um parasita obrigatrio do intestino dos carnvoros, hospedeiro definitivo do co e tem
como hospedeiro intermedirio os herbvoros e, acidentalmente, o Homem.
O resultado da infeco por Echinococcus granulosis um quisto hidtico
constitudo pela larva (hidtide) fixada num rgo (fgado, pulmes, msculo, bao, etc)
e uma membrana adventcia, devido reaco do rgo infectado. Esta membrana
adventcia tende a fixar sais de clcio, formando placas calcrias visualizadas por raio
X.
3.2.6.1. Hemaglutinao indirecta

No laboratrio de imunologia usada a reaco de hemaglutinao indirecta entre
anticorpos especficos do soro da amostra com eritrcitos sensibilizados com antignios
do parasita, usando o kit Echinococcus Fumouze (Fumouze Diagnostics). A tcnica
em tudo semelhante ao teste TPHA usado no teste confirmatrio da sfilis. Os ttulos
inferiores 1/160 indicam reaces no significativas ou quisto antigo calcificado e
pouco evolutivo. Os ttulos iguais ou superiores a 1/160 so clinicamente significativos
e os ttulos superiores a 1/320 indicam reaco significativa e sugerem hidatidose
evolutiva.
3.2.7. Serologia para o vrus Epstein-Barr

A mononucleose infecciosa (MI) a infeco mais comum causada pelo vrus
Epstein-Barr (EBV). Mais frequente nos jovens adultos, tem como sintomas febre
constante,
faringite
linfoadenopatia
difusa,
alm
de
fadiga,
astenia
hepatoesplenomeglia, tambm muitas vezes presentes. A infeco transmitida atravs

de saliva.
O vrus entra no organismo atravs da cavidade oral e replica-se no epitlio da
orofaringe e glndulas salivares. Os linfcitos B infectados difundem-se, a partir da
orofaringe, quer pela via linftica, quer pela sangunea, atingindo locais distantes onde
formam focos de infoproliferao. Aps a primo-infeco, o vrus permanece latente
num pequeno nmero de linfcitos B, podendo ser reactivado e eliminado de forma
intermitente. Os linfcitos T respondem s clulas B infectadas especialmente atravs
Relatrio de Estgio
60
Imunologia
da activao e proliferao das clulas T supressoras (CD8), levando ao aparecimento
de linfcitos atpicos no sangue perifrico.
3.2.7.1. Monospot
Fundamento
No laboratrio de imunologia o diagnstico da MI feito atravs da determinao
semi-quantitativa de anticorpos heterfilos associados MI, usando o kit Avitex
(Omega diagnostics). Trata-se de um teste de aglutinao em lmina, que utiliza as
propriedades aglutinantes especficas dos anticorpos do soro (ou plasma) do doente, em
presena dos antignios extrados das hemcias bovinas, comuns a antignios do EBV,
que revestem partculas de ltex. A presena de anticorpos especficos no soro do
doente provoca aglutinao do reagente, que se traduz na formao de floculao.
Kit Avitex (Omega diagnostics)
Amostra
Soro
Interpretao
Com este teste podem surgir falsos negativos, associados a situaes em que o
paciente permanece negativo para anticorpos heterfilos ou, eventualmente, apresenta
resposta tardia a este tipo de anticorpos. A interpretao dos resultados deve ser
cuidadosa e enquadrada no contexto clnico pois estes anticorpos tm ainda sido
associados a patologias mais graves como: Linfoma de Burkitt, carcinoma pancretico;
hepatites virais; infeces por citomegalovrus (CMV), entre outras. Alm disso, a
prevalncia destes anticorpos pode estender-se a meses ou anos depois do
desaparecimento dos sintomas e da fase aguda da doena resultando de uma cicatriz
imunolgica e no um marcador de doena.
3.2.8. Titulao do factor reumatide

O FR trata-se de um anticorpo, predominantemente IgM, que reage com a poro Fc
de IgG humana. Encontra-se aumentado em doenas autoimunes como a artrite
Relatrio de Estgio
61
Imunologia
reumatide mas tambm, por exemplo, na macroglobulinmia de Waldenstrom, em que
10% das paraprotenas M produzidas tm caractersticas FR.
No laboratrio de imunologia, o factor reumatide determinado por duas tcnicas:
uma tcnica mais sensvel, RA teste (nefelometria) e outra tcnica mais especfica,
reaco de Waller-Rose.
3.2.8.1. Reaco de Waller-Rose

A reaco de Waller-Rose consiste numa tcnica de hemaglutinao indirecta, um
imunoensaio que se baseia nas propriedades hemaglutinantes especficas do factor
reumatide (IgM anti IgG) e usa hemcias de carneiro sensibilizadas com uma fraco
de gamaglobulina de coelho anti-hemcias de carneiro como reagente revelador. Na
presena do factor reumatide, ocorre hemaglutinao do reagente revelador que se
traduz na formao de um halo mais ou menos alargado de cor vermelho acastanhado
que cobre a cpula da placa. Na ausncia de aglutinao as hemcias do reagente
sedimentam no fundo da cpula sob a forma de um boto punctiforme. Usa-se tambm
um reagente testemunha para assegurar que no h aglutinao espontnea.
3.3.
Sector dos Marcadores tumorais
Um marcador tumoral, tal como referido no captulo 2, Bioqumica, uma protena

que serve como indicador bioqumico da presena de um tumor por ser, normalmente,
produzido pelas clulas tumorais. Estes marcadores so a expresso de fenmenos de
transformao neoplsica. O marcador ideal deveria as seguintes caractersticas:
especfico, sendo apenas produzido pelo tecido tumoral em questo; sensvel,
permitindo detectar a presena de um tumor, mesmo nos estdios precoces; deveria ter
interesse no diagnstico, prognstico e na monitorizao teraputica e possuir valores
correlativos fase da doena. No entanto, os marcadores actuais no satisfazem estas
exigncias.
Os marcadores tumorais revelaram grande importncia na monitorizao da
teraputica. A diminuio da concentrao do marcador uma indicao do sucesso do
tratamento. A velocidade de diminuio da concentrao do marcador deve estar de
acordo com a prevista tendo em conta a semi-vida do marcador, pelo que uma
diminuio mais lenta do que a esperada poder indicar que o tumor no foi totalmente
eliminado. Aps um tratamento bem sucedido, recomendado continuar a monitorizar o
Relatrio de Estgio
62
Imunologia
marcador mesmo aps os nvels terem estabilizado. Um posterior aumento pode indicar
uma recorrncia.
Os marcadores tumorais raramente so usados como ferramentas de diagnstico,
podendo apenas, num contexto clnico, auxiliar o diagnstico.
Actualmente, neste laboratrio de imunologia apenas se faz o doseamento srico de
trs marcadores tumorais: NSE, Cyfra 21.1, e CA 72.4.
3.3.1. Fundamento
A metodologia usada para a determinao dos marcadores tumorais imunoensaio
electroquimioluminescente (ECLIA), que tem como base a quimioluminescncia, j
descrita no captulo 2. O mtodo consiste na formao de um complexo sandwich entre
um anticorpo monoclonal anti-marcador tumoral biotinilado, marcador tumoral e um
anticorpo monoclonal anti-marcador tumoral marcado com rutnio. Aps a
incorporao de micropartculas revestidas de estreptovidina, o complexo liga-se fase
slida atravs da ligao da biotina estreptovidina. A mistura de reaco ento
aspirada para a cmara de leitura onde as micropartculas so fixadas magneticamente
superfcie de um elctrodo. No elctrodo, aps a aplicao de corrente elctrica, ocorre
uma reaco electroquimioluminescente do rudnio que emite luz medida por um
fotomultiplicador. A concentrao do marcador tumoral proporcional luz medida.
3.3.2. Parmetros
Enolase especfica dos neurnios (NSE)
A NSE uma isoenzima glucoltica enolase que intervm na gliclise anaerbia e
est presente no tecido neuronal e nas clulas do sistema neuroendcrino. A NSE
descrita como o marcador de primeira escolha na monitorizao do carcinoma
brnquico das clulas pequenas e neuroblastomas. Em resposta teraputica, observa-se
um aumento temporrio do nvel de NSE 24 a 72 horas aps o primeiro ciclo de
teraputica, em resultado da citlise das clulas tumorais. Na NSE, no existe qualquer
correlao com a zona de metstases nem com metstases cerebrais, mas existe uma boa
correlao com a fase clnica, ou seja, a extenso da doena. So detectadas
concentraes aumentadas de NSE em doentes com doena benigna no pulmo e do
crebro.
Relatrio de Estgio
63
Imunologia
CYFRA 21-1
CYFRA 21-1 a designao para o conjunto de fragmentos solveis de uma protena
do citoesqueleto das clulas dos epitlios simples, a citoqueratina 19. O teste CYFRA
21-1 tem como principal indicao a monitorizao da evoluo do carcinoma pulmonar
das clulas no pequenas (non-small cell lung cancer, NSCLC). Tambm marcador do
carcinoma da bexiga de formas msculo invasivas. Nveis sricos elevados deste
marcador indicam um tumor num estdio avanado e mau prognstico ou podem surgir
na insuficincia renal e na doena heptica. A teraputica bem sucedida documentada
por uma descida rpida do nvel srico de CYFRA 21-1 para o intervalo normal. As
doenas pulmonares benignas como a doena obstrutiva crnica e doenas infecciosas
apresentam valores elevados.
CA 72-4
O CA 72-4 uma glicoprotena presente em adenocarcinomas digestivos. Este
marcador tem como principal caracterstica a sua elevada especificidade. usado como
marcador do carcinoma gstrico e tambm do ovrio, encontrando-se elevado tambm
em situaes benignas como pancreatite, cirrose heptica, pneumopatias, doenas
reumticas, doenas ginecolgicas, quistos ovricos e doenas gastrointestinais.
3.4.
Sector da Autoimunidade
A autoimunidade consiste na reaco do sistema imunitrio (SI) contra os seus

prprios constituintes. Sabe-se que o sistema imunitrio tem a capacidade de distinguir
o self do no self, atravs do processo de deleco clonal e que, apenas uma anomalia do
SI, conduziria a uma resposta autoimune. No entanto, tem sido demonstrado que o
reconhecimento do self essencial para a normal fisiologia do SI e que os autoanticorpos no so necessariamente destrutivos e que fazem parte integral do
funcionamento do SI, envolvidos na cura de leses, limpando os restos celulares, clulas
envelhecidas, etc. Estas respostas auto-reactivas so transitrias na natureza e
predominantemente de istipo IgM. Uma produo no controlada de auto-anticorpos
poder resultar numa doena autoimune.
A doena autoimune o resultado de resposta imunitria desapropriada contra
antignios prprios, com consequentes danos no hospedeiro, como infiltraes
mononucleares e/ou sistmicas e destruio do tecido, devido persistncia da doena.
Relatrio de Estgio
64
Imunologia
A doena autoimune pode ter origem citotxica (reaces tipo II), em imunocomplexos
(reaces tipo III) e celular (reaces tipo IV).
Os factores associados s doenas autoimunes so:
Genticos autoimunidade associada a herana gentica; alterao dos genes do

complexo major de histocompatibilidade;
Hormonais autoimunidade associada aos estrognios (sexo feminino);
Qumicos autoimunidade associada a medicamentos por estes poderem

modificar a estrutura dos antignios, desencadear respostas contra eles ou
modificar o equilbrio imunolgico.
Fsicos a luz UV pode lesar as clulas apresentadoras de antignio.
Biolgicos as infeces por vrus ou bactrias com o efeito de superantignio

podem activar clulas T e levar segregao de citoquinas e/ou expandir a
populao autopatognica de clulas T.
Perda de tolerncia do SI devido a: falha na deleco das clulas T autoreactivas; reaco cruzada entre antignios prprios e exogneos; funo de
clula B excessiva; defeitos na apoptose.
As doenas autoimunes dividem-se em doenas autoimunes especficas de rgos e

doenas autoimunes sistmicas. As doenas autoimunes especficas de rgos como a
Diabetes mellitus, cirrose biliar, anemia perniciosa e doena celaca, ocorrem quando h
uma resposta imunitria especfica contra um antignio especfico de um rgo. As
doenas autoimunes sistmicas como doena de Sjogren, polimiosite, Lupus
Eritematoso Sistmico (LES), entre outras, afectam simultaneamente vrios rgos,
originando leses disseminadas e actuam contra elementos celulares e protenas
circulantes. Apesar de muito diferentes entre si, apresentando sintomas em comum
como fadiga, febre, mialgias, perda de peso e, muitas vezes, artralgias.
3.4.1. Mtodos de diagnstico

3.4.1.1. Imunofluorescncia indirecta
A IFI usada para a determinao semi-quantitativa do auto-anticorpo em estudo. Na
amostra em estudo os auto-anticorpos eventualmente presentes fixam-se aos antignios
do substrato. O anti-soro polivalente conjugado com isotiocianato de fluorescena
(FITC) adicionado ao substrato fixa-se ao anticorpo ligado, formando um complexo
sandwich. Depois da lavagem para remover o conjugado em excesso, a preparao
Relatrio de Estgio
65
Imunologia
vista ao microscpio de fluorescncia Olympus BH2-RFCA e os kits que fornecem as
lminas com os susbtratos so da Euroimunn, excepto o kit para os anticorpos antiDNA que FLUORO nDNA Test (MBL) e ANA, cujo kit da Diamedix.
Um resultado positivo quando se observa uma fluoresecncia brilhante verde-ma
no organelo ou tecido que se est a estudar, ao microscpio de fluorescncia.
Esta tcnica normalmente a primeira tcnica usada para pesquisa da maior parte
dos auto-anticorpos. Tem como vantagens a fcil execuo, elevada sensibilidade e
possibilidade de detectar simultaneamente mais do que um auto-anticorpo. No entanto,
trata-se de uma tcnica subjectiva, difcil de padronizar e os resultados so semiquantitativos.
A escolha do substrato depende do tipo de anticorpo que se pretende pesquisar. Os
substratos so os seguintes:
Clulas HEp-2 As clulas HEp-2 so clulas epiteliais humanas de carcinoma laringe
(Human Epithelioma type 2 cells). Estas clulas so utilizadas na pesquisa de anticorpos
antinucleares (ANA). Estas clulas tm como vantagens o facto de possurem um
ncleo grande e complexo, grande diversidade de antignios nucleares, elevada
sensibilidade e especificidade e clulas nas diferentes fases da mitose, permitindo a
deteco de anticorpos dirigidos contra antignios apensas expressos durante o ciclo
celular. Os ANA um grupo de auto-anticorpos que reagem com diversos constituintes
do ncleo:
dsDNA
Histonas
Nucleossoma
Antignios nucleares extraveis (ENA) Sm, U1-snRNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl70 e Jo-1
Nuclolo
Membrana nuclear
Aparelho mittico
A identificao dos ANA tem grande importncia no diagnstico, monitorizao
teraputica, prognstico e estudo da evoluo de doenas como lpus eritematoso
sistmico (LES), esclerodermia, sndrome de Sjgren (SS), polimiosite (PM),
dermatiosite (DM), doena conectiva mista do tecido conjuntivo (MCTD), artrite
reumatide (AR), entre outras.
Relatrio de Estgio
66
Imunologia
Os diferentes ANA detectados com as clulas HEp-2 produzem diferentes padres
nucleares, pelo que estes tm associaes clnicas diferentes, como se encontra descrito
na Tabela 3-9.
Tabela 3-9 Padres nucleares comuns e as respectivas associaes clnicas.
Padres
Descrio
nucleares
Associao clnica
Fluorescncia difusa e uniforme de LES, lpus induzido por

Homogneo
ncleos
em
interfase.
Mitoses frmacos, AR e esclerose
positivas.
drmica
Fluorescncia
Mosqueado
granular
fina
ou
grosseira dos ncleos em interfase.

Mitoses negativas.
Centrmero
Nucleolar
40
60
pontos
LES, MCTD, SS, PM,

esclerodermia.
fluorescentes Sndrome CREST, cirrose
distribudos nos ncleos em interfase.
biliar primria
Fluorescncia apenas nos nuclolos, Esclerodermia,

mitoses positivas ou negativas.
miosite,
LES
Alguns ANA so muitas vezes associados especificamente a certas doenas, sendo

considerados marcadores destas. Como exemplo, o anticorpo contra o antignio Smith
(Sm) e o anticorpo anti-dsDNA esto fortemente associados ao LES, enquanto o ANA
anti-centrmero est associado a CREST (Sndrome de calcinose, fenmero de
Raynaud, disfuno esofgica, esclerodactilia, telangiectasias).
Crithidia luciliae protozorio monoflagelado que possui uma mitocndria gigante, o
cinetoplasto, que contm uma dsDNA circular muito condensada. Esta massa parece ser
livre de histonas ou de quaisquer auto-antignios. Na presena de anticorpos antidsDNA, detectada fluorescncia no cinetoplasto e, mais fracamente, no ncleo. Este
substrato tem como vantagem a sua grande especificidade, devido natureza do dsDNA
circular no cinetoplasto.
Neutrfilos As preparaes de neutrfilos so utilizadas para a pesquisa de autoanticorpos anti citoplasma de neutrfilos (ANCA). Anti-mieloperoxidase (MPO) e antiproteinase 3 (PR3) so os principais anticorpos detectados. As preparaes so de
Relatrio de Estgio
67
Imunologia
neutrfilos fixados com etanol e possvel observar um padro citoplasmtico (CANCA) e detectar antignio PR3; ou um padro perinuclear (P-ANCA) e detectar o
MPO. Existem tambm preparaes de neutrfilos fixados com formol para distinguir
os anticorpos anti-MPO dos ANA. Nalgumas situaes recorre-se a neutrfilos fixados
em metanol para classificar o padro X-ANCA.
Substrato triplo (rim, estmago e fgado de roedores) O uso dos tecidos rim,
estmago e fgado de roedores tem como objectivo a pesquisa de anticorpos antimitocondria (AMA), anticorpos anticlula parietal (APCA), anticorpos anti-msculo
liso (ASMA) e anticorpos anti-microssomas hepticos e renais (anti-LKM). Os
diferentes anticorpos so identificados de acordo com o aspecto e localizao da
fluorescncia ao nvel dos trs tecidos.
Clulas VSM47 As clulas VSM47 so clulas musculares lisas (vascular smooth
muscle) e so usadas na pesquisa de anticorpos anti-filamentos de actina (F-actina), por
exemplo do no caso de um ASMA positivo.
Estmago de primata e suspenso de factor intrnseco Esta preparao utilizada
na pesquisa de anticorpos anti-Factor Intrnseco (FI) e anti-clula parietal (APCA). As
lminas contm seces de estmago de primata e gotas de microscpicas de uma
suspenso que contem FI.
3.4.1.2. MicroElisa
A MicroElisa usada para a identificao e quantificao de auto-anticorpos e/ou
confirmar resultados positivos obtidos por IFI. A tcnica est automatizada e realizada
no aparelho MAGO da Diamedix.
Trata-se de um mtodo imunoenzimtico em sandwich. Utilizam-se anticorpos
monoclonais, quer para revestir as microplacas, que se uniro ao auto-anticorpo
presente na amostra, quer para detectar o anticorpo ligado nas microplacas
sensibilizadas (reagente conjugado: anticorpos monoclonais ligados peroxidase). Aps
lavagem para eliminar o excedente, adicionado o substrato da enzima (TMB) que
reagir com o complexo formado, originando uma reaco de cor azul, que passa a
amarelo com a adio da soluo de paragem (cido). A quantidade de auto-anticorpo
Relatrio de Estgio
68
Imunologia
estudado proporcional ao produto da reaco enzimtica e luz emitida, medida por
um espectrofotmetro, a um comprimento de onda de 450 nm.
Esta tcnica usada, no laboratrio de imunologia para pesquisar os seguintes
autoanticorpos:
Anti-dsDNA;
Anti-clula parietal;
Anti-antignios mitocondriais M2;
Antifosfolpidos (anti-2-glicoprotena I e anti-cardiolipina).
3.4.1.3. Immunoblot Dot

A metodologia Immunoblot no laboratrio de imunologia usado para identificao
qualitativa e/ou confirmar alguns diagnsticos feitos pelas tcnicas anteriores. A tcnica
automatizada e executada no aparelho EUROBlotMaster da Euroimmun, O kit,
fornecido pela Euroimmun, contm tiras teste de nitrocelulose revestidas por antignios
altamente purificados. Cada tira contm vrios antignios, o que permite a identificao
simultnea de vrios autoanticorpos. O princpio deste teste semelhante ao da ELISA.
As tiras so postas a incubar com as amostras diludas e, caso haja anticorpos, estes
ligam-se aos respectivos antignios, sendo as ligaes no especficas so removidas
pela lavagem. Estes complexos so detectados pelo enzima-conjugado IgG (anti-IgG
humana marcado com fosfatase alcalina) e revelados pela adio do substrato
(NBT/BCIP- cloreto de azul de nitrotetrazolium / 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato). A
avaliao feita digitalmente usando o EUROLine Scan da Euroimmun.
Esta tcnica usada, no laboratrio de imunologia para pesquisar os seguintes
autoanticorpos:
ANA;
Anticorpos contra antignios hepticos;
Auto-anticorpos associados a miosites;
Auto-anticorpos associados a esclerose sistmica;
Auto-anticorpos anti-mieloperoxidase (MPO), anti-proteinase 3 (PR3) e antimembrana basal glomerular.
Relatrio de Estgio
69
Virologia
4. VIROLOGIA
4.1. Objectivo
A valncia de Virologia, segundo o regulamento do estgio, est includa na valncia
de Imunologia. No entanto, como o estgio em Virologia foi feito num laboratrio,
diferente do Laboratrio de Imunologia, optei por separar as reas.
O estgio decorreu no Laboratrio de Virologia (acreditado desde 2005) do Servio
de Patologia Clnica do Instituto Portugus de Oncologia de Lisboa, Francisco Gentil
sob a orientao da Dr Carmo Ornelas.
O objectivo do presente relatrio apresentar o local do estgio, fazendo referncia a
alguns parmetros executados, equipamentos utilizados, respectivas metodologias e
controlo de qualidade.
4.2.
Introduo
O Laboratrio de Virologia est inserido no Servio de Patologia Clnica do IPO e

responsvel por estudar e detectar vrus oncolgicos, com especial destaque para o
Vrus do Papiloma Humano (HPV).
No presente relatrio iro ser apresentados alguns vrus das seguintes famlias:
Herpesviridae;
Hepadnaviridae;
Flaviviridae;
Retrovrus
Papilomaviridae.
4.3.
Herpesvrus
Os Herpesvrus so vrus cujas caractersticas se resumem a: genoma DNA de dupla

cadeia linear, cpside icosadrica e invlucro. Existem 8 Herpesvrus (Famlia
Herpesviridae) que infectam o Homem, divididos em 3 sub-famlias:
Alphaherpesvirinae: Vrus Herpes Simplex 1 (HSV-1), Vrus Herpes Simplex 2
(HSV-2), Vrus Varicela-Zona (VZV).
Betaherpesvirinae: Citomegalovrus (CMV), Herpesvrus Humano 6 (HHV-6),
Herpesvrus Humano 7 (HHV-7).
Relatrio de Estgio
70
Virologia
Gamaherpesvirinae: Vrus Epstein-Barr (EBV), Herpesvrus Humano 8 (HHV8).
Destes, apenas tive conhecimento sobre os mtodos de deteco de alguns.
4.3.1. Citomegalovrus
O Citomegalovrus (CMV) responsvel por infeces que apresentam risco
significativo
quando
contradas
por
grvidas,
recm-nascidos
indivduos
imunosuprimidos. A transmisso pode ser oral, sexual, intrauterina, perinatal, via

transfuso sangunea e trasnplante de rgos. Apesar de ser geralmente assintomtica
em crianas e adultos (se houver sintomatologia, consiste em mononucleose com febre,
hepatite e mal-estar geral), uma das infeces congnitas mais frequentes e graves,
provocando leses no SNC, hepatite, trombocitopnia, bronquite, atraso psicomotor e
mental e surdez progressiva no recm-nascido. Assim sendo, de grande importncia
determinar se a infeco primria ou no, na grvida, uma vez que a taxa de
transmisso me-filho maior do que na infeco secundria. O vrus pode atravessar a
barreira placentria, mas a infeco pode igualmente ser perinatal, devido ao contacto
com sangue materno ou secrees vaginais, ou ps-natal, atravs do leite materno.
Em qualquer infeco, a resposta imunitria humoral envolve a sntese de anticorpos
classe IgM algumas semanas aps a infeco e, uma semana aps, dos anticorpos da
classe IgG. Os nveis de IgM anti-CMV aumentam em geral por algumas semanas e
depois diminuem lentamente no decorrer de quatro a seis meses. Ocasionalmente, a IgM
pode permanecer na circulao por anos. O teste de IgM um instrumento essencial no
diagnstico da infeco primria por CMV, a qual difcil de identificar apenas pelos
sintomas. Alm disso, nem sempre fcil de distinguir entre a infeco primria e
secundria, pois a reactivao pode induzir a sntese de IgM em pacientes
imunocomprometidos. O teste de IgG til para distinguir os indivduos com a doena
adquirida daqueles que no a adquiriram uma vez que , geralmente, um marcador de
infeco passada.
4.3.2. Vrus Epstein-Barr

O vrus Epstein-Barr (EBV) o agente patognico responsvel pela mononucleose
infecciosa (MI) e capaz de infectar clulas epiteliais e linfcitos. Tambm se encontra
envolvido no linfoma de Burkitt, no carcinoma da nasofaringe e no sndrome
Relatrio de Estgio
71
Virologia
linfoproliferativo ligado ao cromossoma X. O EBV transmite-se principalmente por via
oral. O vrus replica-se no epitlio orofarngeo e libertado na saliva pelos linfcitos B
infectados. Durante a infncia, a infeco primria por EBV assintomtica mas na
adolescncia ou na idade adulta, apresenta-se como mononucleose infecciosa com
sintomas como dor de garganta, febre, linfadenite, mal-estar geral, associados a
manifestaes hematolgicas (linfocitose) e serolgicas (presena de anticorpos
heterfilos circulantes e/ou anticorpos dirigidos contra as protenas especficas de EBV.
Vrias doenas como infeces por citomegalovrus, Toxoplasma gondii, vrus de
hepatite, vrus de imunodeficincia humana (HIV), entre outros, apresentam
sintomatologia semelhante. Contudo, este teste apresenta alguns falsos negativos e o
diagnstico de MI aguda pode ser feito, detectando-se anticorpos dirigidos contra
protenas especficas do EBV, como o antignio da cpside viral (Viral Capsid Antigen
VCA) e o antignio precoce difuso (Early Antigen-Diffuse, EA(D)). A presena de
anticorpos IgM anti-VCA essencial para estabelecer diagnstico de MI aguda. No
entanto, recomenda-se confirmar com anticorpos IgG anti-EA(D) ou IgG ou IgM antiEBNA-1. Na figura seguinte, est demonstrado a evoluo dos ttulos dos anticorpos
anti-VCA, anti-EA e anti-EBNA ao longo da doena.
Figura 4-1 Ttulos de anticorpos contra protenas especficas do EBV ao longo da infeco.
Os testes serolgicos para as infeces por EBV permitem detectar respostas

imunitrias caractersticas em funo do tempo. Na tabela seguinte, encontram-se os
vrios diagnsticos possveis conforme os anticorpos detectados:
Relatrio de Estgio
72
Virologia
Tabela 4-1 Diagnstico possvel para as diferentes prevalncias de anticorpos.
IgG anti-
IgM anti-
IgG anti-
IgG anti-
VCA
EBV
EBNA
EA
Sem exposio ao vrus
Fase precoce da infeco
+/-
Infeco primria aguda
+/-
Fase transio/Reactivao
+/-
Infeco passada
Diagnstico
4.3.3. Vrus Herpes Humano 6

O Herpesvrus Humano 6 (HHV-6), inicialmente descrito em 1986, foi isolado em
doentes com disfunes linfoproliferativas. O HHV -6 tem tropismo para os linfcitos
T-CD4+ e o agente etiolgico responsvel pela doena infantil, exantema sbito e foi
associado com vrias manifestaes de doenas em crianas, incluindo hepatite
fulminante, encefalite, linfadenite necrotizante histiocitria e infeco fatal disseminada.
Nos imunodeficientes pode ter consequncias mais graves como mononucleose,
linfoproliferao policlonal atpica, esclerose mltipla, encefalites e retinites. A
seroprevalncia aproximadamente de 100% na infncia, deixando poucos adultos
susceptveis a infeco primria. A transmisso ocorre por contacto directo com saliva,
secrees vaginais e vertical (intrauterina e perinatal).
4.3.4. Vrus Hepres Humano 8

O Herpes Vrus Humano 8 (HHV-8) classificado como gamaherpesvrus, com
tropismo para as clulas B, macrfagos e clulas epiteliais e com grande capacidade
para existir em estado latente, sob a forma de epissoma que se replica juntamente com o
DNA celular. A transmisso ocorre por contacto sexual, transplante de rgos, saliva e
transfuso de sangue e o perodo de incubao varivel, dependendo do estado
imunolgico do hospedeiro. Ao contrrio de vrus como EBV, HHV-6, HHV-7, CMV
ou HSV-1, onde mais de 80% da populao positiva para anticorpos para estes vrus,
para o HHV-8, so observados ttulos elevados de IgG em doentes com Sarcoma de
Kaposi, mas no em dadores.
Relatrio de Estgio
73
Virologia
4.4.
Hepadnavrus
4.4.1. Vrus da Hepatite B

O nico vrus, pertencente famlia Hepdnaviridae, capaz de infectar os humanos
o Vrus da Hepatite B. O Vrus da Hepatite B tem como principais caractersticas
possuir genoma DNA e tropismo para os hepatcitos.
A sua transmisso sangunea, sexual e perinatal sendo este ltimo, um dos modos
mais graves e eficientes de transmisso. Os hepadnavrus infectam, principalmente,
hepatcitos e tm capacidade para induzir infeces persistentes e crnicas, estando
associados ao desenvolvimento de cirrose e hepatocarcinoma celular. A virmia dos
indivduos infectados elevada (> 106/mL) e pode ser encontrado no plasma, no smen,
fluidos vaginais e saliva.
Quanto patognese da infeco causada por HBV, o vrus causa inicialmente
hepatite aguda, geralmente assintomtica, apenas com aumento de transaminases e
alguns sintomas ligeiros como gastrointestinais e gripe. A hepatite aguda pode, no
entanto, apresentar-se na forma ictrica com nuseas, anorexia, febre ligeira, fezes
claras e urina escura. Pode ainda ocorrer hepatite fulminante, rara mas fatal devido a
falha generalizada da funo heptica. A hepatite causada pelo HBV pode evoluir para
hepatite crnica, em que h leso crnica do fgado, que pode, a longo prazo, conduzir a
cirrose e carcinoma hepatocelular. O carcinoma hepatocelular pode ser causado por
alteraes cromossomais, mutaes genticas, protenas virais oncognicas ou
integrao do genoma viral no genoma dos hepatcitos.
Durante a infeco por HBV podem ser detectados vrios antignios e anticorpos:
AgHBs Antignio de superfcie de HBV. O AgHBs o primeiro marcador
serolgico aps a infeco pelo HBV e pode ser detectado durante infeco aguda como
crnica, desaparecendo no perodo de convalescena. A determinao de AgHBs
usada para identificar pessoas infectadas a fim de evitar a transmisso do vrus, bem
como para monitorizar o estado da infeco, juntamente com outros marcadores
serolgicos.
Anti-HBs anticorpos anti-antignio de superfcie, AgHBs. Os ensaios para
determinao de anticorpos anti-HBs so frequentemente utilizados para monitorizar o
sucesso da vacinao contra a hepatite B, monitorizar a convalescena de indivduos
infectados. A presena de Anti-HBs num indivduo assintomtico pode indicar
exposio anterior ao HBV.
Relatrio de Estgio
74
Virologia
Core total - anticorpos IgM e IgG anti-antignio do core. Aparecem no inicio da
sintomatologia e persistem para o resto da vida. A presena de anti-HBc total indica
infeco prvia ou actual durante um perodo de tempo indefinido.
AgHBc - Antignio do core que usado como marcador de infeco activa.
Anti-HBc IgM anticorpos IgM anti-antignio do core. Os anticorpos virais
especficos da classe IgM so detectados na maioria das infeces virais agudas, pelo
que so considerados como marcador fivel da fase aguda da doena. Na fase de
convalescena, os anticorpos IgM anti-HBc mantm nveis detectveis aps o
desaparecimento de AgHBs.
AgHBe antignio encontrado no core do virio, detectado na fase inicial da
infeco aps o aparecimento do antignio de superfcie. A sua determinao pode ser
utilizada para monitorizar o progresso da infeco pelo vrus da hepatite B. Juntamente
com o AgHBs pode persistir nos casos de infeco crnica pelo vrus da hepatite B. Um
resultado negativo para AgHBe pode indicar: fase inicial da infeco aguda antes do
pico da replicao viral ou inicio da convalescena, com nveis de AgHBe indetectveis.
Anti-HBe anticorpos anti-antignio HBe. A seroconverso de AgHBe para
anticorpos anti-HBe durante a infeco aguda pelo vrus da hepatite B normalmente
indicativa de resoluo da infeco, de um nvel reduzido de infecciosidade ou da
resposta virolgica no tratamento de doentes com infeco crnica. A presena de
anticorpos anti-HB permite distinguir as duas fases, descritas acima, em que o AgHBe
negativo.
Na tabela seguinte encontra-se um resumo do que foi descrito acima em relao aos
vrios marcadores serolgicos de hepatite B.
Tabela 4-2 Perfis possveis para os antignios e anticorpos de HBV
AgHBs
Anti-
Anti-
HBc
HBc
IgM
Total
AgHBe
Anti-
Anti-
HBe
HBs
Perfil
-/+
Fase de incubao
Fase aguda precoce
Fase aguda
Inicio da seroconverso
Relatrio de Estgio
75
Virologia
AgHBs
Anti-
Anti-
HBc
HBc
IgM
Total
AgHBe
Anti-
Anti-
HBe
HBs
Perfil
Portador crnico com

seroconverso tardia
Portador crnico sem
seroconverso
Perodo
de
janela,
inicio de recuperao
ou anti-HBs com ttulo
baixo
4.5.
+/-
Fase de convalescena
Imunidade
aps
infeco pelo HBV

Imunidade
aps
vacinao
Ausncia de contacto
prvio
Flavivrus
Grupo de vrus ao qual pertence o Vrus da Hepatite C, com genoma RNA.

4.5.1. Vrus da Hepatite C
O HCV foi descoberto na dcada de 70, quando foi reconhecida uma forma de
hepatite com caractersticas de hepatite B mas seronegativa para HBV. As principais
vias de transmisso so a via sangunea e vertical. O perodo de incubao cerca de 45
dias e apenas 5% dos infectados apresentam sintomas, como anorexia e nuseas. Tal
como o HBV, o HCV tem tropismo para os hepatcitos e tem capacidade para induzir
infeces persistentes, estando tambm associado ao desenvolvimento de cirrose e
hepatocarcinoma celular. Sem tratamento, 80% dos infectados desenvolve hepatite
crnica, podendo evoluir para cirrose heptica, muitas vezes precursora de carcinoma
hepatocelular. No entanto, esta evoluo lenta, podendo durar 20 anos. O carcinoma
hepatocelular parece ser uma consequncia directa da cirrose, em vez de ser causado
Relatrio de Estgio
76
Virologia
pela integrao de sequncias de cido nucleco no genoma da clula hospedeira
(mutagnese mutacional), como acontece com a hepatite C.
4.6.
Retrovrus
Os Retrovrus so um grupo de vrus (famlia Retroviridae) que possuem genoma

RNA, invlucro e trasncriptase reversa, que usa o RNA viral como template para
originar cpias de DNA. Os retrovrus podem ainda dividir-se em duas sub-famlias de
vrus que causam doena nos humanos:
Retrovrus HTLV, que contm HTLV-I e HTLV-II. Estes vrus distinguem-se
pelas caractersticas do genoma e a sua capacidade para causar tumores em vez
de imunossupresso.
Lentivirus, que contm os vrus HIV-1 e HIV-2. Caracterizam-se pela forma
cnica do virio, ausncia de oncogenicidade e a presena de sintomas e sinais
clnicos de longa durao.
4.6.1. Vrus T-Linfotrpicos Humano tipo I e II

O HTLV foi o primeiro retrovrus humano a ser descoberto por Robert Gallo. O
HTLV-I est etiologicamente associado leucemia/linfoma de clulas T do adulto e
paraparsia espstica tropical/mielopatia associada ao HTLV-I. O HTLV-II encontra-se
associado leucemia a tricoleuccitos e neuromielopatia crnica. O HTLV-I possui
caractersticas endmicas na zona sudoeste do Japo, Carabas e em algumas regies de
frica enquanto o HTLV-II endmico em algumas populaes indgenas americanas.
A transmisso requer contactos repetidos mas pode ocorrer atravs do leite materno,
sexual e sangunea.
4.6.2. Vrus da Imunodeficincia Humana

O HIV trata-se de um retrovrus de genoma RNA de dupla cadeia linear, com
invlucro e o agente etiolgico da Sndrome de Imunodeficincia Adquirida (SIDA).
A sua transmisso pode ser por contacto sexual, exposio a sangue ou produtos
sanguneos, infeco pr-natal ou perinatal.
A classificao actual distingue dois tipos, HIV-1 e HIV-2, estando estes separados
em grupos e sub-grupos. O HIV-1 est dividido pelos grupos M, O e N, sendo o M
Relatrio de Estgio
77
Virologia
responsvel pela pandemia global enquanto os restantes so relativamente raros e
endmicos da frica ocidental central.
O HIV-1 responsvel por uma infeco crnica que evolui progressivamente para
uma depleo da populao dos linfcitos T CD4+. A primo-infeco , geralmente,
assintomtica e quando sintomtica declara-se duas ou trs semanas aps a
contaminao e reveste, frequentemente, um quadro de sndrome pseudo-gripal ou
mononuclesico, com febre, astenia, adenopatias, erupo cutnea, cefaleias, faringite,
entre outras. Esta sintomatologia regride espontnea e rapidamente para um estado de
portador assintomtico que pode durar anos. Aps este perodo, podem surgir uma
variedade de sintomas que pode traduzir a deteriorao clnica: febre crnica, perda de
peso, diarreia e candidase oral. Paralelamente, ocorre linfopnia CD4 e surgem as
infeces oportunistas como pneumocistose, toxoplasmose, infeces por micobactrias
ou proliferaes celulares (doena de Kaposi, linfomas B, cancro), que assinalam a
entrada em SIDA. A virmia geralmente elevada (> 106 cpias de genoma viral/mL)
na primo-infeco, diminuindo muito rapidamente para se estabilizar num nvel
varivel, dependendo da resposta imunitria. O nvel dessa carga viral preditivo da
evoluo da doena, tanto mais rpida quanto mais a carga viral for elevada.
A protena imunogentica principal e o alvo antigenmico para a deteco srica a
protena transmembranar TMP. Os anticorpos anti-TMP encontram-se normalmente
entre os primeiros a aparecer quando se d a seroconverso dos indivduos infectados
pelo HIV. Pouco tempo depois da infeco pelo HIV mas antes da seroconverso, o
antignio do HIV pode ser detectado em amostras de soro ou plasma. A protena
estrutural do HIV mais frequentemente utilizada como marcador de antigenmia a
protena do core, p24, diminuindo desta forma a janela de seroconverso e melhorando
a deteco precoce da infeco pelo HIV. So estes os dois parmetros determinados
para o diagnstico de HIV (tabela 4-14)
4.7.
Papilomavrus
Os Papilomas vrus Humanotrata-se de um grupo de vrus oncognicos de DNA

circular de dupla cadeia, com cpside icosadrica e sem invlucro. Destes, o vrus
responsvel por causar tumor no humano o Vrus do Papiloma Humano (HPV).
Relatrio de Estgio
78
Virologia
4.7.1. Vrus do Papiloma Humano
O HPV, inicialmente, reconhecido como a causa das verrugas cutneas, um dos
gneros da famlia Papillomaviridae, com genoma DNA. So conhecidos mais de 200
gentipos de HPV, sendo alguns oncognicos. As vias de transmisso deste vrus so:
sexual (a principal via de transmisso das verrugas genitais), vertical (via de
transmisso de papiloma larngeo e de verrugas nas crianas) e contacto directo com
material infectado, normalmente, atravs de feridas.
O HPV tem tropismo para o epitlio cutneo e mucoso. Os vrus infecta a camada
basal da derme, replicando-se nas clulas epiteliais causando leses na pele e nas
mucosas. Os tipos cutneos do HPV so epidermotrficos e afectam a pele das mos e
ps, enquanto os tipos mucosos infectam o epitlio da boca, garganta, tracto respiratrio
e epitlio anogenital. Os diferentes gentipos podem estar associados a diferentes locais
anatmicos e clnicos, embora haja uma sobreposio (tabela 4-8). A manifestao
clnica mais grave do HPV o carcinoma do crvix associado aos gentipos 16, 18, 31,
33, entre outros, designados de gentipos oncognicos.
Tabela 4-3 Gentipos de HPV e as respectivas leses associadas e descrio.
Gentipo
Leso
HPV
Descrio
associado
Pequenas e em grande nmero, em
Verrugas
comuns
qualquer parte do corpo mas, mais

1,2 e 4
frequentemente, nas mos e ps com

superfcie spera. Dolorosas quando na
sola dos ps.
Leses
Verrugas
no-
planas
malignas
Verrugas planas e lisas/suaves. Afectam,

normalmente as crianas.
Verrugas
genitais
(condylomata
acuminata) so a infeco sexualmente

Verrugas
genitais
6 e 11
transmitida
normalmente,
(IST)
mais
ocorrem
comum
e,
associadas
outras ISTs. As leses ocorrem como

ppulas com tamanho varivel. Afectam o
Relatrio de Estgio
79
Virologia
pnis, uretra, nus, vulva, vagina e crvix.
Papiloma
larngeo
Leses
Epidermodis
pr-
plasia
malignas
verruciforme
Verrugas
6 e 11
na
principalmente
boca
em
laringe,
crianas
como
resultado da transmisso perinatal.

Ocorrncia de mltiplas leses planas por
2,3 e outros
todo o corpo, associado a deficincia de

clulas T.
O HPV o agente etiolgico do
carcinoma do colo do tero. Cerca de
Leses
Cancro
malignas
cervical
16,18,31,33,35
70% dos casos esto associados aos
e outros
gentipos 16 e 18 e os restantes
(gentipos
associados aos gentipos 31, 33 e 35, etc.
HPV de alto
E6 e E7 (protenas de replicao) ligam-
risco)
se, respectivamente, a duas protenas

celulares,
p53
pRB,
levando
proliferao celular excessiva e cancro.
4.8.
Deteco Directa e Indirecta dos Agentes Virais
A deteco dos agentes virais no Laboratrio de Virologia pode ser directa ou

indirecta. A deteco directa consiste na deteco dos antignios dos respectivos
agentes virais, no soro do paciente e no seu DNA/RNA; enquanto a deteco indirecta
consiste na deteco dos anticorpos contra os antignios, no soro do paciente.
4.8.1. Imunoensaio de Micropartculas por Quimioluminescncia

Fundamento
Esta metodologia (CMIA), j descrita no captulo 2, um imunoensaio de dois
passos, em que os anticorpos IgM/IgG anti-vrus, presentes em soro ou plasma, ligam-se
s micropartculas revestidas de lisado viral e s micropartculas revestidas de antignio
recombinante do vrus em estudo. Posteriormente, adicionado o conjugado de
anticorpos anti-IgG humana, marcado com acridnio e as solues pr-activadora e
activadora, provocando uma reaco quimioluminescente, medida em unidades de luz
relativas (RLUs). A quantidade de anticorpos IgM/IgG anti-vrus presentes na amostra
directamente proporcional s RLUs medidas.
Relatrio de Estgio
80
Virologia
Equipamento
Liaison da Diasorin
Architect i2000Sr da Abbott
Parmetros
CMV (IgG e IgM) - Liaison
HIV-1/2 (Antignio p24 do HIV-I e anticorpos HIV-1 e HIV-2) - Architect
HBV (AgHBs, Anti-HBs, Core total, Anti-HBc IgM, AgHBe e Anti-HBe) Architect.
HCV (IgM/IgG) - Architect
4.8.2. Imunoensaio de Quimioluminescncia

Fundamento
A metodologia CLIA muito semelhante metodologia acima descrita, excepto no
conjugado de anticorpo anti-IgM/IgG humana que se encontra marcado com isoluminol,
em vez de acrdinio.
Equipamento
Liaison da Diasorin
Architect i2000Sr da Abbott
Parmetros
CMV (IgG e IgM) - Architect;
EBV (IgG anti-VCA, IgM anti-EBV, IgG anti-EBNA, IgG anti-EA) - Liaison;
HTLV-I/II (IgG) - Architect
Relatrio de Estgio
81
Virologia
4.8.3. Antigenmia CMV pp65
Fundamento
A determinao de antigenmia CMV pp65 trata-se da identificao da fosfoprotena
estrututal pp65 em leuccitos de sangue perifrico, utilizando anticorpos monoclonais
marcados com peroxidase. O mtodo consiste na separao dos leuccitos, colorao,
colocao em poos de lminas, adio de anticorpo primrio de ratinho anti-pp65 e um
anticorpo secundrio marcado com peroxidase. Posteriormente, adicionado perxido
de hidrognio e corada a lmina para a deteco da protena pp65. Este mtodo
permite um diagnstico precoce, geralmente, antes de sintomatologia clnica e permite
controlar a evoluo da infeco e do tratamento.
4.8.4. PCR em Tempo Real

Fundamento
Para monitorizao de tratamento, pedido um teste de carga viral, determinada por
PCR em Tempo Real. O PCR em Tempo Real consiste numa reaco de polimerase em
cadeia, ou seja, a amplificao de regies especficas do genoma, em que o produto
amplificado detectado atravs de corantes fluorescentes. Esta tecnologia permite a
monitorizao das intensidades de fluorescncia durante a corrida de PCR e assim
acompanhar a deteco e quantificao do produto acumulado, em tempo real.
O PCR em Tempo Real permite a quantificao do cido nucleco medida que este
amplificado. No PCR em Tempo Real, tal como no PCR clssico, com a ajuda da
enzima DNA-polimerase, ocorre a replicao de uma cadeia de DNA a partir do ponto
em que o primer est ligado cadeia molde. Os primers definem a sequncia a ser
replicado e o resultado obtido a amplificao de uma determinada sequncia com
muitas cpias. No PCR em Tempo Real, o produto amplificado detectado atravs de
corantes fluorescentes (no-especficos) que esto normalmente ligados a sondas de
oligonucletidos (sondas Minor Groove Binder) que se ligam especificamente ao
produto amplificado - como o caso do SYBR Green - ou atravs de sondas
fluorescentes especficas - como o caso da TaqMan. As molculas de SYBR Green,
durante a polimerizao catalisada pela enzima DNA polimerase, ligam-se ao DNA
recentemente sintetizado, inespecificamente. Com a excitao da luz emitida pelo
sistema ptico do termociclador, h emisso de fluorescncia verde que aumenta
medida que o DNA amplificado. No ciclo seguinte, na desnaturao do DNA, as
Relatrio de Estgio
82
Virologia
molculas de SYBR Green so libertadas e o sinal de fluorescncia diminui. A sonda
TaqMan utilizada para detectar sequncias especficas nos fragmentos de DNA
amplificados por PCR. Esta sonda tem numa extremidade um fluorforo e noutra, um
quencher (molcula que aceita energia do fluorforo na forma de luz e a dissipa na
forma de luz ou calor). Durante o PCR em Tempo Real, a sonda hibridiza com a
sequncia de cadeia molde para a amplificao. Durante a amplificao, a sonda
degradada devido actividade exonuclease 5-> 3 da DNA polimerase, separando o
quencher do fluorforo, resultado num aumento de intensidade de fluorescncia. Assim,
durante o processo de amplificao a emisso de luz aumentada de forma exponencial.
Esta tecnologia permite ento a monitorizao das intensidades de fluorescncia durante
a corrida de PCR e assim acompanhar a deteco e quantificao do produto
acumulado, em tempo real.
No Laboratrio de Virologia, o PCR em Tempo Real usado para determinar a carga
viral em soro e plasma com o objectivo de fazer a monitorizao de um tratamento. O
PCR em Tempo Real tambm se encontra inserido na deteco do HPV presente na
infeco. No caso de determinao da carga viral, so usadas sondas especficas
(TaqMan) e o ensaio quantitativo, em que so usados calibradores com sequncias
semelhantes das amostras, com o objectivo de se quantificar o nmero de cpias virais
no soro. No caso do diagnstico da infeco por HPV, trata-se de um ensaio qualitativo
e so usados corantes inespecficos (SYBR Green) uma vez que o objectivo apenas
detectar o vrus e no obter valores.
Equipamento
Abi Prism Sequence Detection Systems da Applied Biosystems
Parmetros
CMV (carga viral)
HHV-6 (carga viral)
HBV (carga viral)
HCV (carga viral)
EBV (carga viral)
Relatrio de Estgio
83
Virologia
4.8.5. Imunofluorescncia Indirecta
Fundamento
O ensaio de imunofluorescncia indirecta de anticorpos utiliza o mtodo indirecto de
marcao de anticorpos por fluorescncia. Na primeira fase, o soro e o plasma humanos
a serem testados, so postos em contacto com clulas fixadas, infectadas e no
infectadas. Caso o anticorpo esteja presente na amostra, ir-se- formar um complexo
com o antignio, no substrato celular. Caso contrrio, no se formam complexos e todos
os componentes do soro so lavados no ciclo de passagem por gua. A reaco positiva
(fluorescncia verde) revelada com a adio de um anticorpo anti-humano marcado
com fluorescena, aquando da observao da lmina ao microscpio de fluorescncia.
Uma amostra considerada positiva se apresentar fluorescncia verde ma nas clulas
infectadas, para uma dada diluio e com padro semelhante ao controlo positivo. Caso
se observe fluorescncia em clulas infectadas e no infectadas a reaco inespecfica
e o resultado negativo.
Parmetros
HHV-6 (IgG e IgM)
4.8.6. Imunoensaio enzimtico ELISA

Este imunoensaio qualitativo, j explicado no captulo referente valncia de
imunologia consiste na ligao dos anticorpos presentes na amostra com o antignio do
vrus em estudo ligado superfcie de poliestireno dos micropoos do teste. A fim de
ser possvel detectar estes imunocomplecos, adicionada anticorpo IgG anti-humana
conjugado com peroxidase. A reaco enzimtica com tetrametilbenzidina/perxido de
hidrognio vai dar soluo a cor azul, que aps a paragem da reaco, torna-se
amarela, revelando a presena dos anticorpos anti-vrus na amostra.
Parmetros
HHV-6 (IgG)
Relatrio de Estgio
84
Virologia
4.8.7. Immunoblot
4.8.7.1. INNO-LiA
Fundamento
O imunoensaio Inno-Lia consiste num ensaio imunoenzimtico, com protenas virais
de natureza recombinante e pptidos sintticos, fixadas em membrana de nylon em
bandas individualizadas. O Inno-Lia baseia-se no princpio ELISA. Nesta metodologia,
so usadas tiras que contm antignios, aos quais se ligam os anticorpos a estudar na
amostra. Posteriormente, adicionado anticorpo anti-IgG humana marcado com
fosfatase alcalina que se liga aos complexos previamente formados. A reaco
enzimtica com um substrato cromognio produz uma cor castanho-escura proporcional
com a quantidade de anticorpos especficos presentes na amostra.
No laboratrio de virologia, este imunoensaio usado como confirmatrio dos vrus
HTLV-I/II e HIV-I/II. Dadas as implicaes de seropositividade para estes vrus, bem
como a existncia de reaces falsamente positiva com os testes de screening,
obrigatrio efectuar um teste de confirmao antes de fornecer um resultado positivo.
No caso do vrus HTLV-I/II os antignios usados so p19 I/II , p24 I/II, gp46 I/II,
gp21 I/II, que confirmam a presena de anticorpos contra HTLV I e II. Os antignios
p19-I e gp46-I so especficos de HTLV-I e gp46-II especfico de HTLV-II e servem
para diferenciar infeces por HTLV-I e HTLV-II. Para alm dos antignios tambm se
encontram 4 bandas, uma de controlo negativo (estreptavidina) e trs de controlo
positivo, uma banda de 3+ (IgG anti-humana) , uma banda de 1+ (IgG humana) e uma
banda de .(IgG humana).
Equipamento e material
Kit da Innogenetics
Parmetros
HTLV-I/II (confirmatrio)
Interpretao de resultados
A interpretao dos resultados encontra-se na seguinte tabela:
Relatrio de Estgio
85
Virologia
Tabela 4-4 Interpretao dos resultados para HTLV-I/II
Bandas
Resultado
Nenhuma banda
Negativo
1 nica banda:
p 19 I/II ou p 24 I/II ou
gp 46 I/II
gp 21
Negativo
Indeterminado
2 bandas:
gp 21 no reactivo
Indeterminado
gp 21 reactivo
Positivo
3 bandas ou mais
Positivo
4.8.8. Confirmatrio de HIV-I/II

Fundamento
O mtodo western-blot tambm usado confirmar resultados positivos na deteco
do Vrus da Imunodeficincia Humana 1 e 2. Os antignios do vrus so separados em
bandas, por electroforese em gel de poliacrilamida, de acordo com o seu peso
molecular. Para a deteco adiciona-se o soro do paciente, que se vai ligar s protenas
existentes na tira de nitrocelulose. Seguidamente o processo semelhante a ELISA:
adicionado soro ou plasma contra os anticorpos do paciente, marcado com enzima, cujo
substrato, adicionado posteriormente, origina um produto visvel que permite a deteco
das bandas.
Parmetros
HIV-I/II (confirmatrio)
No caso do HIV, os antignios usados bem como a sua interpretao encontram-se

nas tabelas seguintes:
Tabela 4-5 - Antignios presentes nas tiras de immunoblot para o HIV-1.
Antignios
Nomenclatura
Natureza
gp 160
ENV
Glicoprotena precursora de gp 110/120 e gp 41
Relatrio de Estgio
86
Virologia
Antignios
Nomenclatura
Natureza
gp 110/120
ENV
Glicoprotena do envelope
p 68/66
POL
Transcriptase reversa
p 55
GAG
Precursor das protenas do core
p 52/51
POL
gp 41
ENV
Glicoprotena transmembranar
p 40
GAG
Precursor das protenas do core
p 34/31
POL
Endonuclease
p 24/25
GAG
Protena do core
p 18/17
GAG
Protena do core
Tabela 4-6 - Interpretao dos perfis possveis para o HIV-1, segundo a OMS.
Interpretao
Positivo
Critrios de Organizao Mundial

de Sade (OMS)
2 ENV GAG POL
1 ENV GAG POL
GAG + POL
Indeterminado
GAG
POL
Sem bandas
Negativo
Nenhuma tira
O indeterminado pode dever-se a seroconverso, infeco por HIV-2 ou reaco

cruzada com outros retrovrus ou contaminao com outro soro positivo.
Tabela 4-7 Antignios presentes nas tiras de immunoblot para o HIV-2.
Antignios
Nomenclatura
Natureza
gp 140
ENV
Precursor de gp 105 e gp 36
gp 105/gp 125
ENV
Glicoprotena de revestimento
p 68
POL
p 56
GAG
Precursor de protenas internas
gp 36
ENV
Glicoprotena transmembranar
Relatrio de Estgio
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Virologia
p 34
POL
Endonuclease
p 26
GAG
Protena interna
p 16
GAG
Protena interna
Relatrio de Estgio
88
Virologia
Tabela 4-8 Interpretao dos perfis possveis para o HIV-2.
Interpretao
Perfil
Positivo
ENV + GAG + POL

ENV + GAG
ENV + POL
GAG + POL
Indeterminado
GAG
POL
ENV
Negativo
Tiras no referenciadas
Nenhuma tira
Podem ser obtidos perfis positivos e indeterminados por contaminao com outro
soro positivo.
4.8.9. Deteco de Vrus do Papiloma Humano (HPV)

No laboratrio de virologia do servio de patologia clnica do IPO, o diagnstico de
HPV segue uma marcha geral mais complexa que os outros vrus e com metodologias
exclusivas, pelo que optei explic-la parte.
O diagnstico de patologias causadas pelo vrus do papiloma humano feito a partir
de esfregaos, bipsias e zaragatoas. Na seguinte figura encontra-se o algoritmo da
deteco de HPV.
Relatrio de Estgio
89
Virologia
Figura 4-2 Marcha geral para o diagnstico das infeces causadas por HPV.
Extraco e purificao de DNA A extraco e purificao do DNA feita em

colunas, manualmente, usando o kit QIAamp MinElte Vrus spin da QIAGEN e
envolve 4 passos: lise, precipitao, lavagem e eluio. A lise feita over-night a 54C
com tampo e proteinase que inactiva as DNases. A precipitao feita com etanol para
permitir a ligao do DNA membrana das colunas pois sendo a molcula de DNA no
solvel em lcool, esta tende a formar um aglomerado e precipitar com centrifugao. A
lavagem, para remover os contaminantes, feita com tampes e etanol e a eluio
feita tambm com tampo para um tubo de microcentrfuga. De seguida, o DNA
quantificado por espectrofotometria a 260 nm.
PCR em Tempo Real O PCR em Tempo Real j foi explicado no subcaptulo 4.2.3.
No diagnstico de HPV, o PCR em tempo real realizado com o corante SYBR Green e
trata-se de um ensaio qualitativo.
RFLPs por PCR clssico Para a genotipagem do HPV, um dos mtodos usados o
da Reaco em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) clssico
associado ao Polimorfismo de Fragmentos de DNA obtidos por enzimas de restrio
Relatrio de Estgio
90
Virologia
(PCR-RFLP). Tal como j foi dito anteriormente, o PCR um mtodo de sntese de
cidos nuclecos in vitro, atravs do qual um determinado fragmento de DNA pode ser
especificamente replicado. Requer a presena de dois oligonucletidos (primers) que
ladeiam o fragmento de DNA a amplificar, e que so usados como iniciadores de uma
srie de reaces sintticas cclicas catalisadas por uma DNA polimerase. A anlise de
RFLPs consiste em submeter a soluo que contm o produto amplificado clivagem
pelas enzimas de restrio (RSA e Dde). O produto resultante submetido a corrida
electrofortica. Os DNAs dos vrios gentipos de HPV tm stios de restrio diferentes
pelo que os fragmentos resultantes vo ter mobilidades electroforticas caractersticas e,
consequentemente, tamanhos diferentes, caractersticos de cada gentipo.
Inno-Lipa A genotipagem de HPV pela metodologia INNO-LiPA (INNO-LiPA HPV
Genotyping Extra da INNOGENETICS) um ensaio que identifica 28 gentipos de
HPV pela deteco de sequncias especficas na regio no conservada L1 do genoma
do HPV. A metodologia consiste em amplificar parte da regio L1 do genoma HPV
usando primers SPF10. Os produtos de amplificao resultantes biotinilados so
hibridizados com sondas oligonucletidas especficas de cada gentipo. As sondas
encontram-se imobilizadas em linhas em tiras de membrana. Aps hibridizao,
adicionada fosfatase alcalina conjugada com estreptavidina, que se liga aos produtos
biotinilados previamente formados, cujo a reaco com o substrato BCIP/NBP vai
resultar numa cor prpura, detectada visualmente. Cada tira contm 4 bandas de
controlo e mais 28 bandas, cada uma correspondente a um gentipo de HPV.
MicroArrays - Outra metodologia usada para a genotipagem do HPV o microarrays,

usando o kit teste PapilloCheck que detecta 24 gentipos de HPV. O princpio deste
ensaio baseia-se na deteco de um fragmento de gene E1 do HPV. Aps a extraco do
DNA, um fragmento de 350 nucletidos do gene E1 e um fragmento do gene humano
ADAT1 so amplificados na presena de primers especficos, resultando fragmentos de
DNA de cadeia nica. Os produtos da amplificao so hibridizados com sondas de
DNA complementares, no chip. Cada array contm 5 rplicas de sondas de DNA,
especficas de cada gentipo de HPV. A fluorescncia dos produtos marcados
(marcados durante o PCR e a hibridizao), resultante da excitao com luz
monocromtica, ento detectada e a anlise feita pelo software CheckReport.
Relatrio de Estgio
91
Virologia
Estes diferentes mtodos de genotipagem tm diferentes sensibilidades e
especificidades pelo que so realizados consoante a quantidade de produto e os
gentipos que se quer detectar.
Relatrio de Estgio
92
Controlo de Qualidade
5. CONTROLO DE QUALIDADE
5.1. Controlo de qualidade interno
A garantia de qualidade tem a responsabilidade de implantar, controlar avaliar e
tomar decises para eliminao das causas que originam as no conformidades.
O controlo de qualidade interno (CQI) trata-se de um conjunto de procedimentos que
permitem, atravs da avaliao da preciso e exactido de cada mtodo, controlar a
qualidade dos resultados das anlises realizadas rotineiramente e indispensvel para a
deteco de erros e a sua imediata correco. Esta garantia de qualidade permite um
diagnstico eficaz. O CQI baseia-se num processo estatstico que permite verificar a
fiabilidade dos resultados das amostras dos utentes, a partir da utilizao regular de
produtos de controlo de qualidade (material de referncia). O material de referncia
deve ser da mesma matriz que as amostras testadas, ou seja, soro humano, sangue total,
urina, etc; existem em 3 nveis (patolgico baixo, normal e patolgico alto) e so
testados nas mesmas condies que as amostras. Na rotina de um laboratrio de anlises
clnicas, podem ocorrer dois tipos de erro: erro aleatrio e erro sistemtico. Os erros
aleatrios cuja direco e magnitude no pode ser prevista, revelam-se atravs da
disperso em redor da mdia de um conjunto de medies efectuadas na mesma amostra
(logo esto relacionados com a preciso de um dado mtodo), Estes erros podem ser
detectados pelas cartas de controlo interno e eliminados atravs do uso de um novo
controlo (nova aliquota ou novo lote). Os erros sistemticos assumem sempre a mesma
direco, provocando um desvio na mdia em relao valor convencionalmente
exacto (logo esto relacionados com a exactido de um dado mtodo), pelo que so
evidenciados ao longo do tempo. Estes erros podem ser causados pela degradao de
reagentes ou deteriorao de algum componente do aparelho e podem ser corrigidos
atravs de uma nova calibrao. A combinao destes dois tipos de erros representa o
erro total. O erro total descreve a contribuio conjunta dos erros aleatrios e
sistemticos e pode funcionar como estimativa da incerteza da medio, ou seja, critrio
de validao.
Nos laboratrios de Bioqumica e Imunologia e Virologiado IPO, apesar de alguns
dos equipamentos terem um programa prprio de CQI, no programa MultiQC que so
introduzidos e transmitidos a partir de todos os equipamentos do laboratrio, todos os
resultados de controlos realizados, bem como calibraes e mudanas de
Relatrio de Estgio
93
lotes/reagentes. Este programa tem como vantagens em relao aos programas dos
prprios equipamentos, as cartas de controlo serem construdas com uma mdia mvel
adaptvel aos resultados obtidos bem como limites de controlo que tanto podem ser
estabelecidos pelo laboratrio, com base em tabelas internacionais, ou pelo fornecedor.
5.1.1. Laboratrio de Bioqumica

No laboratrio de Bioqumica do Servio de Patologia Clnica do IPO, o CQI
abrange todos os parmetros analisados. Os critrios de aceitao para os diversos
parmetros so definidos segundo o erro total admissvel (ETa). O ETa o intervalo de
erro estipulado pelo laboratrio com base em referncias nacionais ou internacionais,
que serve de base para caracterizar as margens de erro aceitveis para um determinado
mtodo, tendo em considerao a utilizao clnica prevista para os resultados.
Nas seguintes tabelas encontram-se os parmetros avaliados por controlo interno,
nmero de nveis, frequncia e o critrio de aceitao.
5.1.1.1. Architect c8000/ci8200

Tabela 5-1 Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento ARCHITECT
c8000/ci8200
Tolerncia/Erro Total
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
cido rico
3 nveis
Manh/tarde
ALT
3 nveis
Manh/tarde
Albumina
3 nveis
Diria
10%
Amilase
3 nveis
Diria
14.6%
AST
3 nveis
Manh/tarde
15.2%
-microglobulina
2 nveis
Diria
Bilirrubina Directa
3 nveis
Manh/tarde
15%
Bilirrubina Total
3 nveis
Manh/tarde
20%
Clcio
3 nveis
Manh/tarde
1 mg/dL
Colesterol
3 nveis
Diria
8.5%
Relatrio de Estgio
Admissvel
17%
<60 U/L8 U/L
>60 U/L15%
<2 g/mL 0.2 g/mL

>2 g/mL10%
94
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Creatina Quinase
3 nveis
Diria
Creatinina
3 nveis
Ferro
3 nveis
Diria
Fosfatase alcalina
3 nveis
Manh/tarde
Fsforo
3 nveis
Manh/tarde
-GT
3 nveis
Manh/tarde
Glucose
3 nveis
Manh/tarde
Hemoglobina A1c
2 nveis
4 feira
Colesterol HDL
3 nveis
Diria
11.1%
Imunoglobulina A
3 nveis
Diria
13.5%
Imunoglobulina G
3 nveis
Diria
8%
Imunoglobulina M
3 nveis
Diria
16.8%
Sdio
3 nveis
Potssio
3 nveis
Cloro
3 nveis
LDH
3 nveis
Manh/tarde
20%
Colesterol LDL
3 nveis
Diria
13.6%
Magnsio
3 nveis
PCR
2 nveis
Diria
10%
Protenas Totais
3 nveis
Diria
10%
Transferrina
3 nveis
Diria
5%
Triglicridos
3 nveis
Diria
25%
Relatrio de Estgio
Manh/tarde
/noite
Manh/tarde
/noite
Manh/tarde
/noite
Manh/tarde
/noite
Manh/tarde
/noite
Admissvel
<100 U/L15 U/L
>100 U/L15%
15%
15%
<100 U/L15 U/L
>100 U/L15%
10.2%
<60 U/L8 U/L
>60 U/L15%
10%
<10% 0.5 g/dL
>10% 5%
4 mmol/L
5.8%
5%
25%
95
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Ureia
3 nveis
Manh/tarde
15.7%
2 nveis
Diria
15%
CK-MB
3 nveis
Diria
25%
Troponina - I
3 nveis
Diria
15%
cido valprico
3 nveis
Carbamazepina
3 nveis
Digoxina
3 nveis
Fenitona
3 nveis
Fenobarbital
3 nveis
Teofilina
3 nveis
Amicacina
3 nveis
Diria
Vancomicina
3 nveis
Diria
Ciclosporina
3 nveis
3 e 6 feira
25%
Tacrolimus
3 nveis
2 e 5 feira
25%
Ferritina
3 nveis
Diria
16%
Folatos
3 nveis
Diria
Protenas
Urina/LCR
Quando h
amostras
Quando h
amostras
Quando h
amostras
Quando h
amostras
Quando h
amostras
Quando h
amostras
Admissvel
15%
25%
20%
25%
10%
25%
<20 g/mL2 g/mL
>20 g/mL10%
<20 g/mL2 g/mL
>20 g/mL10%
<7 ng/mL30%
>7 ng/mL15%
<100 pg/mL27.1
Vitamina B12
3 nveis
Diria
pg/mL
>100 pg/mL20%
Relatrio de Estgio
96
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Admissvel
<30.12 ng/mL6.02
-fetoprotena
3 nveis
Diria
ng/mL
>30.12 ng/mL20%
CA 125
2 nveis
Diria
20%
CA 15.3
2 nveis
Diria
20.9%
CA 19.9
2 nveis
Diria
39%
CEA
2 nveis
Diria
20%
PSA total
2 nveis
Diria
33.6%
SCC
3 nveis
Diria
20%
5.1.1.2. Urisys 2400

Tabela 5-2 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento Urisys 2400
Parmetros
Bilirrubina
Corpos cetnicos
Densidade
Glucose
Hemoglobina
Leuccitos
Nitritos
pH
Relatrio de Estgio
Monitorizao
Frequncia
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Diria
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
97
Parmetros
Protenas
Urobilinognio
Monitorizao
Frequncia
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
5.1.1.3. RapidLab 348

Tabela 5-3 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento RapidLab 348
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
pCO2
3 nveis
Diria
pH
3 nveis
Diria
pO2
3 nveis
Diria
Admissvel
<25 mmHg2 mmHg
>25 mmHg8%
0.04
<100 mmHg5 mmHg
>100 mmHg5%
5.1.1.4. TDx/FLx
Tabela 5-4 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento TDx/FLx
Parmetros
Monitorizao
Metotrexato
6 nveis
Periodicidade
Admissvel
Diria ou quando
<1 mol/L0.1 mol/L
h amostras
>1 mol/L10%
5.1.2. Laboratrio de Imunologia

Tal como no laboratrio de bioqumica, no laboratrio de Imunologia do servio de
patologia clnica do IPO, o CQI abrange todos os parmetros analisados e o critrio de
aceitao o erro total admissvel (ETa).
Nas seguintes tabelas encontram-se os parmetros avaliados por controlo interno,
nmero
de
nveis,
frequncia
critrio
de
aceitao,
ordenados
por
equipamento/metodologia (autoimunidade).
Relatrio de Estgio
98
5.1.2.1. BN ProSpec
Tabela 5-5 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento BN ProSpec
Tolerncia/Erro
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
-1-Micro (Urina)
1 nvel
Quando h amostras
43.9%
-2-Macro (Urina)
1nvel
Quando h amostras
34.7%
Total Admissvel
<2000 mg/dL200
Albumina
2 nveis
Quando h amostras
mg/dL
>2000 mg/dL10%
<100 mg/dL10
Albumina LCR
1 nvel
Quando h amostras
mg/dL
>100 mg/dL10%
Microalbumina
1 nvel
Alfa-1-Antitripsina
3 nveis
C3
3 nveis
C4
3 nveis
Ceruloplasmina
3 nveis
Haptoglobina
3 nveis
Diria (2 nveis)
27.3%
IgA LCR
1 nvel
Quando h amostras
15%
IgM LCR
1 nvel
Quando h amostras
15%
IgG LCR
1nvel
Quando h amostras
15%
IgG
3 nveis
IgG Ur
1 nvel
IgG1
3 nveis
IgG2
3 nveis
Relatrio de Estgio
Quando h amostras
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
46.1%
20%
12%
11.5%
7.9%
8%
20%
15%
15%
99
Frequncia
Tolerncia/Erro
Parmetros
Monitorizao
IgG3
3 nveis
IgG4
3 nveis
IgE
3 nveis
IgM
3 nveis
IgD
1 nvel
Quando h amostras
20%
Kappa
3 nveis
Diria (2 nveis)
15.0%
Kappa Ur
1 nvel
Quando h amostras
15%
Kappa Livre
2 nveis
Diria (1nvel)
30%
Lambda
3 nveis
Diria (2 nveis)
15.0%
Lambda Ur
1 nvel
Quando h amostras
15%
Lambda livre
2 nveis
Diria (1nvel)
20%
Pr-albumina
3 nveis
Diria (2 nveis)
14.5%
RA
1 nvel
Quando h amostras
13.5%
TASO
1 nvel
Quando h amostras
10%
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Quando h amostras
(2 nveis)
Total Admissvel
15%
15%
20%
16.8%
5.1.2.2. Cobas e411

Tabela 5-6 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento Cobas e411
Tolerncia/Erro
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
CA 72.4
2 nveis
3 e 6 feiras
20%
NSE
2 nveis
3 e 6 feiras
20%
Cyfra 21.1
2 nveis
3 e 6 feiras
28.2%
Relatrio de Estgio
Total Admissvel
100
5.1.2.3. Hydrasys/Hydraplus
Tabela 5-7 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento
Hydrasys/Hydraplus
Tolerncia/Erro
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Albumina
2 nveis
Diria (1 nvel)
10%
Alfa-1globulina
2 nveis
Diria (1 nvel)
15.7%
Alfa-2 globulina
2 nveis
Diria (1 nvel)
12.6%
Beta-2 globulina
2 nveis
Diria (1 nvel)
15%
Gama globulina
2 nveis
Diria (1 nvel)
16.8%
Total Admissvel
5.1.2.4. Autoimunidade Imunofluorescncia Indirecta

Tabela 5-8 Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados por imunofluorescncia indirecta, na
autoimunidade.
Parmetros
ANA
ANCA
FI
Tecidos
VSM47
DNA
Relatrio de Estgio
Monitorizao
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Controlo Negativo
Controlo Positivo
Frequncia
Diria
Diria
Diria
Diria
Diria
Diria
101
Tabela 5-9 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados por ELISA, na autoimunidade.
Parmetros
Monitorizao
ATC anti-
Controlo Negativo*
Cardiolipina IgG
Controlo Positivo
ATC anti-
Controlo Negativo*
Cardiolipina IgM
Controlo Positivo
ATC anti-
Controlo Negativo*
2Glicop I IgG
Controlo Positivo
ATC 2Glicop I
Controlo Negativo*
IgM
Controlo Positivo
ATC anti-APCA
Ncx
Controlo Positivo
ATC anti-AMA-
Controlo Negativo*
M2-3E
Controlo Positivo
IgA
ATC antiTransglutaminase
IgG
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Controlo Positivo
Controlo Negativo*
Transglutaminase
Tolerncia
Controlo Negativo*
ATC anti-dsDNA-
ATC anti-
Frequncia
Controlo Negativo*
Controlo Positivo
Controlo Negativo*
Controlo Positivo
*A monitorizao do controlo negativo dos diferentes ensaios no obedece ao tipo de avaliao

estabelecida para os Controlos Positivos. Neste caso, devem estar dentro dos intervalos definidos como
Negativo.
Tabela 5-10 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados por Immuno blot, na autoimunidade
Ensaio
Monitorizao
Periodicidade
Controlo Interno
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Kit
ANA Profile 3 IgG
Relatrio de Estgio
102
Ensaio
Monitorizao
Periodicidade
Controlo Interno
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Kit
Controlo Interno
Por Corrida
e GBM (IgG)
Controlo Positivo
Por Kit
Perfil Esclerose
Controlo Interno
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Kit
Controlo Interno
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Kit
Perfil Miosites IgG
Perfil anti-MPO,PR3
sistmica (IgG)
Perfil Heptico IgG
5.1.2.5. Diagnstico de infeces

Tabela 5-11 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no diagnstico das infeces, por
hemaglutinao indirecta e aglutinao em lmina.
Ensaio
RPR
TPHA
Reaco Widal
Monotest
Reaco Huddleson
Brucella Capt
Waaler-Rose
Hidatidose
Relatrio de Estgio
Monitorizao
Periodicidade
Controlo Negativo
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
NA
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
NA
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Corrida
Controlo Negativo
Por Corrida
Controlo Positivo
Por Corrida
103
Tabela 5-12 - Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no diagnstico das infeces, por
ELISA.
Ensaios
Monitorizao
Treponema
Controlo Negativo*
pallidum IgG/IgM
Controlo Positivo
Treponema
Controlo Negativo*
pallidum IgM
Controlo Positivo
Periodicidade
Tolerncia
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Controlo Negativo*
Aspergillus EIA
Controlo Positivo
*A monitorizao do controlo negativo dos diferentes ensaios no obedece ao tipo

de avaliao estabelecida para os Controlos Positivos. Neste caso, devem estar dentro
dos intervalos definidos como Negativo.
5.1.3. Laboratrio de Virologia

No laboratrio de virologia do Servio de Patologia Clnica do IPO, alm dos
controlos internos dos kits, tambm so usados controlos Accurun, que servem tanto
como controlos internos como para controlos externos, sendo os valores comparados
com outros laboratrios que os usem (atravs do software Intencle). O controlo de
qualidade dos ensaios realizados no laboratrio de virologia e descritos no captulo 4
encontram-se nas seguintes tabelas.
5.1.3.1. Architect i2000Sr
Tabela 5-13 -Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento Architect.
Tolerncia/
Vrus
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Erro total
admissvel
CMV IgM
Citomegalovrus
Controlo negativo*
Controlo positivo
Diria
30%
Diria
30%
Diria
30%
Controlo negativo*
CMV IgG
Controlo positivo 1
Controlo positivo 2
HTLV
HTLV I +II
Relatrio de Estgio
Controlo negativo*
104
Tolerncia/
Vrus
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Erro total
admissvel
Controlo positivo
Accurun
Controlo negativo*
HIV
HIV-1 e
Controlo positivo 1
HIV2 + Ag p
Controlo positivo 2
24
Controlo positivo Ag
Diria
30%
Accurun
Controlo negativo*
AgHBs
Controlo positivo
30%
Accurun
Controlo negativo*
Core total
Controlo positivo
25%
Accurun
Controlo negativo*
Hepatite B
Anti-HBs
Controlo positivo 1
Diria
30%
Controlo positivo 2
AgHBe
Anti-HBe
Core IgM
Relatrio de Estgio
Controlo negativo*
Controlo positivo
Controlo negativo*
Controlo positivo
Controlo negativo*
Controlo positivo
30%
30%
30%
105
5.1.3.2. LIAISON
Tabela 5-14 Controlo de qualidade interno para os parmetros determinados no equipamento LIAISON.
Vrus
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Tolerncia/Erro
total admissvel
Controlo
CMV IgM
negativo*
Controlo
Diria
positivo
Citomegalovrus
Controlo
CMV IgG
negativo*
Controlo
Diria
30%
positivo
Controlo
VCA IgM
negativo*
30%
Controlo
positivo
Controlo
VCA IgG
negativo*
Vrus Epstein-
positivo
Barr
Controlo
EBNA IgG
30%
Controlo
negativo*
Controlo
Diria
30%
positivo
Controlo
EA IgG
negativo*
Controlo
30%
positivo
Relatrio de Estgio
106
5.1.3.3. Ensaios manuais

Tabela 5-15 - de qualidade interno para os parmetros determinados manualmente.
Vrus
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Tolerncia/Erro
total admissvel
Controlo
Vrus Herpes
Humano tipo 6
negativo
HHV6 IgG
Controlo
Diria
30%
positivo
Branco
Controlo
positivo
Citomegalovrus
Clulas positivas
Diria
(ncleo corado de
vermelho)
Antigenmia
Comparao de
CMV pp65
Resultado
Mensal
resultados entre
diferentes
operadores
Controlo
negativo
Controlo
Herpes Humano
tipo 6
HHV6 IgM
positivo
Diria
Diria
Sem
fluorescncia
Fluorescncia >
2+
Comparao de
Resultados
Diria
resultados entre
diferentes
operadores
Controlo
negativo
Controlo
Herpes Humano
tipo 8
HHV8 IgG
positivo
Diria
Diria
Sem
fluorescncia
Fluorescncia >
2+
Comparao de
Resultados
Diria
resultados entre
diferentes
operadores
Relatrio de Estgio
107
Vrus
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Tolerncia/Erro
total admissvel
Presena das
bandas de
Controlo
negativo
controlo , 1+ e
Por corrida
3+. Ausncia de
bandas
especficas de
HTLV I/II
Confirmatrio
Presena das
HTLV
bandas de
controlo e de,
Controlo
positivo
pelo menos,
Por corrida
intensidade nas
bandas: p19 I/II,
p24 I/II, gp 46
I/II, gp 21 I/II,
gp46 I
Controlo
negativo HPV
Por corrida
Controlo
negativo
HPV SYBR
Green
Vrus Papiloma
Por corrida
Albumina
Controlo
positivo HPV 18
Por corrida
(Clulas HEla)
Humano
Controlo
positivo
Por corrida
Albumina
HPV
Controlo
MicroArrays
negativo
HPV
Controlo
INNOLIPA
negativo
Relatrio de Estgio
Por corrida
Por corrida
108
Vrus
Parmetros
Monitorizao
Frequncia
Controlo
positivo
Tolerncia/Erro
total admissvel
Por corrida
5.2. Avaliao externa da qualidade

A avaliao externa da qualidade (AEQ) consiste na avaliao dos resultados obtidos
no laboratrio, por um organismo externo. Tal feito atravs do envio de uma amostra
controlo, fornecida pela entidade externa. A AEQ permite avaliar a exactido,
identificar erros sistemticos ou tendncias. No mbito da AEQ existem vrios
programas:
INSA (PNAEQ) Instituto Dr. Ricardo Jorge (Portugal)
QCMD - Quality Control Molecular Diagnostics
INSTAND
RIQAS Irlandox (Irlanda)
NEQAS National External Quality Assessment Scheme (Reino Unido)
No laboratrio, as amostras so tratadas nas mesmas condies que as amostras de
pacientes e os resultados so enviados entidade respectiva.
O tratamento de dados da responsabilidade da entidade externa que envia um
relatrio em que constam os resultados de todos os laboratrios participantes.
Dependendo do resultado, o laboratrio pode ter que aplicar medidas correctivas ou
preventivas. Caso o resultado fique fora dos limites 2SD ou 3SD (critrio de aceitao
da maioria dos programas), deve ser reanalisado. Caso o resultado persista deve-se
proceder verificao do erro e calibrao. Os resultados obtidos com a calibrao
anterior devem ser avaliados e, se necessrio, proceder a nova anlise.
5.2.1. Laboratrio de Bioqumica

Na tabela seguinte encontra-se descrita a avaliao externa dos parmetros
analisados no laboratrio de Bioqumica do IPO.
Relatrio de Estgio
109
Tabela 5-16 Avaliao externa da qualidade dos parmetros determinados no laboratrio de bioqumica.
Entidade
Parmetro
Organizadora
Frequncia Anual
(N Amostras)
Pr - analtica
2 X Ano
Ps - analtica
2 X Ano
Segurana Laboratorial
1 X Ano
Urina tipo II
3 X Ano (2 amostras)
Imunologia (PCR, 2-Microglobulina,

IgA, IgG, IgM Trasnferrina
Hemoglobina Glicada
Qumica Clnica Rotina I (cido rico,

Bilirrubina total, Clcio, Colesterol,
Creatinina, Ferro, Fsforo, Glucose,
INSA (PNAEQ)
Magnsio, Triglicridos, ureia

Qumica Clnica Rotina II (ALT, AST,
ALP, Colesterol, Colestrol HDL,
Colestrol LDL, CK, Creatinina, GGT,
Ionograma, LD, Protenas totais, cido
valprico, Carbamazepina, Digoxina,
4 X Ano (1 amostra)
Fenitona, Fenobarbital, Folatos,

Teofilina, Vancomicina, Vitamina B12,
CEA, PSA total
Marcadores Cardacos (CK-MB,
Troponina-I
Drogas teraputicas
(Amicacina/Vancomicina/MTX)
Gases no sangue
Urina Qumica II (cido rico, Clcio,

INSTAND
Creatinina, Fsforo, Glucose, Ionograma,
Magnsio, Ureia, 2-Microglobulina

Marcadores Tumorais (AFP,
CEA,CA125, CA19.9, CA 15.3 PSA
total, SCC
Relatrio de Estgio
110
Entidade
Parmetro
Organizadora
Frequncia Anual
(N Amostras)
Qumica Clnica Geral (soro) (cido

rico, Albumina, Amilase, ALT, AST,
ALP, Bilirrubina total, Bilirrubina
directa, Clcio, Colestrol, CK,
Creatinina, Ferro, Fsforo, GGT,
2 X Ms (1 amostra)
Glucose, Ionograma, LD, Magnsio,

Protenas totais, Triglicridos, Ureia,
IRLANDOX
UIBC, PSA total
(RIQAS)
Protenas Especficas (AFP, PCR,

Ferritina, 2-Microglobulina, IgA, IgG,
2 X Ms (1 amostra)
IgM, Transferrina
Imunoensaio (cido Valprico,
Carbamazepina, Digoxina, Fenitona,
Fenobarbital, Teofilina, Folatos,
2 X Ms (1 amostra)
Vitamina B12, CA 125, CA15.3, CA

19.9, CEA, PSA total, Ferritina,
BIOGNSTICA
Ciclosporina
1 X Ms (3 amostras)
(NEQAS)
Tacrolimus
1 X Ms (3 amostras)
Relatrio de Estgio
111
5.2.2. Laboratrio de Imunologia
Tabela 5-17 - Avaliao externa da qualidade dos parmetros determinados no laboratrio de imunologia.
Entidade
Parmetros
organizadora
Frequncia
-1-Antitripsina, Albumina, C3, C4,

RIQAS
Ceruloplasmina, IgE Haptoglobina,
2x/Ms
Kappa, Lambda, Kappa Livre, Lambda
(1 amostra)
livre, RA e TASOm Pr-albumina

-1-Antitripsina, Albumina, C3, C4,
Ceruloplasmina, IgE Haptoglobina,
2x/Ano
Kappa, Lambda, Kappa Livre, Lambda
(2 amostras)
livre, RA e TASOm Pr-albumina

INSA (PNAEQ)
INSTAND
Proteinograma
4x/Ano (2 Amostras)
Electroforese das hemoglobinas
2x/Ano (2 Amostras)
Sfilis
3x/Ano (1 Amostra)
Brucelose
3x/Ano (1 Amostra)
Albumina Ur
6x/Ano (2 Amostras)
Albumina, IgA, IgM e IgG LCR
4x/Ano (2 Amostras)
CA 72.4, NSE, Cyfra 21.1
2x/Ano (2 Amostras)
ASMA /F -actina
2x/Ano (2 Amostras)
AMA
2x/Ano (2 Amostra)
APCA
2x/Ano (2 Amostras)
LKM -1
2x/Ano (2 Amostras)
Sfilis
2x/Ano (2 Amostras)
Salmonelose
2x/Ano (2 Amostras)
Hidatidose
1x/Ano (2 Amostras)
Imunofixao
NEQAS
Imunofixao Bence-Jones
Relatrio de Estgio
6 x /Ano
(Soro e urina)
6x/Ano
(Soro e urina)
112
Entidade
organizadora
Parmetros
Frequncia
Imunofixao LCR
6x/Ano (1 Amostra)
ANA IIF
5x/Ano (2 Amostras)
tTg IgA,
DNA IFI
ANCA IFI, PR3, MPO
ATC anti-Cardiolipina IgG, IgM, ATC
anti-2Glicop I IgG,IgM
5 x /Ano (2
Amostras)
5x/Ano (2 amostras)
5x/Ano (2 Amostras)
2x/Ano (2 Amostras)
ANA IIF
1x/Ano (1 Amostra)
DNA IFI
1x/Ano (1 Amostra)
ASMA /F -actina
1x/Ano (1 Amostra)
AMA
1x/Ano (1 Amostra)
ANA IIF
2x/Ano (3 Amostras)
DNA IFI
2x/Ano (2 Amostras)
ANCA IFI, PR3, MPO
2x/Ano (2 Amostras)
ATC anti-Cardiolipina IgG, IgM, ATC

anti-2Glicop I IgG,IgM
No disponvel
Amostras)
Sfilis
MBL
Euroimunn
5 x /Ano (2
2x/Ano (2 Amostras)
-1-Micro, -2-Macro Ur
NA
IgD
NA
IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4
NA
IgG Ur, Lambda Ur, Kappa Ur
NA
IgG,IgA, IgM
NA
5.2.3. Laboratrio de Virologia

O laboratrio de virologia do servio de patologia clnica do IPO tem implementado
programas de avaliao externa de qualidade para a serologia e biologia molecular.
Na tabela seguinte encontra-se os programas de AEQ, bem como a respectiva
frequncia, que realizam avaliao externa dos parmetros descritos anteriormente.
Relatrio de Estgio
113
Tabela 5-18 - Avaliao externa da qualidade de alguns parmetros determinados no laboratrio de virologia.
Parmetros
Programas AEQ
Frequncia
Serologia CMV IgG e IgM
Instand
2x/ano
QCMD
1x/ano
Instand
1x/ano
Antigenmia CMV pp65
No disponvel
No se aplica
Serologia HHV-8 IgG
No disponvel
No se aplica
Carga viral HHV-8
No disponvel
No se aplica
No disponvel
No se aplica
No disponvel
No se aplica
Instand
2x/ano
Instand
2x/ano
QCMD
1x/ano
Instand
1x/ano
InterQC
Semanal
Instand
2x/ano
InterQC
Semanal
Intencle
Semanal
Instand
2x/ano
InterQC (AgHBs, Core)
Semanal
Instand
2x/ano
Intencle
Semanal
NEQAS
3x/ano
QCMD
1x/ano
WHO HPV LabNet
Varivel
Instand
2x/ano
Carga viral CMV
Serologia HHV-6 IgG e

IgM
Carga viral HHV-6
Serologia Parvovrus B19
IgG e IgM
Serologia EBV VCA IgG,
EBNA IgG, EA IgG e
VCA IgM
Carga viral EBV
Serologia HTLV
Serologia HIV (com
confirmatrio)
Serologia Hepatite B
Serologia Hepatite C
Vrus Papiloma Humano
Relatrio de Estgio
114
RELATRIO DE ESTGIO
CLNICA DE DIAGNSTICOS DR. FERNANDO TEIXEIRA
ORIENTAO:
Dr Manuela Azevedo
2011
Introduo Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira
INTRODUO CLNICA DE DIAGNSTICOS DR. FERNANDO TEIXEIRA

O estgio correspondente valncia de Microbiologia foi feito na Clnica de
Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira, em Lisboa.
A Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira resultou da continuidade de um
laboratrio familiar iniciado nos anos 50 (Laboratrio Dr. Custdio Teixeira e Dr.
Fernando Teixeira), tendo a nova designao resultado da continuidade dada pelo Dr.
Fernando Teixeira, no incio da dcada de 60, apenas com o nome individual de
Laboratrio Dr. Fernando Teixeira.
O laboratrio encontra-se acreditado pelo IPAC desde 2002, primeiro pela norma NP
EN ISO/IEC 17025, e posteriormente pela NP EN ISO 15189 de aplicao especfica a
laboratrios clnicos.
A Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira faz parte da rede de laboratrios de
diagnstico internacionais, Labco. Presentemente, encontra-se situada no centro de
Lisboa mas est aliada a uma rede de cerca de 29 postos de colheita espalhados pelo
pas.
A clnica constituda por recepo, central de colheitas, laboratrios das diversas
reas (Hematologia, Microbiologia, Bioqumica, etc), rea de controlo de qualidade e
rea administrativa.
Relatrio de Estgio
116
Microbiologia
6. MICROBIOLOGIA
6.1.
Objectivo
O estgio na valncia Microbiologia faz parte integrante do plano de estudos do

Mestrado em Anlises Clnicas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa. O
estgio decorreu no Laboratrio de Microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr.
Fernando Teixeira do Instituto, sob a orientao da Dr Manuela Azevedo.
6.2.
Introduo
O Laboratrio de Microbiologia responsvel por examinar amostras colhidas dos

doentes para pesquisa de microrganismos potencialmente patognicos e determinar a
sensibilidade dos mesmos em relao a antibiticos. O Laboratrio deve fornecer,
rpida e economicamente, a informao que possa ser til ao mdico no tratamento dos
seus doentes para alm de registar e investigar novos factos que surjam no decorrer da
actividade.
O laboratrio recebe os seguintes produtos biolgicos:
Exsudados genitais;
Exsudado rectal;
Exsudado auricular/ocular;
Exsudado nasofarngeo;
Expectorao;
Secrees brnquicas;
Lavado bronco-alveolar;
Lquidos orgnicos;
Lquido cfalorraquidiano;
Exsudado de ferida;
Esperma;
Hemocultura;
Urina assptica;
Fezes;
Escamas de pele, fios de cabelo e unhas.
Relatrio de Estgio
117
Microbiologia
6.3.
Laboratrio de Microbiologia
6.3.1. Equipamento
O laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira
envolve bacteriologia, micologia e parasitologia e encontra-se separado dos restantes
laboratrios. As instalaes encontram-se equipadas com:
Equipamento geral
Filtro para renovao de ar;
Estufas de incubao, a 30C e 37C, calibradas;
Frigorficos;
Centrifugas;
Microscpios pticos;
Cmara de fluxo laminar;
Bico de Bunsen;
Vrtex
Cmara de fluxo laminar;
Equipamento especfico:
VITEK 2 da BioMrieux
Mini API da BioMrieux
6.3.1.1. VITEK 2
O equipamento de identificao automtica usado no laboratrio de microbiologia
o VITEK 2. Este equipamento automatiza todos os passos para chegar identificao e
aos testes de sensibilidade. O VITEK 2 constitudo por uma estao de enchimento,
incubadora/leitor, computador e impressora. A estao de enchimento trata-se de uma
cmara de vcuo que fora as amostras diludas a fluir para as cartas. A
incubadora/leitor incuba e faz a leitura das cartas tendo como metodologia, a
colorimetria para a identificao e a turbidimetria para os antibiogramas. As cartas de
identificao contm substratos desidratados usados pelas bactrias e leveduras
enquanto as cartas teste de sensibilidade contm antibiticos desidratados. A reaco
das bactrias e/ou leveduras com os substratos e antibiticos vai resultar numa cor ou
turvao, lida pelos sensores fotomtricos. O computador, onde se encontra o software
Relatrio de Estgio
118
Microbiologia
do equipamento, armazena os dados, processa-os, interpreta-os e transmite-os para a
impressora.
As cartas de identificao usadas no laboratrio so:
GP card identificao de bactrias gram positivo.
GN card identificao de bactrias gram negativo.
NH card identificao de Neisseria spp., Haemophilus spp., Campylobacter
spp., etc.
YST card identificao de leveduras.
6.3.1.2. Mini API

O equipamento mini API usado no laboratrio de microbiologia da clnica com o
objectivo de fazer o teste de sensibilidade aos Haemophilus spp. e Moraxella
catarrhalis, atravs da galeria ATB HAEMO; e Streptococcus -hemolticos atravs da
galeria ATB STREP 5, testes estes que no so feitos pelo VITEK 2. As galerias so
constitudas por pares de cpulas, com uma ou duas concentraes (c e C). O mini API
l a turvao presente nas cpulas, resultante da reaco da bactria com o antibitico.
A leitura feita da seguinte maneira:
Para os antibiticos testados com duas concentraes:

Tabela 6-1 Leitura dos resultados dos antibiticos testados com duas concentraes.
Aspecto das cpulas
Resultados
A estirpe :
Claro
Claro
Sensvel
Turvo
Claro
Intermdio
Turvo
Turvo
Resistente
Relatrio de Estgio
119
Microbiologia
Para os antibiticos testados com uma nica concentrao:

Tabela 6-2 - Leitura dos resultados dos antibiticos testados com uma concentrao.
Aspecto da cpula
Resultado
A estirpe :
Claro
Sensvel
Turvo
Resistente
6.3.2. Antibiticos e antibiogramas

Um antibitico um agente antimicrobiano de origem natural (produzido por
microrganismos) ou sinttica que actua contra agentes infecciosos. A sua aco tem
como alvo fases do metabolismo bacteriano.
As diferentes estirpes de algumas espcies patognicas tm sensibilidades constantes
para permitirem a escolha do antibitico a utilizar, com base apenas na sua
identificao. No entanto, para a maioria das bactrias patognicas, as respectivas
estirpes diferem quanto sensibilidade aos antibiticos, sendo necessrio determinar,
para a estirpe isolada e, por meios de ensaios laboratoriais, a gama de antibiticos que
se revelam activos contra essa estirpe - o antibiograma (ou TSA, teste de sensibilidade
aos antibiticos).
No mbito das anlises clnicas, o laboratrio de microbiologia tem a
responsabilidade de avaliar, in vitro, as interaces entre o microrganismo isolado e os
agentes antimicrobianos para tratamento in vivo. Os objectivos de se fazer um TSA so
medir a susceptibilidade de uma estirpe bacteriana em relao a um ou mais antibiticos
permitir a monitorizao da evoluo da resistncia bacteriana.
Contudo, o tratamento contra um agente patognico que se revelou sensvel no
laboratrio, ao antibitico aplicado, pode falhar porque o referido antibitico no
adequadamente absorvido pelo doente ou porque no penetra, com concentrao
suficiente, nos locais menos acessveis de proliferao da bactria, ou ainda, porque
inactivado por outro microrganismo concomitante, resistente ao antibitico.
O resultado de um TSA (sensvel, resistente ou sensibilidade intermdia) depende da
concentrao mnima inibitria (CMI), concentrao mnima de antibitico que inibe o
crescimento visvel da bactria a testar.
Relatrio de Estgio
120
Microbiologia
No Laboratrio de Microbiologia da clnica, so usados os seguintes mtodos para

realizar um TSA:
Difuses em disco Colocam-se discos com uma quantidade nica, geralmente
elevada, de antibitico, sobre um inoculo de densidade rigorosamente padronizada, em
gelose de Muellher-Hinton (simples, sangue ou de chocolate). Consideram-se trs graus
de sensibilidade: sensvel, intermdio e resistente, por comparao dos dimetros das
zonas de inibio com os das tabelas de referncia. No Laboratrio este mtodo usado
para N. gonorrhoeae.
Galerias mini API - as galerias usadas no laboratrio so:
ATB HAEMO permite determinar a sensibilidade dos Haemophilus e
Moraxela catarrhalis. Aps incubao, a leitura do crescimento pode ser feita
visualmente ou no equipamento mini API.
ATB STREP 5 permite determinar a sensibilidade dos estreptococos e
pneumococos aos antibiticos bem como determinar a CMI de dois -lactmicos
para os pneumococos (penicilina e cefotaxima). Aps incubao, a leitura do
crescimento pode ser feita visualmente ou no equipamento mini API (Tabela 6-1
e Tabela 6-2).
Para ambas as galerias, a interpretao e validao dos resultados devem ser
efectuados tendo em conta o contexto clnico, a origem da amostra, identificao da
estirpe e os resultados de testes complementares, quando existem.
Galeria MycoView - O kit MycoView, para alm de permitir a identificao de
Ureaplasma spp. (Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum) e Mycoplasma
hominis a partir de produtos urogenitais, tambm permite testar a resistncia das
espcies a nove antibiticos. O princpio do teste baseia-se nas propriedades
metablicas especficas e resistncia natural de cada espcie:
U. urealyticum: Hidrlise da ureia e resistncia lincomicina.
M. hominis: Hidrlise da arginina e resistncia eritromicina.
O crescimento das duas espcies visualizado pela mudana de cor do indicador
de pH de amarelo alaranjado para vermelho ou rosa.
Cartas teste de sensibilidade a antibiticos do VITEK 2 No Laboratrio para o
equipamento VITEK 2 so usadas cartas para a determinao da sensibilidade de
Relatrio de Estgio
121
Microbiologia
estafilococos, enterococos e estreptococos do grupo B e D e bacilos gram negativo a
agentes antimicrobianos.
6.3.3. Rotina
Na rotina do laboratrio de microbiologia so usados vrios testes e meios de cultura
para se proceder identificao dos microrganismos patognicos presentes em cada
produto biolgico.
Para facilitar a organizao dos fluxogramas da marcha geral de cada produto, optei
por fazer fluxogramas que ilustram alguns passos da marcha geral para a identificao
das bactrias gram positivo e gram negativo, bem como para a identificao de
leveduras que apresentem crescimento no exame cultural micolgico. (Figuras 6-1
Figura 6-7).
A fim de ajudar na identificao dos microrganismos, no Laboratrio de
Microbiologia da clnica so realizados os seguintes testes:
Teste da catalase
O teste da catalase utilizado para detectar a presena da enzima catalase atravs da
decomposio de perxido de hidrognio em oxignio e gua, que ocorre na maioria das
bactrias aerbias e anaerbias facultativas que contm citocromo. A espcie
Streptococcus negativa para o teste, pelo que este permite distinguir os estreptococos
dos estafilococos.
Teste da coagulase
O teste da coagulase utilizado para detectar a presena da enzima coagulase capaz
de coagular o plasma. A actividade da coagulase utilizada para distinguir espcies
patognicas de Staphylococcus de espcies no patognicas, sendo um bom indicador da
presena de S. aureus. O teste pode ser feito em lmina ou em tubo, colocando em
contacto a espcie em estudo com plasma. Na reaco positiva observa-se a formao
de cogulos (em tubo) ou de pequenos agregados (em lmina).
Teste de sensibilidade optoquina

Difuso em disco, realizado apenas para organismos que apresentem hemlise .
Tendo em conta que o Streptococcus pneumoniae o nico organismo sensvel
optoquina, o teste permite distingui-lo dos restantes estreptococos com hemlise .
Relatrio de Estgio
122
Microbiologia
Teste de sensibilidade de Bacitracina+ SXT

Difuso em discos, realizado para organismos que apresentem hemlise . Trata-se
de um teste presuntivo da presena de Streptococcus agalactiae, quando se observa
resistncia bacitracina ou de Streptococcus do grupo A quando se observa
sensibilidade bacitracina.
Testes de aglutinao
Trata-se de um teste em que as partculas de ltex esto sensibilizadas com o
anticorpo especfico do grupo e aglutinar-se-o na presena do antignio homlogo.
Este fundamento usado nos testes de identificao dos estreptococos dos grupos de
Lancefield A, B, C, D, F e G e dos subtipos de Escherichia coli.
Teste de oxidase
O teste da oxidase utilizado para verificar a presena ou a ausncia da enzima
citocromo oxidase. Ajuda a caracterizar espcies de Neisseria, distingue bactrias no
fermentadoras (oxidase positiva) de enterobactrias (oxidase negativa). No laboratrio
so usadas tiras impregnadas com N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina monohidrocloridrato. Este reagente, quando oxidado, tem a cor prpura. No teste de oxidase,
o citocromo oxidase produzido pelo microrganismo no oxida directamente o reagente
mas sim o citocromo C que, por sua vez, oxida o reagente para formar um composto
com a cor prpura.
TSI, Lisina e Ureia

Os meios TSI (Triple Sugar Iron), lisina e ureia so usados como testes bioqumicos,
no laboratrio de microbiologia, para distinguir algumas enterobactrias: Salmonella,
Shigella e Proteus.
O meio TSI contm glicose, lactose, sacarose, indicador de pH (vermelho de fenol
para detectar a produo de cidos resultantes da fermentao dos hidratos de carbono),
tiossulfato de sdio, sendo este um substrato para distinguir produtores de sulfureto de
hidrognio (H2S), e sulfato de ferro para deteco desse produto final. A leitura faz-se
da seguinte maneira: na rampa faz-se a leitura da lactose e sacarose, no fundo da glicose
e no meio do cilindro (onde foi inoculado) a de H2S. Aps incubao podem ser
Relatrio de Estgio
123
Microbiologia
determinadas as actividades fermentativas, a produo de gs e a produo de H2S,
podendo ocorrer os seguintes resultados:
Cilindro cido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): Apenas glicose
fermentada e alguma produo de cido. Todas as enterobactrias fermentam
glicose. No entanto, a fermentao apenas de glicose caracterstica de Shigella,
Salmonella e Proteus.
Cilindro cido (amarelo) e rampa cida (amarelo). Fermentao dos trs hidratos
de carbono e produo de cido.
Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelho): Sem fermentao dos
hidratos de carbono, nem produo de gs ou de H2S.
Produo de gs: Observa-se fracturas no meio de cultura. Dos trs
microrganismos
Produo de H2S: Observa-se cor negra na zona intermdia do cilindro. O
microrganismo em estudo capaz de produzir sulfureto de hidrognio (H2S).
Dos trs microrganismos referidos Salmonella e Proteus produzem HcS.
O meio de lisina usado para distinguir as enterobactrias que descarboxilam a lisina
das que no tm essa capacidade. O meio contm o aminocido, glicose e um indicador
de pH (prpura de bromocresol). Antes da incubao deve ser colocado leo para
fornecer condies de anaerobiose (a fim de inibir a reaco). Os cidos produzidos
pelas bactrias a partir da fermentao da glicose vo inicialmente baixar o pH do meio
e causar a mudana de cor do indicador de pH de prpura para amarelo. O pH cido
activa ento a enzima que causa a descarboxilao da lisina e a subsequente
neutralizao do meio que muda de amarelo para prpura. Tanto a espcie Samonella
como Proteus tm a capacidade para descarboxilar a lisina.
O meio de ureia serve para distinguir as bactrias produtoras de urease das que no o
so. O meio, para alm de ureia, contm o indicador de pH (vermelho de Fenol). Na
presena de urease, a ureia convertida em amnia, tornando o meio alcalino. Este
aumento de pH faz com que o indicador de pH passe de amarelo a vermelho, sendo uma
reaco positiva para a presena de urease. Das trs enterobactrias referidas, apenas
Proteus produz urease.
Teste dos factores, V, X e XV
Relatrio de Estgio
124
Microbiologia
Os factores V, X e XV, em disco, so usados para identificar o gnero de
Haemophilus, entre Haemophilus influenzae e Haemophilus parainfluenzae. O
Haemophilus influenzae necessita do factor X ou de uma substncia aquecida estvel de
hemoglobina (hemina) e do factor V ou de uma substncia lbil aquecida (dinucletido
de adenina nicotinamida, NAD). O H. parainfluenzae necessita apenas do factor V. A
identificao feita atravs da observao de crescimento dos respectivos discos em
gelo se Mueller-Hinton simples.
Teste germinativo
O teste germinativo consiste em verificar a formao de tubos germinativos em soro
humano, em menos de 2 horas, a partir de colnias suspeitas de leveduras. A observao
de tubos germinativos, ao microscpio, identificativa de Candida albicans.
Colorao de Gram
A colorao de Gram usada para distinguir bactrias gram negativo das bactrias
gram positivo. Na tcnica de Gram, as bactrias so coradas com um corante violeta de
genciana. As bactrias gram positivo apresentam cor roxa, porque a sua parede formada
por peptidoglinanos, permite a reteno do corante. As bactrias gram negativo, por
terem a parede celular sob uma membrana, no tm a capacidade de reter ao corante.
Colorao de Ziehl-Neelsen
No laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira, a
colorao de Ziehl-Neelsen usada, essencialmente, para detectar bacilos de
tuberculose, Mycobacterium tuberculosis. As micobactrias, como Mycobacterium
tuberculosis, uma vez coradas vo resistir fortemente descolorao, mesmo por cidos
ou lcool, designadas assim de cido-lcool resistentes. Esta caracterstica devido
elevada quantidade de lpidos na parede celular, conferindo hidrofobicidade. A tcnica
de Ziehl-Neelsen evidencia esta cido-lcool resistncia.
Colorao de Wright modificado

A tcnica de Wright modificado consiste numa modificao da colorao de
Romanowsky utilizada para a diferenciao atravs da colorao dos elementos
Relatrio de Estgio
125
Microbiologia
celulares do sangue. Com esta colorao, o ncleo dos leuccitos e o citoplasma
assumem uma colorao caracterstica azul e rosa, respectivamente.
Figura 6-1 - Fluxograma ilustrando a marcha para identificao de bactrias gram positivo.
Relatrio de Estgio
126
Microbiologia
Figura 6-2 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha para identificao de bactrias gram positivo.
Figura 6-3 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha para identificao de bactrias gram positivo.
Relatrio de Estgio
127
Microbiologia
Figura 6-4 Fluxograma ilustrando a marcha geral para identificao de bacilos gram negativos.
Figura 6-5 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para identificao de bacilos gram negativos
Relatrio de Estgio
128
Microbiologia
Figura 6-6 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para identificao de cocos gram negativos.
Relatrio de Estgio
129
Microbiologia
Figura 6-7 Fluxograma representando a marcha geral do exame micolgico para identificao de leveduras.
6.4.
Produtos Biolgicos
Na clnica so tratados os seguintes produtos biolgicos:

6.4.1. Exsudado vaginal e uretral
Os exsudados genitais so solicitados com o objectivo de pesquisar microrganismos
transmitidos atravs da actividade sexual ou causadores de desequilbrio da flora
normal. So mais requisitados a mulheres, no s na gravidez para controlo de
alteraes da flora vaginal, mas tambm como controlo ginecolgico de rotina. Tambm
so pedidos aos homens embora com menor frequncia. A anlise dos exsudados
genitais de grande importncia na escolha do tratamento em caso de infeco instalada
e na preveno da infeco de recm-nascidos durante o parto.
Os microrganismos patognicos pesquisados no laboratrio de microbiologia da
clnica so:
Microrganismos transmitidos sexualmente:
Parasitas: Trichomonas vaginalis;
Relatrio de Estgio
130
Microbiologia
Bactrias: Treponema pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus ducreyi.
Desequilbrios na flora normal (ex: vaginite bacteriana):
Bactrias: Gardnerella vaginalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae,
Candida
albicans,
Haemophilus
influenzae,
Haemophilus
parainfluenzae (ambos apenas nos exsudados uretrais);

Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum.
De seguida esto descritos alguns exemplos de infeces bacterianas genitais

causados por bactrias e fungos
Gonorreia
Doena de transmisso sexual causada pela bactria Neisseria gonorrhoeae, que
infecta as mucosas da uretra, do colo uterino, do recto, da garganta e conjuntiva ocular
(conjuntivite gonoccica nos recm-nascidos durante o parto). Nos homens, os sintomas
so mais evidentes e surgem mais cedo que nas mulheres. A sintomatologia, nos
homens, dor a urinar, grande necessidade de urinar e secreo purulenta proveniente
do pnis. As mulheres no apresentam habitualmente sintomas, sendo ligeiros os que
apresentarem. O diagnstico, no laboratrio de microbiologia, faz-se atravs da
identificao de Neisseria gonorrhoeae ao microscpio, crescimento de colnias
suspeitas em gelose de chocolate polivitex e atravs das cartas de identificao do
VITEK 2. O diagnstico feito, na maior parte das vezes, a partir de exsudados uretrais,
no caso dos homens e exsudados cervicais, no caso das mulheres.
Trichomonase
Infeco transmitida por contacto sexual causada pelo parasita Trichomonas
vaginalis, frequentemente responsvel por causar vaginite. O Trichomonas vaginalis ,
mais frequentemente, encontrado na mulher, podendo tambm ser isolado no exsudado
uretral do homem. As mulheres apresentam secreo vaginal espumosa amarelada,
irritao da vulva, dor ao urinar e durante o coito. Os homens so, normalmente,
assintomticos, podendo, no entanto, apresentar secreo uretral, dor e ardor ao urinar,
dor testicular, irritao da uretra e infeco da prstata. O diagnstico feito atravs da
visualizao microscpica do parasita nos exsudados vaginal e urina, no caso das
mulheres e exsudado uretral, urina e esperma, no caso dos homens.
Relatrio de Estgio
131
Microbiologia
Candidase genital
Infeco genital causada, normalmente por Candida albicans, levedura que faz parte
da flora da pele e intestinos. A candidase apresenta-se, frequentemente, como vaginite
e cada vez mais frequente devido ao uso excessivo de antibiticos e contraceptivos
orais que alteram as condies vaginais, favorecendo o crescimento do fungo. As
mulheres apresentam prurido ou irritao vaginal e vulvar e secreo espessa. Os
homens, sendo normalmente assintomticos, podem apresentar irritao na glande e
prepcio e secreo espessa. O diagnstico feito, a partir de exsudados vaginais e
uretrais, atravs da visualizao ao microscpio, crescimento de colnias suspeitas em
gelose de Sabouraud, teste germinativo e/ou identificao atravs das cartas de VITEK.
6.4.1.1. Colheita
Nos exsudados vaginais, a colheita feita com uma primeira zaragatoa estril, que
colocada em meio de transporte com carvo activado. De seguida, utilizada uma
segunda zaragatoa, a qual utilizada para fazer esfregao, por rolamento, em duas
lminas com o objectivo de executar o exame a fresco e a colorao de gram. Introduzir
a zaragatoa num meio de transporte devidamente identificado.
Nos exsudados uretrais femininos, a colheita feita da mesma forma que os vaginais
com a excepo de que usado uma zaragatoa peditrica. tambm necessrio um
meio de transporte devidamente identificado.
No caso de ser requisitado pesquisa de Mycoplasma hominis e Ureaplasma
urealyticum, usa-se uma zaragatoa estril para limpar o excesso de muco do exocolo,
desprezando-a. De seguida introduzir nova zaragatoa estril apropriada e realizar um
movimento de rotao durante 5 a 10 segundos, raspando cuidadosamente para arrancar
clulas. Introduzir a zaragatoa num meio de transporte devidamente identificado. Esta
pesquisa pode ser pedida no exsudado vaginal, uretral e urina.
Nos exsudados uretrais masculinos a colheita feita pelo tcnico de laboratrio.
Procede-se colheita do pus com uma ansa, a qual usada para semear a placa
apropriada que ir ser colocada em estufa em condies de CO2. Procede-se tambm a 2
esfregaos em duas lminas: uma para exame a fresco e outra colorao de gram. Num
exsudado uretral masculino tambm pode ser requisitado a pesquisa de Mycoplasma.
Relatrio de Estgio
132
Microbiologia
6.4.1.2. Marcha geral
De seguida encontram-se fluxogramas que demonstram a marcha geral efectuada no
laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira para os
exsudados vaginal e uretral. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral,
todos os procedimentos realizados para se identificar os microrganismos patognicos
presentes nos produtos, incluindo placas de cultura e testes presuntivos/identificativos
realizados.
Figura 6-8 - Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada com o produto exsudado vaginal
Relatrio de Estgio
133
Microbiologia
* Quando solicitado
Figura 6-9 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada no exame directo com o produto
exsudado vaginal
Figura 6-10 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada no exame directo com o produto
exsudado vaginal.
Relatrio de Estgio
134
Microbiologia
Figura 6-11 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural realizado com o produto
exsudado vaginal
Relatrio de Estgio
135
Microbiologia
Figura 6-12 Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame directo realizado com o produto exsudado uretral.
exsudado uretral.
Relatrio de Estgio
136
Microbiologia
exsudado uretral.
6.4.2. Exsudado rectal

O exsudado rectal permite rastrear algumas doenas sexualmente transmitidas,
doenas causadas por desequilbrio da flora e, principalmente, pesquisa de
Streptococcus agalactiae no caso das grvidas, a fim de evitar a contaminao perinatal
de recm-nascidos. O Streptococcus agalactiae est particularmente associado a
septicmia e meningite do recm-nascido.
clnica so:
Microrganismos transmitidos sexualmente:
Bactrias: Neisseria gonorrhoeae;
Desequilbrios na flora intestinal normal:
Bactrias: Streptococcus agalactiae, Candida albicans.
Relatrio de Estgio
137
Microbiologia
6.4.2.1. Colheita
A colheita feita com a introduo de uma zaragatoa suavemente atravs do
esfncter anal, deixar 10-30 segundos para fixar os microrganismos e retirar. Introduzir a
amostra em meio de transporte com carvo, que se deve ser mantido temperatura
ambiente.

laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira para o
exsudado rectal. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os
procedimentos realizados para se identificar os microrganismos patognicos presentes
nos produtos, incluindo placas de cultura e testes presuntivos/identificativos realizados.
Figura 6-15 Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural micolgico para o produto exsudado
rectal.
Relatrio de Estgio
138
Microbiologia
Figura 6-16 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural micolgico para o produto
exsudado rectal.
Relatrio de Estgio
139
Microbiologia
Figura 6-17 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o produto exsudado rectal.
6.4.3. Exsudado nasofarngeo

O exsudado nasofarngeo muito requisitado pelo mdico, especialmente em
crianas em que as infeces so mais frequentes. As infeces respiratrias mais
comuns localizam-se na orofaringe, nasofaringe e cavidade nasal, provocando angina,
corrimento nasal e, por vezes, febre. Na maior parte dos casos, a infeco primria
provocada por um vrus, embora este no seja, no geral, detectado. Concomitantemente,
surge, muitas vezes, a infeco secundria, por uma das bactrias patognicas,
habitualmente presentes na nasofaringe, tal como o pneumococo, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. Em doentes sujeitos a
antibioterapia pode tambm surgir candidase.
Os microrganismos patognicos pesquisados no exsudados nasal e farngeo ,no
Laboratrio de Microbiologia da clnica, so:
Nasal
Relatrio de Estgio
140
Microbiologia
Streptcoccus pneumoniae
Streptococcus - hemoltico, grupo A, B, C, F e G
Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Moraxella catarrhalis;
Klebsiella e enterobactrias
Farngeo
Streptococcus - hemoltico, grupo A, B, C, F e G
Corynebacterium diphteriae
Neisseria gonorrhoeae
Bordetella pertussis
6.4.3.1. Colheita
Exsudado nasal - Colheita feita, pelo tcnico de laboratrio, com zaragatoa peditrica
e colocar em meio de transporte. Para pesquisa de eosinfilos fazer 2 esfregaos em 2
lminas.
Exsudado farngeo/amigdalino Aps higiene oral e em condies de jejum colheita
feita com zaragatoa normal que deve ser colocada imediatamente em meio de
transporte. A entrega deve ser o mais rapidamente possvel. importante saber se toma
antibiticos.
Pesquisas dirigidas:
Na pesquisa de Bacilo de Hansen necessrio fazer raspagem do septo nasal.
Na pesquisa de Bordetella pertussis, o paciente deve tossir directamente para

placa de bordet gengou.
No caso da Angina de Vincent, a colheita da ulcerao feita com uma

zaragatoa.

exsudado nasofarngeo. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os
Relatrio de Estgio
141
Microbiologia
*Quando solicitado
Figura 6-18 Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame directo para o produto exsudado nasal.
Relatrio de Estgio
142
Microbiologia
Figura 6-19 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural para o produto exsudado
nasal.
Relatrio de Estgio
143
Microbiologia
Figura 6-20 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada com o produto exsudado nasal.
Relatrio de Estgio
144
Microbiologia
*Quando solicitado
Figura 6-21 - Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame directo realizado com o produto exsudado
farngeo.
*Quando solicitado
exsudado farngeo.
Relatrio de Estgio
145
Microbiologia
Figura 6-23 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural bacteriolgico realizado
com o produto exsudado farngeo
Nos exsudados farngeos, na identificao de Staphylococcus aureus (Figura 6-23)

deve ser tido em conta que poder ser devido a rinorreia posterior uma vez que este
microrganismo no encontrado na faringe.
Relatrio de Estgio
146
Microbiologia
Figura 6-24 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural bacteriolgico realizado
com o produto exsudado farngeo.
6.4.4. Expectorao, secrees brnquicas e lavado bronco-alveolar

Ao contrrio da maior parte das regies do tracto respiratrio superior, a traqueia,
brnquios e pulmes esto normalmente isentos de colonizao por bactrias comensais
mas quando o sistema imunitrio est debilitado, ficam sujeitos invaso pelos
microrganismos das vias respiratrias superiores. O tracto respiratrio inferior pode,
ainda, sofrer infeco primria por microrganismos patognicos inalados tais como o
bacilo da tuberculose.
Relatrio de Estgio
147
Microbiologia
As infeces mais comuns so a bronquite aguda, exacerbaes de bronquite crnica
e pneumonia. Na maior parte dos casos, a infeco primria provocada por vrus, mas
ocorre frequentemente a infeco secundria, por um microrganismo patognico
proveniente da nasofaringe, tal como o pneumococo ou Haemophilus influenzae.
clnica so:
Expectorao
Streptococcus -hemoltico;
Streptococcus pneumoniae;
Staphylococcus aureus;
Klebsiella spp;
Pseudomonas aeruginosa;
Haemophilus influenzae.
Mycobacterium tuberculosis
Aspergillus spp.
Candida spp.
Secrees brnquicas e lavado bronco-alveolar
Haemophilus influenzae;
Klebsiella pneumoniae e outras Enterobacteriaceae;
Legionella spp.;
Mycobacterium tuberculosis
Bordetella spp.
Aspergillus spp.
Candida spp.
Relatrio de Estgio
148
Microbiologia
6.4.4.1. Colheita
A colheita da expectorao feita em jejum, aps higiene oral e atravs de tosse
profunda para contentor estril fornecido pelo laboratrio. O transporte para o
laboratrio deve demorar menos de 2 horas. No caso de pesquisa de BK os doentes
podem recolher amostras diariamente, conservando a expectorao no frigorfico.
Rejeitar:
Amostras com mais de 24 horas.
A colheita das secrees brnquicas e lavado bronco-alveolar feita por pessoal

especializado, fora do laboratrio.
Rejeitar:
Colheitas por aspirao tranqueo-brnquica;
Colheitas atravs ou no local do orifcio de traqueostoma.

laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira para
expectorao, secrees brnquicas e lavado-bronco-alveolar. Nos fluxogramas
encontram-se, de uma maneira geral, todos os procedimentos realizados para se
identificar os microrganismos patognicos presentes nos produtos, incluindo placas de
cultura e testes presuntivos/identificativos realizados.
*Quando solicitado
Figura 6-25 Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame directo com os produtos
expectorao e secrees brnquicas.
Relatrio de Estgio
149
Microbiologia
Figura 6-26 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame cultural com os
produtos expectorao e secrees brnquicas.
Figura 6-27 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame cultural com os
produtos expectorao e secrees brnquicas.
Relatrio de Estgio
150
Microbiologia
Figura 6-28 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural do produto expectorao ou
secrees brnquicas
6.4.5. Lquidos orgnicos/Exsudado auricular e ocular

Esta seco diz respeito ao diagnstico dos vrios lquidos orgnicos (lquido pleural,
liquido pericrdico; liquido asctico e liquido sinovial, etc.) bem como os exsudados
auriculares e oculares uma vez que so tratados de maneira semelhante. Nas descries
seguintes tomo como exemplo os exsudados auricular e ocular uma vez que so, dos
descritos anteriormente, os mais comuns no laboratrio.
O exsudado auricular solicitado para fazer o diagnstico de trs possveis situaes:
otite mdia aguda, otite mdia crnica e otite externa. O exsudado ocular solicitado
Relatrio de Estgio
151
Microbiologia
para o diagnstico de conjuntivite, queratite bem como de infeces da rbita e globo
ocular.
clnica so:
Exsudado Auricular
Streptococcus -hemolticos;
Enterobacteriaceae;
Candida spp.;
Mycobacterium tuberculosis;
Aspergillus spp..
Exsudado ocular
Haemophilus spp.
Moraxella spp.;
Neisseria gonorrhoeae;
Streptococcus pyogenes;
Pseudomonas areuginosa;
Candida spp.;
Mycobacterium tuberculosis.
6.4.5.1. Colheita
A colheita feita apenas aps a limpeza prvia do local de colheita. Se necessrio,
retirar o excesso de pus do orifcio auricular externo com uma zaragatoa e rejeitar a
mesma.
No exsudado auricular introduzir uma zaragatoa peditrica no canal auricular tendo o
cuidado de no tocar nas paredes, retirar o pus e colocar a zaragatoa em meio de
Relatrio de Estgio
152
Microbiologia
transporte. No exsudado ocular, com o dedo puxar a plpebra inferior para baixo, rodar
at pressionar suavemente uma zaragatoa normal perto do canal lacrimal.
Nos restantes lquidos orgnicos a colheita feita por pessoal especializado, fora do
laboratrio, para recipiente esterilizado. A amostra deve ser enviada dentro de uma hora
ou ser conservada em frigorfico.
Rejeitar:
Amostras com mais de 24 horas de frigorfico.

laboratrio de microbiologia da clnica de diagnsticos Dr. Fernando Teixeira para os
lquidos orgnicos e exsudados auricular e ocular. Nos fluxogramas encontram-se, de
uma maneira geral, todos os procedimentos realizados para se identificar os
microrganismos patognicos presentes nos produtos, incluindo placas de cultura e testes
presuntivos/identificativos realizados.
Figura 6-29 Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame directo dos produtos lquidos
orgnicos/exsudado ocular e auricular.
Relatrio de Estgio
153
Microbiologia
Figura 6-30 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame cultural dos produtos
lquidos orgnicos/exsudado ocular e auricular.
Figura 6-31 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame directo dos produtos
lquidos orgnicos/exsudado ocular e auricular.
Relatrio de Estgio
154
Microbiologia
*Consoante a localizao
Figura 6-32 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural realizado com os produtos
lquidos orgnicos.
Relatrio de Estgio
155
Microbiologia
Figura 6-33 (continuao) Fluxograma ilustrando a valorizao clnica mediante a localizao do lquido
orgnico.
6.4.6. Lquido Cefalo-Raquidiano

O lquido cfalo-raquidiano (LCR) apesar de se tratar de um lquido orgnico
tratado parte por o procedimento e microrganismos a valorizar serem ligeiramente
diferentes do anterior descrito.
A colheita de LCR solicitada em casos suspeitos de meningite. As infeces mais
comuns do LCR so: meningite bacteriana, meningite tuberculosa e encefalite viral.
Na meningite bacteriana, o LCR tipicamente turvo, devido presena de grande
nmero de leuccitos. A infeco , habitualmente, provocada por uma das seguintes
bactrias: Neisseria meningitidis, pneumococo ou Haemophilus influenzae. Nos recmnascidos e crianas muito pequenas, a meningite pode ser provocada por estreptococos
do grupo B e Listeria monocytogenes. A meningite tuberculosa resulta de uma infeco
primria progressiva, pulmonar ou mesentrica. O LCR lmpido ou ligeiramente
turvo, com um nmero moderado de leuccitos.
Tal como na hemocultura, deve-se ter em grande considerao a hiptese de
contaminao por bactrias comensais da pele (por exemplo, Staphylococcus
epidermidis), durante a colheita.
Relatrio de Estgio
156
Microbiologia
clnica so:
Neisseria meningitidis;
Srtreptococcus, grupo A e B - hemoltico.
Staphylococcus epidermidis;
Enterobacteriaceae;
Listeria monocytogenes;
Corynebacterium diphteriae.
6.4.6.1. Colheita
Colheita feita por pessoal especializado, fora do laboratrio, para recipiente
esterilizado. O envio para o laboratrio deve ser feito imediatamente ou deve-se
proceder conservao em estufa a 37 C.

LCR. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os procedimentos
realizados para se identificar os microrganismos patognicos presentes nos produtos,
incluindo placas de cultura e testes presuntivos/identificativos realizados.
Relatrio de Estgio
157
Microbiologia
*Quando solicitado
Figura 6-34 Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame directo do LCR.
Figura 6-35 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame directo do LCR.
Relatrio de Estgio
158
Microbiologia
Figura 6-36 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada com o produto LCR.
6.4.7. Exsudados de ferida

Esta seco diz respeito ao diagnstico das principais infeces das feridas. As
infeces das feridas podem ser endgenas ou exgenas. As primeiras so provocadas
por microrganismos comensais, em qualquer regio do corpo. Por exemplo, uma ferida
cirrgica abdominal infectada por microrganismos do intestino grosso, aps uma
operao que envolva inciso do coln. Na infeco exgena, a fonte do microrganismo
exterior ao corpo. Nas infeces das feridas pode encontrar-se grande diversidade de
espcies bacterianas, aerbias e anaerbias, tais como Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, pneumococos, Escherichia coli, Proteus spp. e Pseudomonas
aeruginosa. Em muitos casos, existe uma infeco mista por mais de uma espcie
Relatrio de Estgio
159
Microbiologia
bacteriana. Nas infeces crnicas, de cura lenta, deve ser considerada a possibilidade
da presena de Mycobacterium tuberculosis.
clnica so:
Streptococcus pyogenes e outros -hemolticos;
Enterobacteriaceae;
Enterococcus sp.
Candida spp.
Mycobacterium tuberculosis.
6.4.7.1. Colheita
Proceder limpeza do local de colheita com uma zaragatoa para retirar o excesso de
pus em contacto com o penso e, se necessrio, limpar com soro fisiolgico o ps seco.
De seguida, com uma zaragatoa estril, colher uma poro de ps, pressionando
levemente no local da leso ou na fstula e colocar em meio de transporte.
Rejeitar:
Colheitas com mais de 1 hora caso no venham em meio de transporte;
Zaragatoa seca.

exsudado de ferida. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os
Relatrio de Estgio
160
Microbiologia
Figura 6-37 Fluxograma ilustrando a marcha geral realizado com o produto exsudado de feridas.
Figura 6-38 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizado para o exame cultural do produto
exsudado de feridas.
Relatrio de Estgio
161
Microbiologia
exsudado de feridas.
6.4.8. Esperma
O esperma, tal como os exsudados genitais, um dos produtos usado para rastreio
das doenas transmitidas sexualmente. Alm disso, com o aumento, sentido nos ltimos
anos, da infertilidade masculina, uma monitorizao das alteraes neste produto pode
ajudar no diagnstico e tratamento das infeces causadoras da infertilidade, desde que
com a devida antecedncia.
clnica so:
Mycoplasma hominis;
Ureaplasma urealyticum;
Ureaplasma parvum;
Leveduras
Relatrio de Estgio
162
Microbiologia
Streptococcus hemoltico;
Neisseria gonorrhoeae;
Trichomonas vaginalis;
Enterobactrias.
6.4.8.1. Colheita
A colheita feita para recipiente esterilizado, aps masturbao, de acordo com as
normas descritas na recepo. Caso a colheita seja feita fora do laboratrio, o transporte
deve ser feito temperatura ambiente e no espao de 1 hora.
Rejeitar:
Colheitas com mais de 2 horas;
Colheitas conservadas em frigorfico.

esperma. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os procedimentos
Relatrio de Estgio
163
Microbiologia
*Quando solicitado
Figura 6-40 Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame directo para o produto esperma.
Figura 6-41 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural para o produto esperma.
Relatrio de Estgio
164
Microbiologia
Figura 6-42 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural bacteriolgico realizada com o
produto esperma.
Relatrio de Estgio
165
Microbiologia
Figura 6-43 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural bacteriolgico realizada com o
produto esperma.
Relatrio de Estgio
166
Microbiologia
6.4.9. Hemocultura
A cultura de sangue de grande importncia no mbito da microbiologia clnica,
pois a deteco de uma septicmia indica que a vida do paciente corre risco imediato e,
por isso h urgncia em estabelecer a teraputica adequada.
A hemocultura pedida, essencialmente, em duas situaes clnicas:
Quanto a existncia de febre, choque ou outros sintomas, associados suspeita

de infeco (infeco de uma ferida cirrgica, pneumonia, meningite, etc),
sugere a possibilidade de septicmia.
Quando se quer investigar as causas de um estado febril, devido ausncia de

sinais de uma infeco especfica ou local.
A principal dificuldade que ocorre, na interpretao dos resultados da hemocultura,

resulta da possibilidade da amostra estar contaminada com organismos comensais da
pele, por exemplo. A sua presena, na hemocultura, dever ser considerada como
suspeita
de
contaminao.
No
entanto,
em
doentes
imunodeprimidos,
os
microrganismos comensais isolados podem, na realidade, ter um papel patognico

importante, tendo em conta as circunstncias de cada caso.
clnica so:
Streptococcus spp. (S. tipo viridans, S. pneumoniae, -hemolticos)
Staphylococcus coagulase negativo;
Listeria monocytogenes;
Corynebacterium jeikeium;
Enterobactrias;
Brucella spp.;
Candida spp.;
6.4.9.1. Colheita
Proceder s condies de asspsia: desinfectar bem a zona da puno, atravs de
movimentos circulares do interior para o exterior; a puno deve ser feita com uma
Relatrio de Estgio
167
Microbiologia
lamparina acesa para manter a zona assptica. Colher cerca de 10 mL de sangue (ou
5mL no caso dos bebs) para um recipiente apropriado, tendo o cuidado de no
introduzir ar pois estes frascos encontram-se sob vcuo.
No caso de ser pedido pesquisa directa e/ou cultural de BK, colher sangue para tubo
com anti-coagulante.
Devem ser colhidas trs amostras com um intervalo de, pelo menos, 30 minutos entre
cada uma delas.
A colheita de mielocultura feita por pessoal especializado, em condies de
assepsia.

laboratrio de microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira para a
hemocultura e mielocultura. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral,
todos os procedimentos realizados para se identificar os microrganismos patognicos
presentes nos produtos, incluindo placas de cultura e testes presuntivos/identificativos
realizados.
Relatrio de Estgio
168
Microbiologia
*Quando solicitado
Figura 6-44 Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural micolgico e pesquisa de Brucella
realizada com o produtos hemocultura e mielocultura.
Relatrio de Estgio
169
Microbiologia
Figura 6-45 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral do exame cultural bacteriolgico e pesquisa de
Haemophilus realizada com o produtos hemocultura e mielocultura
Relatrio de Estgio
170
Microbiologia
hemocultura.
Relatrio de Estgio
171
Microbiologia
hemocultura.
6.4.10. Urina assptica

No mbito das anlises clnicas, as infeces mais frequentes so as do tracto
urinrio. Estas infeces so muitas vezes causadas pela flora intestinal. Os grupos mais
susceptveis de sofrerem infeces urinrias so as crianas e os pacientes algaliados.
No caso das crianas, os bebs devido ao uso de fralda, em que a urina e as fezes podem
ficar algum tempo em contacto com o tracto genito-urinrio ou por no serem limpas
nas devidas condies aquando da mudana da fralda. No caso dos pacientes algaliados,
Relatrio de Estgio
172
Microbiologia
pelo facto de muitas vezes terem mobilidade reduzida ou por estarem acamados, a urina
pode ficar retida na bexiga mais tempo, o que leva ao crescimento microbiano.
Os sintomas mais frequentes de infeco do tracto urinrio so a urgncia e
frequncia das mices, mal-estar e dor ao urinar.
A infeco mais comum a cistite, provocada muitas vezes por enterobactrias,
Pseudomonas aeruginosa ou Enterococcus faecalis. Pode ainda ocorrer a infeco por
cndidas em diabticos ou imunodeprimidos. Como agentes mais raros da infeco
urinria, citam-se Streptococcus agalactiae e outros estreptococos.
As infeces mais graves so a pielite e pielonefrite, cujos sintomas incluem,
habitualmente, dor na regio lombar e febre, podendo o agente causal ser qualquer dos
que provocam cistite, mas ocorrem alguns casos devido a Staphylococcus aureus.
Nalguns doentes com sintomas de infeco urinria, o exame directo pode ser
positivo (com glbulos vermelhos e/ou leuccitos), mas sem proliferao bacteriana
significativa na cultura de rotina. Tal facto pode ser devido ao uso de antibioterapia ou a
infeco por um microrganismo que no se desenvolve nos meios de cultura
normalmente usados, como por exemplo, Mycobacterium tuberculosis.
As infeces urinrias podem ainda ser provocadas por leveduras ou parasitas como
Shistosoma haematobium e Trichomonas vaginalis.
clnica so:
Candida spp.;
Enterobacteriaceae;
Enterococcus spp.;
Streptococcus agalactiae;
Staphylococcus epidermitis;
Staphylococcus saprophyticus;
Neisseria gonorrheae;
Acinetobacter spp.;
Shistosoma haematobium;
Trichomonas vaginalis;
Enterobius vermicularis;
Relatrio de Estgio
173
Microbiologia
Mycoplasma hominis;
Ureaplasma urealyticum;
Ureaplasma parvum.
6.4.10.1. Colheita
Aps a asspsia do local, rejeitar o primeiro jacto e colher a urina para um contentor
esterilizado. No caso das mulheres, recomendado afastar os lbios para proceder
colheita. No caso de cateterizao uretro-vesical a colheita deve ser feita no momento
da mudana da alglia. O tubo retirado e recolhida uma poro de urina directamente
para o contentor esterilizado. No caso de bebs a colheita feita atravs do saco
colector. Deve ser colado aps desinfeco uro-genital e substitudo a cada 30 minutos
enquanto a criana no urinar.
Rejeitar sempre:
Pontas de alglia;
Sacos colectores de algaliao permanente;
Urina transvazada de sacos colectores;
Urina assptica com mais de 24h de refrigerao.

urina assptica. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os
Relatrio de Estgio
174
Microbiologia
Figura 6-48 Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame micolgico e bacteriolgico do
produto catteres.
Figura 6-49 Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame cultural do produto urina assptica.
Relatrio de Estgio
175
Microbiologia
Figura 6-50 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral realizada para o exame directo do produto
urina assptica.
Relatrio de Estgio
176
Microbiologia
Figura 6-51 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame cultural do produto urina
assptica.
Relatrio de Estgio
177
Microbiologia
Figura 6-52 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame cultural do produto urina assptica.
Relatrio de Estgio
178
Microbiologia
Figura 6-53 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame cultural do produto urina
assptica.
Relatrio de Estgio
179
Microbiologia
Figura 6-54 (continuao) Fluxograma ilustrando quais os meios usados, aps reisolamento e/ou nova
sementeira, bem como os respectivos microrganismos a valorizar com o produto urina assptica.
6.4.11. Fezes
As amostras mais frequentemente analisadas para diagnstico das infeces
gastrointestinais so as fezes, diarreicas ou no. Os sintomas mais frequentes so
diarreia, dores abdominais e vmitos.
As causas mais frequentes de diarreia, em adultos e crianas de idade superior a 2-3
anos, a infeco por espcies de Campylobacter, algumas espcies de Salmonella e
Shigella sonnei, alm de intoxicao alimentar, provocada por estas e outras bactrias,
nomeadamente Staphylococcus aureus, Colstridium perfrigens, entre outras. Um
nmero relativamente pequeno de casos provocado pelo protozorio Giardia lamblia,
Shigella flexneri, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B e Yersinia enterocolitica.
Relatrio de Estgio
180
Microbiologia
Nas crianas com idade inferior aos 2 anos so numerosos os casos de gastroenterite
provocada por vrus, assim como por estirpes intestinais, enteropatognicas de
Escherichia coli.
Os indivduos que viajam at ao estrangeiro podem ser contaminados por diversos
microrganismos patognicos intestinais, exticos tais como Vibrio cholera e parasitas
como Entamoeba histolytica, entre outros. A informao de que o paciente viajou para o
estrangeiro de grande importncia para alertar o laboratrio para a realizao dos
exames necessrios identificao de microrganismos patognicos exticos.
Nos doentes tratados com antibiticos (por exemplo, durante interveno cirrgica
abdominal) pode ocorre enterocolite grave, devido a uma estirpe de Staphylococcus
aureus resistente ao antibitico. Alm disso, pode surgir diarreia simples, mas benigna,
em consequncia do tratamento prolongado por um ou mais antibiticos, o qual
desequilibra a flora intestinal normal e predispe para a infeco por Candida albicans
ou Cryptosporidium.
clnica so:
Salmonella spp.;
Shigella spp.;
Eschirichia coli enteropatognico;
Campylobacter jejuni;
Yersinia enterocolitica;
Vibrio cholerae;
Toxina A e B de Clostridium perfrigens;
Ovos e quistos de parasitas intestinais;
Candida spp.
6.4.11.1. Colheita
Colher, para frasco de boca larga, uma poro equivalente a uma noz ou, no caso de
fezes lquidas, um tero do frasco. Entregar no laboratrio at 2 horas aps a colheita.
No caso de este prazo no ser possvel de cumprir, colher para recipiente com meio de
Relatrio de Estgio
181
Microbiologia
transporte (ETM) e manter temperatura ambiente. Em crianas ou bebs podem ser
usados zaragatoa nus-rectal ou fraldas, respectivamente.
Rejeitar:
Amostras com mais de 2 horas sem meio de transporte.
No caso de pesquisa de parasitas fazer a colheita para frasco de boca larga. Se o

mdico pedir fezes de mais de um dia o doente pode conservar no frigorfico.
Rejeitar:
Amostras em papel;
Amostras em plstico;
Frasco destapados.

fezes. Nos fluxogramas encontram-se, de uma maneira geral, todos os procedimentos
Figura 6-55 - Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame directo do produto fezes.
Relatrio de Estgio
182
Microbiologia
Figura 6-56 - (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o produto fezes
Relatrio de Estgio
183
Microbiologia
Figura 6-57 (continuao) Fluxograma ilustrando a marcha geral para o exame cultural, de rotina, para o
produto fezes.
Relatrio de Estgio
184
Microbiologia
Figura 6-58 Fluxograma ilustrando a marcha geral das pesquisas dirigidas para o produto fezes.
6.4.12. Pesquisa de fungos dermatfitos

So frequentes, em todas as regies do planeta, as infeces fngicas das camadas
superficiais do corpo, causadas, na maior parte por fungos dermatfitos dos gneros
Epidermophyton, Microsporum e Tricophyton que provocam leses da queratina. As
micoses superficiais tambm podem ser provocadas por leveduras (Candida glabrata,
Candida gilhermondii, Candida parapsilosis), muitas vezes associado a diabetes e
Relatrio de Estgio
185
Microbiologia
obesidade. O resultado positivo, com identificao de um fungo, permite o diagnstico
definitivo, determina o tratamento correcto e habilita a que se tomem as medidas
adequadas quanto possvel fonte de infeco e preveno da disseminao. A eficcia
da anlise de amostras de pele, unhas e cabelo depende da quantidade de material
disponvel. Na sua maioria, os fungos dermatfitos produzem dois tipos de condios
assexuados: os microcondios, pequenos e unicelulares, e os macrocondios, grandes e
septados, com paredes espessas ou finas.
6.4.12.1. Colheita
Colheita deve ser feita por tcnicos especializados.
Unhas: Aps desengordurar o local, procede-se raspagem da unha com uma

goiva. A colheita feita para uma caixa de petri estril.
Plos e cabelos: Arrancar o plo com uma pina.
Escamas no couro cabeludo: Remov-las com a ajuda de uma pina.
Escamas de pele: Aps desengordurar o local procede-se raspagem da leso da

periferia para o centro, com a ajuda de um bisturi.

O diagnstico das micoses superficiais no laboratrio de microbiologia da Clnica de
Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira feito atravs de visualizao das amostras de pele,
unhas e cabelo ao microscpio, aps tratamento com KOH 10-20% (dependendo do tipo
de amostra). O exame tem por base a presena de microcondios, macrocondios,
clamidsporos e estrutura das hifas.
6.5.
Controlo de qualidade
6.5.1. Controlo de Qualidade Interno

No mbito da microbiologia clnica o controlo de qualidade feito com estirpes de
referncia. Estas estirpes, designadas de ATCC (American Title Culture Collection) no
so mais do que estirpes bacterianas com valor terico conhecido, que so testadas nas
mesmas condies que as amostras de pacientes, e usadas como controlo positivo ou
negativo aos microrganismos testados.
De seguida encontra-se a tabela referente ao controlo de qualidade interno realizado
no laboratrio.
Relatrio de Estgio
186
Microbiologia
Tabela 6-3 Controlo de qualidade interno dos equipamentos do laboratrio.
Equipamento
Procedimento
Registo de
Frigorficos
temperatura
temperatura
tolerncia
Variamente,
alternando os 3
2C 8C
Diariamente,
alternado as 3
37C 2C
estufas
Registo de
Estufa (a 30C)
Limites de
frigorficos
Registo de
Estufa (a 37C)
Frequncia
Diariamente
30C 2C
Semanalmente
temperatura
Verificar se h
Cmara de fluxo
crescimento em
de laminar
placa de gelose de
sangue
Tabela 6-4 Controlo de qualidade interno de cada tcnica manual realizada no laboratrio.
Tcnica
Controlo
Controlo
positivo
negativo
plus ou
Staphylococcus
Staphylococcus
Quinzenalmente
Slidex Staphi
aureus ATCC
epidermidis
ou na mudana
kit da
29213
ATCC 12228
do lote
suspender a
Staphylococcus
Staphylococcus
Quinzenalmente
estirpe no
aureus ATCC
epidermidis
ou na mudana
plasma
29213
ATCC 12228
do lote
Descrio
Frequncia
Slidex Staph
Coagulase em
lmina
Biomrieux
Nu tubo de
hemlise
Coagulase em
tubo
liofilizado da
Iberlab
Relatrio de Estgio
187
Microbiologia
Tcnica
Descrio
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Frequncia
Semear em
meio
Columbia
com 5%
Teste da
sangue de
Optoquina
carneiro.
Sensvel -
Streptococcus
pneumoniae
Quinzenalmente
-
ATCC 49619
ou na mudana
do lote
halo de
inibio deve
ter >15 mm.
Oxidase
Masta ID
Pseudomonas
Oxidase
aeruginosa
Strips Iberlab
ATCC 27853
Escherichia coli
ATCC 25922
Quinzenalmente
ou na mudana
do lote
Discos da
Iberlab em
Factores X, V
Mueller-
e X+V
Hinton 2.
Desenvolvim
Haemophilus
influenzae
Quinzenalmente
-
ATCC 49247
ou na mudana
do lote
ento em X+V
Sempre que se
DNase
Moraxella
Staphylococcus
identificar
catarrhalis
epidermidis
Moraxella
ATCC 25238
ATCC 12228
catarrhalis
numa amostra.
Grupagem
serolgica dos
Mastastrep da
Streptococci
Iberlab
- hemliticos
Relatrio de Estgio
Streptococcus
pyogenes ATCC
19615
Quinzenalmente
-
ou na mudana
do lote
188
Microbiologia
Tcnica
Descrio
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Frequncia
Discos da
Biomrieux
Teste da
Bacitracina +
SXT
em Columbia
+ 5% sangue
de carneiro.
O halo de
Streptococcus
pyogenes ATCC
Quinzenalmente
-
19615
ou na mudana
do lote
inibio deve
ser sensvel.
Aglutinao
Salmonella
serolgica de
entertidis ATCC
Salmonellas
13076
Sempre que se
suspeitar de
Salmonella spp.
numa amostra
Aglutinao
serolgica de
Shigellas, E.
coli
Apenas controlado atravs da avaliao externa do NEQAS.
enteropatogni
co e E. coli
O157
Teste feito
Catalase
com gua
oxigenada a
10 volumes
Teste
Germinativo
Relatrio de Estgio
Staphylococcus
aureus ATCC
29213
Enterococcus
faecalis ATCC
29212
Quinzenalmente
ou na mudana
do lote
Candida
albicans ATCC
Mensalmente
10231
189
Microbiologia
Tcnica
Descrio
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Frequncia
Sempre que se
Colorao de
Staphylococcus
Escherichia coli
aureus ATCC
ATCC 25922
Gram
29213
muda o lote de
qualquer
reagente fazer 2
esfregaos com
os controlos
Tabela 6-5 Controlo de qualidade interno dos meios usados em rotina.
Tcnica
Descrio
Meio selectivo
Meio de
para a
Gardnerella
Gardnerella
vaginalis
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Gardnerella
Vaginalis
ATCC 14018
Frequncia
Mudana de
lote
Meio para
bactrias
Gelose de
Chocolate PVX
fastidiosas.
Neisseria
Testado em
gonorrhoeae
ambiente de
ATCC 49226
Mudana de
lote
CO2 e
anaerobiose
Meio Yersinia
Meio para
Campylobacter
Gelose
Yersinia
Yersinia CIN
enterocolitica
da Biomrieux
ATCC 9610
Meio selectivo
Campylobact
para
er jejuni
Campylobacter
ATCC 33291
Meio TSI (Triple

Sugar Iron)
Relatrio de Estgio
Salmonella
-
entertidis
ATCC 13076
Mudana de
lote
Mudana de
lote
Mudana de
lote
190
Microbiologia
Tcnica
Descrio
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Frequncia
Salmonella
Meio Lysine Iron
entertidis
Mudana de
lote
ATCC 13076
Mudana de
Meio Ureia Indol
Proteus
Salmonella
lote ou na
vulgaris
entertidis
abertura de um
ATCC 6380
ATCC 13076
frasco do
mesmo lote
Tabela 6-6 Controlo de qualidade interno das galerias de antibiticos, teste do FA directo, e atmosferas de CO2
e microaerofilia.
Tcnica
ATB Haemo
Descrio
Galerias
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Haemophilus
Moraxella
influenzae
catarrhalis
ATCC 49247
ATCC 25238
Streptococcus
ATB Strepto
Galerias
pneumoniae
ATCC 49619
Streptococci hemolticos
pyogenes
ATCC 19615
TSA N.
gonorrheae
Difuso de
discos de
Kirby-Bauer
ATCC 49226
fazer juntamente
suspeitar de N.
gonorrheae numa
amostra.
glabrata
ATCC MYA
2950
Relatrio de Estgio
muda o lote do kit
Sempre que se
Candida
Cartas YST
Quinzenalmente
com amostra
Neisseria
gonorrhoeae
Quinzenalmente
Sempre que se
Streptococcus
FA Directo
Frequncia
Mensalmente ou
-
em mudana de
lote
191
Microbiologia
Tcnica
Descrio
Controlo
Controlo
positivo
negativo
Frequncia
Sementeira em
Atmosfera
CO2
Mensalmente ou
gelose de
Neisseria
chocolate em
gonorrhoeae
atmosfera de
ATCC 49226
mudana de lote
fazer juntamente
com amostra
CO2
Sementeira em
gelose
Atmosfera de
Campylosel
microaerofilia
em atmosfera
Campylobacter
jejuni ATCC
de
Mudana de lote,
-
fazer juntamente
33291
com amostra.
microaerofilia
Tabela 6-7 Controlo de qualidade interno do equipamento VITEK 2.
Equipamento
Descrio
Estirpes usadas at
serem detectados
desvios (dentro da
VITEK 2
Estirpes
Candida glabrata ATCC
MYA 2950 Carta YST
validade) ou renovadas
Enterococcus faecalis
de 6 em 6 semanas.
ATCC 29212 - Carta TSA
Excepo:
Escherichia coli ATCC
Campylobacter jejunii,
25922 Carta TSA
Gardnerella vaginalis,
Klebsiella oxytoca ATCC
Neisseria gonorrhoeae,
700324 Carta GN
Streptococcus
Mensalmente
ou mudana
de lote
1 Semana
Streptococcus equi spp.
pneumoniae,
Zooepidermicus ATCC
Haemophilus influenzae
43079 Carta GP
Relatrio de Estgio
Frequncia
192
Microbiologia
Equipamento
Descrio
Estirpes
Frequncia
Proteus vulgaris ATCC

6380 Carta GN
Enterococcus casseliflavus
ATCC 700327 Carta GP
Staphylococcus aureus
ATCC 29213 Cartas GP e
TSA
2 Semana
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 Carta TSA
Streptococcus
pneumoniae ATCC 49619
Carta TSA
6.5.2. Avaliao Externa da Qualidade

A AEQ permite a avaliao da disperso de valores em torno do valor alvo e permite
verificar os mtodos mais problemticos bem como auxiliar na escolha de mtodos para
os quais se conseguem melhores resultados em detrimento daqueles que costumam dar
resultados menos satisfatrios.
No mbito da microbiologia clnica no h resultados fixos pois so valores
qualitativos. De acordo com os resultados dos laboratrios participantes no programa,
estabelecido um limite de desempenho aceitvel. Os resultados so dados com base na
mdia e desvio padro de todos os laboratrios participantes.
De seguida, encontra-se a tabela que descreve a avaliao externa da qualidade a que
o laboratrio est sujeito.
Tabela 6-8 Avaliao externa de qualidade do laboratrio.
Parmetros
Descrio
3 Identificaes + 2
Bacteriologia
antibiogramas. Uma das amostras

sempre fezes.
Micobactrias (exame
cultural)
Relatrio de Estgio
4 Identificaes
Frequncia
12 Amostras em 11
meses.
De 3 em 3 meses
193
Microbiologia
Parmetros
Micobactrias (exame
directo)
Parasitologia fecal
Relatrio de Estgio
Descrio
Frequncia
4 Identificaes
2 ou 3 identificaes
8 amostras em 11
meses
194
Concluso
7. CONCLUSO
O estgio profissionalizante do Mestrado em Anlises Clnicas realizado nos
Laboratrios de Imunologia, Virologia e Bioqumica do IPOLFG e no Laboratrio de
Microbiologia da Clnica de Diagnsticos Dr. Fernando Teixeira cumpriu com os
objectivos.
Com este estgio foi possvel aplicar os conhecimentos ministrados ao longo da
componente curricular do Mestrado e adquirir a capacidade de conduzir correctamente a
anlise de um determinado produto biolgico de forma a obter resultados exactos e
consequentemente fiveis. Especificamente, durante o perodo em que o estgio
decorreu foi possvel; aplicar conhecimentos relacionados com a organizao das
actividades dirias do laboratrio de Anlises Clnicas; desenvolver capacidade crtica e
de autocrtica no mbito da actividade profissional das Anlises Clnicas; demonstrar
capacidade
para
exercer
actividade
em
equipas
multidisciplinares;
adquirir
conhecimentos que permitam a compreenso e aplicao dos princpios do controlo e

garantia da qualidade; e desenvolver capacidade para realizar trabalho autnomo
associado ao diagnstico laboratorial.
Relatrio de Estgio
195
Bibliografia
BIBLIOGRAFIA
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Bula do kit Hydragel 4 IF da Sebia
Bula do kit Hydragel 54 Protein(e) da Sebia
Bula do kit Hydragel 7 Hemoglobin(e) da Sebia
Bula do Mini API. BioMrieux
Bulas da Abbott Laboratories, Diagnostics Division dos reagentes utilizados no

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Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE. Tietz fundamentals of Clinical Chemistry. 6th ed.
London: Saunders; 2008.
Cstera L, Pawlotsky JM. Diagnosis and Monitoring of Viral Hepatitis. BioMrieux
Compendium Urinalysis - Urinalysis with Test Strips. Mannheim: Roche Diagnostics

GmbH. 2008
Cunha ML: Manual da Qualidade do Servio de Patologia Clnica IPOLFG. 2011.
Instrues de trabalho do Laboratrio de Bioqumica do Servio de Patologia Clnica do

IPOLFG
Instrues de trabalho do Laboratrio de Imunologia do Servio de Patologia Clnica do

IPOLFG
Instrues de trabalho do Laboratrio de Virologia do Servio de Patologia Clnica do

IPOLFG
Jacobs DS, DeMott WR, Oxley DK. Jacobs & DeMott Laboratory text handbook. 5th ed.
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Johnson AM, Ritchie RF, Ledue TB. Protein Learning Guide. USA: Abbott Laboratories,
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Relatrio de Estgio
196
Bibliografia
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Mtodos de ensaio do Laboratrio de Bioqumica do Servio de Patologia Clnica do

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Mtodos de ensaio do Laboratrio de Imunologia do Servio de Patologia Clnica do

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Mtodos de ensaio do Laboratrio de Virologia do Servio de Patologia Clnica do

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Murray P, Baron E, Pfaller M, Tenover F, Yolken R. Manual of Clinical Microbiology.7th

ed. Washington: American Society for Microbiology; 1999
Murray PR, Baron EL, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of Clinical
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Prieto Valtuea, J.M, Balcells. La Clnica y el Laboratorio. 20 ed. Masson; 2006.
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Rapidlab Analisador de pH/gases sanguneos 348 - Manual do operador. Bayer

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Reed R. Learning Guide Clinical Chemistry. USA: Abbott Laboratories, Diagnostics

Division. 2010
Slides das aulas das disciplinas de Imunologia, Bioqumica Clnica I, Bioqumica Clnica
II, Virologia, Bacteriologia, Micologia, Parasitologia, leccionadas no Mestrado em
Anlises Clnicas 2009-2011.
Spicer JW. Bacteriologia, Micologia e Parasitologia Clnica. 1 ed. Guanabara Koogan;

2002.
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Struthers JK, Westran RP. Clinical Bacteriology. London: Manson Publishing; 2003;
Relatrio de Estgio
197
MONOGRAFIA:
TRATAMENTO E DIAGNSTICO DA FENILCETONRIA
ORIENTAO:
Professora Doutora Isabel Maria Antolin M. C. Croce Rivera
LISBOA, 2011
Resumo
A fenilcetonria (Phenylketonuria - PKU) um erro do metabolismo da fenilalanina, de
hereditariedade autossmica recessiva, que resulta de uma deficincia na enzima fenilalanina
hidroxilase (phenylalanine hydroxylase PAH). A PKU e as hiperfenilalaninmia associadas
(hyperphenylalaninaemia HPA) so causadas por mutaes no gene da PAH, localizado no
cromossoma 12q23.2. A PKU no tratada associa-se a um fentipo anmalo, que varia de
acordo com o gentipo do doente e pode manifestar-se atravs de atraso no crescimento,
microcefalia, convulses e atraso mental e intelectual. No entanto, desde a introduo dos
programas de rastreio neonatal e devido interveno diettica, as crianas afectadas tm a
possibilidade ter uma vida relativamente normal.
A frequente desistncia da dieta verificada, principalmente, na adolescncia e vida adulta
conduziu a uma crescente investigao de novas estratgias teraputicas, algumas j aplicadas
na prtica clnica. O rastreio pr-natal seguido de genotipagem tambm visto como uma
opo para melhorar a qualidade de vida dos indivduos fenilcetonricos, pois permitir a
aplicao de uma dieta mais personalizada.
Embora haja um grande interesse e desenvolvimento nesta rea, necessria ainda uma
melhor compreenso das bases, bioqumicas, genticas e moleculares da PKU de maneira a
ultrapassar esses obstculos, providenciando um melhor tratamento aos doentes
fenilcetonricos.
Abstract
Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive inborn error of phenylalanine
metabolism resulting from deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH). Most forms of
PKU and hyperphenylalaninaemia (HPA) are caused by mutations in the PAH gene on
chromosome 12q23.2. Untreated PKU is associated with an abnormal phenotype, that varies
according with the patient genotype and it can include growth failure, microcephaly, seizures
and global developmental and intellectual delay. However, since the introduction of newborn
screening programs and with early dietary intervention, children born with PKU can expect to
lead relatively normal lives.
The verified frequent discontinuance of the diet, mostly in adolescence and adult life, lead
to a growing research of new therapeutic strategies, some are already applied in the clinical
use. The prenatal screening followed by genotyping is also seen like an option to improve the
quality of life of the phenylketonuric individuals because it will allow the application of a
more personalized diet.
Although there is a great deal of interest and development in this area, it is still needed a
better understanding of the biochemistry, genetics and molecular basis of PKU to overcome
these obstacles, providing a better treatment for the phenylketonuric patients.
NDICE
NDICE DE FIGURAS
193
LISTA DE ABREVIATURAS
194
8. INTRODUO
195
9. HISTRIA
197
10. BIOQUMICA DA FENILCETONRIA
199
10.1.
Metabolismo da Fenilalanina
200
10.2.
Fenilalanina Hidroxilase propriedades e gene
202
11. PATOGNESE DA FENILCETONRIA
205
12. FENILCETONRIA MATERNA
206
13. RASTREIO E DIAGNSTICO
208
13.1.
Mtodos de Rastreio
208
13.2.
Diagnstico
210
13.3.
Rastreio Pr-Natal
212
13.4.
Diagnstico Molecular
212
14. TRATAMENTO
213
14.1.
Restrio Diettica
213
14.2.
Terapia com BH4
216
14.3.
Terapia de Substituio Enzimtica
218
14.4.
Terapia com Aminocidos Neutros Grandes
219
14.5.
Terapia Gnica
221
15. FENILCETONRIA EM PORTUGAL
223
16. CONCLUSO
225
BIBLIOGRAFIA
227
NDICE DE FIGURAS
Figura 1 Metabolismo da fenilalanina e principais vias de entrada e sada da fenilalanina 199
Figura 2 Biossntese e regenerao do cofactor tetra-hidrobiopterina e hidroxilao dos
aminocidos aromticos. ........................................................................................................ 200
Figura 3 Metabolismo da Fenilalanina ................................................................................ 201
Figura 4 Estrutura do gene PAH humano ............................................................................ 203
Figura 5 Exemplo de um carto para gotas de sangue seco usado para a colheita de sangue
de recm-nascidos................................................................................................................... 209
Figura 6 Algoritmo para um resultado de fenilalanina elevada no rastreio de recm-nascidos
................................................................................................................................................ 211
Figura 7 Saqueta de PKU gel. ............................................................................................. 216
Figura 8 Saqueta de PKU Express....................................................................................... 216
Figura 9 Dicloridrato de sapropterina. ................................................................................. 217
Figura 10 Degradao da fenilalanina. ................................................................................ 218
Diagnstico e Tratamento da Fenilcetonria
193
LISTA DE ABREVIATURAS
6-PT - 6-piruvol-tetra-hidropterina (6-pyruvil tetrahydrobiopterin)
6-PTS - 6-piruvol-tetra-hidropterina sintetase (6-pyruvil tetrahydrobiopterin synthase)
ACMG - Colgio Americano de Gentica Mdica (American College of Medical Genetics)
APOFEN - Associao Portuguesa de Fenilcetonria
BH2 - Di-hidrobiopterina
BH4 - Tetra-hidrobiopterina (Tetrahydrobiopterin)
DHFR - Dihidrofolato Redutase (Dihydrofolate Reductase)
DHPN - Di-hidroneopterina-trifosfato (Dihydoneopterin triphosphate)
DHPR - Di-hidropterina Redutase (Dihydropterin Reductase)
DNA - cido desoxirribonucleco (Deoxyribonucleic acid)
EUA Estados Unidos da Amrica
GTP - Guanosina trifosfato (Guanosine triphosphate)
GTPCH - GTP ciclo-hidrolase (Guanosine triphosphate cyclohydrolase)
HPA - Hiperfenilalaninmia (Hyperphenylalaninemia)
LCR Lquido Cefalorraquidiano
LNAA - Aminocidos neutros grandes (Large neutral amino acid)
NADH - Dinucletido de Nicotinamida e Adenina (Nicotinamide adenine dinucleotide)
NADPH Fosfato de Dinucletido de Nicotinamida e Adenina (Nicotinamide Adenine
Dinucleotide Phosphate)
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man
PAH - Fenilalanina hidroxilase (Phenylalanine hydroxylase)
PAL - Fenilalanina Amnia Liase (Phenylalanine Ammonia-Lyase)
PEG-PAL - Fenilalanina Amnia Liase pegilada
PKU - Fenilcetonria (Phenylketonuria)
rAAV - Vrus do Tipo Adenovrus Recombinantes (Recombinant Adeno-Associated Viral)
RFLP - Padres de Restrio Polimrficos (Restriction fragment length polymorphism)
RNA - cido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
TRH - Triptofano Hidroxilase (Tryptophan Hydroxylase)
TYH - Tirosina Hidroxilase (Tyrosine Hydroxylase)
194
Introduo
1. INTRODUO
A fenilcetonria e as hiperfenilalaninmias com ela relacionadas, constitui o mais comum
dos erros hereditrios do metabolismo dos aminocidos. Trata-se de uma doena gentica
autossmica recessiva, cuja incidncia de 1:13.500 a 1:19.000, nos Estados Unidos da
Amrica (1). A fenilcetonria tambm a primeira doena metablica na qual um agente
txico, a fenilalanina, foi identificado como a causa de atraso mental e cujo tratamento foi
reconhecido por prevenir os sintomas clnicos (2). A sua causa primria a existncia de
mutaes no gene que codifica a enzima fenilalanina hidroxilase (PAH; EC 1.14.16.1), uma
enzima heptica responsvel pela hidroxilao de fenilalanina em tirosina. As mutaes (mais
de 500 at agora detectadas) ocorrem no PAH gene, localizado no cromossoma 12q23.2, e
resultam numa diminuio ou ausncia de actividade da PAH (3). A deficiente actividade
cataltica desta enzima provoca acumulao de fenilalanina no organismo, que se reflecte num
aumento dos seus nveis plasmticos e diminuio dos nveis de tirosina. Consequentemente,
a fenilcetonria, quando no tratada, caracteriza-se por um profundo atraso mental, intelectual
e fsico, microcefalia e convulses (4, 5).
A deteco precoce dos recm-nascidos afectados possvel atravs de um sistema de
rastreio neonatal, institudo na maioria dos pases desenvolvidos desde a dcada de 80 (6).
Aps um resultado positivo no rastreio, necessrio realizar um teste de diagnstico a fim de
classificar a fenilcetonria, com vista a aplicar o tratamento mais apropriado. A fenilcetonria
causada pela deficincia em PAH apresenta uma grande heterogeneidade fenotpica devido
natureza das mutaes (7), o que se vai reflectir em diferentes concentraes de fenilalanina
no sangue dos doentes. Os nveis plasmticos de fenilalanina permitem assim a classificao
dos diferentes fentipos: PKU clssica ([fenilalanina] >1200 mol/L), PKU moderada
([fenilalanina] = 600-1200 mol/L ), hiperfenilalaninmia moderada no-PKU ([fenilalanina]
>600 mol/L) (8).
Os doentes fenilcetonricos tm tido a possibilidade de ter uma vida relativamente normal,
ausente de sintomas clnicos, desde o aparecimento da terapia diettica h 60 anos (4). A dieta
da PKU consiste numa restrio do consumo de protenas naturais de maneira a minimizar a
ingesto de fenilalanina. Esta condio diettica pode ser conseguida atravs de comidas
especializadas e suplementos suficientes de aminocidos essenciais, energia vitaminas e
minerais (9). De maneira a evitar o atraso mental, a dieta deve ser iniciada logo nas primeiras
semanas de vida (5) e por isso o rastreio neonatal essencial para a identificao precoce
destes doentes. O tratamento deve ser mantido durante toda a vida uma vez que a
195
Introduo
hiperfenilalaninmia nos adultos tem sido associada a dificuldades na ateno e concentrao,

instabilidade de humor e degenerao na matria branca (1) (10). Durante a gravidez, os
nveis de fenilalanina moderadamente altos na me pode causar microcefalia, atraso mental e
doena cardaca congnita no feto (11), resultando no sndrome de PKU materna.
O tratamento com base na restrio diettica, apesar da sua eficcia na preveno do atraso
mental, tem algumas desvantagens como o risco de desnutrio, grandes custos quer
econmicos quer sociais para o doente e a famlia, para alm de se ter observado que mesmo
os doentes tratados apresentam algum atraso nas suas funes neurolgicas (12). Assim, no
de surpreender a frequente desistncia da dieta que se verifica a partir, principalmente, da
adolescncia (9) (13). Por estas razes, nas ltimas dcadas, tem-se verificado uma crescente
procura de alternativas restrio diettica com vista a aumentar a qualidade de vida dos
doentes fenilcetonricos. Esta procura tem passado por frmulas medicinais de melhor sabor
(14), suplementao de aminocidos grandes e neutros (15), novas terapias farmacolgicas,
como o caso da terapia com BH4 (16) e terapias de substituio (17). A necessidade de um
diagnstico mais precoce e especfico de modo a aplicar um tratamento mais personalizado
tambm tem sido alvo de investigao nos ltimos anos, sendo estes os dois temas principais
da monografia.
196
Histria
2. HISTRIA
A fenilcetonria clssica foi detectada pela primeira vez pelo mdico noruegus Asbjrn
Flling (Figura 2-1), em 1934 (18). A descoberta aconteceu quando a me de duas crianas,
ambas com atraso mental, perguntou a Flling se o odor bolorento da urina das crianas
poderia estar relacionado com o seu atraso mental. Suspeitando que o cheiro pudesse estar
relacionado com a excreo de acetoacetato, Flling testou a urina com cloreto frrico, usado
na pesquisa de corpos cetnicos. O resultado foi uma colorao verde escura, em vez da cor
prpura esperada. Aps no ter chegado a quaisquer concluses com este resultado, o mdico
procedeu a anlises qumicas mais detalhadas, envolvendo extraco orgnica, purificao e
determinao da temperatura de fuso do composto em estudo, identificando a substncia
como sendo cido fenilpirvico (18).
Flling decidiu proceder a anlise de 430 amostras de urina de doentes com atraso mental,
provenientes de algumas instituies locais, acabando por obter um resultado semelhante ao
anterior em oito desses doentes (18). Flling publicou as suas descobertas e sugeriu o termo
imbecillitas phenylpyruvica para descrever a doena (19). Em 1937, George Jervis sugeriu
o termo phenylpyruvic oligophrenia que, ainda no mesmo ano, foi substitudo por
fenilcetonria, sugerido pelo geneticista britnico Lionel Penrose, que justificou a sua
escolha com a presena caracterstica do cido fenilpirvico na urina (20). Esta designao foi
amplamente aceite e perdura at hoje. No mesmo ano, a PKU foi associada disfuno da
enzima fenilalanina hidroxilase por George Jervis,
Na terceira dcada aps a descoberta de Flling, entre 1954 e 1964, centrou-se no
tratamento e na deteco precoce da doena. Bickel, mdico alemo, verificou que a ausncia
de fenilalanina na dieta dos doentes conduzia a melhorias no estado geral dos doentes,
inclusivamente a nvel mental (21). Em 1956, identificada, pela primeira vez, a PKU
materna como a sndrome correspondente a grvidas que apresentem nveis elevados de
fenilalanina no sangue, concebendo crianas com microcefalia e atraso mental, embora sem
hiperfenilalaninmia (22). O teste de Guthrie, desenvolvido por Robert Guthrie, em Bufallo,
surge na dcada de 60 (23). O teste de Guthrie consiste num teste de rastreio de PKU em
massa para recm-nascidos, preciso e barato, feito a partir de uma poro de sangue colocada
num papel de filtro (24). Nos EUA, iniciado o rastreio em massa de recm-nascidos usando
o teste de Guthrie e em 1967, j 37 estados dos EUA tinham leis sobre o rastreio neonatal para
a PKU (24). Ainda na mesma dcada, vrios programas de rastreio neonatal surgiram em todo
o mundo com o objectivo de se realizar um diagnstico e tratamento precoces a fim de evitar
197
Histria
o atraso mental em doentes fenilcetonricos. A fenilcetonria torna-se assim um prottipo de

diagnstico gentico.
Em 1983 o gene que codifica para a PAH humana isolado, clonado e mapeado no
cromossoma 12 por Savio Woo (25). Aps 10 anos, criado um rato fenilcetonrico
geneticamente alterado, por David McDonald e Alexandra Shedolvsky (26). Este modelo
permite assim o desenvolvimento de estudos eticamente impossveis em humanos.
Em 2007, surge o primeiro frmaco (Kuvan, BioMarin), aprovado pela FDA, responsvel
por baixar os nveis de fenilalanina no sangue de alguns doentes fenilcetonricos (27). Em
2009, a BioMarin inicia um estudo usando a enzima fenilalanina amnia liase (PEG-PAL)
como terapia de substituio.
A descoberta da PKU por Asbjrn Flling foi um marco importante na histria da
medicina, tornando a PKU um modelo de demonstrao dos efeitos neurolgicos que os erros
metablicos podem ter e de como a teraputica pode alterar drasticamente as manifestaes da
doena. Por outro lado, o desenvolvimento do teste de Guthrie e a restrio diettica levaram
preveno do atraso mental nas crianas com PKU de todo o mundo. Alm disso, a
fenilcetonria tem sido usada como modelo para a descoberta de mais de 200 erros
metablicos.
198
Bioqumica da Fenilcetonria
3. BIOQUMICA DA FENILCETONRIA
A fenilalanina, apesar de existir sob a forma de enantimeros D e L, na forma L (L-phe)
que se torna um aminocido essencial e importante na dieta humana para a sntese de
protenas (28). Tal como acontece com outros metabolitos, a fenilalanina encontra-se sujeita a
mecanismos reguladores que permitem apenas pequenas oscilaes das concentraes de
fenilalanina nos diferentes tecidos, promovendo assim a homeostasia da fenilalanina. As
concentraes de fenilalanina, apesar de diferentes nos vrios compartimentos biolgicos, so
mantidas num estado estacionrio. Este estado resulta de um balano entre: mecanismos de
aporte, exgenos atravs da dieta e endgenos atravs da pool de aminocidos livres e de
polipptidos; e mecanismos de eliminao que envolvem a incorporao da fenilalanina em
protenas, a sua oxidao em tirosina e a sua converso em metabolitos menores (29) (Figura
1). Um distrbio num destes mecanismos pode levar a um desequilibro e conduzir a uma
doena metablica, a fenilcetonria.
Figura 59 Metabolismo da fenilalanina e principais vias de entrada e sada da fenilalanina. 1 - Via de sada atravs da
hidroxilao para a tirosina (reaco catalisada pela PAH, seguida de oxidao); 2 Via de sada atravs da descarboxilao
para feniletilamina; 3 Via de sada atravs de transaminao para fenilpiruvato; 4 - Via de sada atravs da incorporao de
fenilalanina em pools de polipptidos. Adaptado de (29)
A fenilcetonria e as variantes de hiperfenilalaninmia tm origem num bloqueio do

sistema de hidroxilao (discutido posteriormente). Este bloqueio pode ser ao nvel da enzima
fenilalanina hidroxilase ou ao nvel da regenerao e sntese do cofactor tetrahidrobiopterina.
No organismo, existem outras hidroxilases cujo cofactor BH4 e que actuam sobre outros
aminocidos, nomeadamente, a tirosina e triptofano (Figura 2). A tirosina hidroxilase catalisa
a hidroxilao do triptofano em 3,4-di-hidroxifenilalanina (DOPA), um importante
199
neurotransmissor e precursor da epinefrina e norepinefrina. A triptofano hidroxilase catalisa a

converso do triptofano em 5-hidroxitriptofano, um precursor da serotonina.
Figura 60 Biossntese e regenerao do cofactor tetra-hidrobiopterina e hidroxilao dos aminocidos aromticos. GTP
Guanosina trifosfato (Guanosine triphosphate); GTPCH GTP ciclo-hidrolase (Guanosine triphosphate cyclohydrolase);
DHNP - dihidroneopterina-trifosfato (dihydoneopterin triphosphate); 6-PTS 6- piruvol-tetra-hidropterina sintetase (6 pyruvil tetrahydrobiopterin synthase); 6-PT - 6- piruvol-tetra-hidropterina (6 - pyruvil tetrahydrobiopterin); DHPR-dihidropterina redutase (dihydropterin redutase); BH2 di-hidrobiopterina; TYH tirosina hidroxilase (tyrosine hydroxylase);
TRH- triptofano hidroxilase (tryptophan hydroxylase)
Assim, uma deficincia ao nvel da PAH conduz apenas a elevao dos nveis de
fenilalanina no sangue, designando-se esta doena de fenilcetonria. Por outro lado, uma
deficincia ao nvel do cofactor BH4 provoca no s aumento das concentrao plasmticas de
fenilalanina como tambm uma sntese deficiente dos neurotransmissores, catecolaminas e
serotonina, levando a sintomas neurolgicos graves, designando-se esta situao de PKU
maligna.
3.1. Metabolismo da Fenilalanina

A fenilalanina pode sofrer metabolizao por trs vias: hidroxilao a tirosina,
transaminao e descarboxilao (Figura 3).
200
Figura 61 Metabolismo da Fenilalanina. Fonte: (30)
O sistema de hidroxilao da fenilalanina em tirosina (31) ocorre no fgado e depende dos

seguintes componentes:
Enzima fenilalanina hidroxilase (PAH);
Cofactor de natureza no proteica tetrahidrobiopterina (BH4);
Enzimas usadas na regenerao do BH4: dihidropteridina redutase (DHPR) e 4carbinolamina desidratase.
A fenilalanina convertida em tirosina por aco da PAH, que necessita do cofactor BH4
para exercer a sua actividade cataltica (32). Durante a reaco, a BH4 inicialmente
convertido em 4--carbinolamina e, seguidamente, em di-hidrobiopterina quinonide,
converso catalisada pela 4--carbinolamina desidratase (33). A BH4 regenerada a partir da
forma quinonide por aco da DHPR, sendo usado NADH como coenzima. Na ausncia de
DHPR, a di-hidrobiopterina quinonide rearranja-se de uma forma no enzimtica em 7,8dihidrobiopterina, a qual convertida a BH4, por aco da dihidrofolato redutase (DHFR)
(34), usando como coenzima NADPH.
A hidroxilao da fenilalanina um passo obrigatrio e limitante na via catablica da
fenilananina, que conduz inicialmente formao do aminocido no-essencial tirosina e,
seguidamente, oxidao a dixido de carbono e gua. O catabolismo da fenilalanina fornece
ainda dois compostos, um cetognico (acetoacetato) e outro gluconeognico (fumarato)
201
(Figura 1), contribuindo para a pool de metabolitos de 2 carbonos e como fonte de glucose,
respectivamente (29). Deste modo, o catabolismo da fenilalanina tem um papel relevante na
funo e desenvolvimento cerebral normal, visto ser uma fonte de glucose, metabolito vital
para o crebro. Alm disso, o metabolismo da fenilalanina constitui tambm uma fonte
endgena de tirosina, que se pode tornar em aminocido essencial quando ocorre uma
alterao nesta via, como o caso da fenilcetonria.
No caso da fenilcetonria, esta via encontra-se comprometida conduzindo a uma
acumulao de fenilalanina de tal maneira que a via fica sem capacidade de resposta,
condio que ocorre nas formas mais graves da doena. O organismo, para contornar esta
situao, promove a metabolizao da fenilalanina por uma das vias alternativas. A via
prioritria a seguir hidroxilao a transaminao, que resulta na formao de
fenilpirtuvato, fenilactato, e hidroxifenilacetato, que so excretados na urina. Esta via
restrita metabolizao da cadeia lateral de alanina, sem que ocorra qualquer alterao do
anel aromtico, como se verifica na via de hidroxilao (35). A via de transaminao no
completamente funcional no beb prematuro nem na fase inicial da doena e induzida pelo
substrato, ou seja, ocorre apenas quando h acumulao de fenilalanina (29).
A terceira via de metabolizao da fenilalanina consiste na sua descarboxilao em
feniletilamina. No entanto, no uma via importante para a eliminao do excesso de
fenilalanina uma vez que os inibidores da monoamino oxidase bloqueiam o metabolismo
posterior da fenietilamina (36)
As taxas de eliminao da fenilalanina, pelas vias metablicas alternativas, diferem entre
gentipos idnticos e influenciam o fentipo de PKU (37).
3.2. Fenilalanina Hidroxilase propriedades e gene

Como referido anteriormente, a fenilcetonria pode ser causada por mutaes no gene que
codifica a enzima fenilalanina hidroxilase. A fenilalanina hidroxilase maioritariamente
expressa no fgado (para alm do rim e pncreas) e catalisa irreversivelmente a hidroxilao
da fenilalanina em tirosina (31).
A PAH uma protena oligomrica que requer ferro e oxignio molecular assim como o
cofactor pterina, BH4, para a sua actividade cataltica. A PAH constituda por subunidades
com idntica estrutura primria e em soluo existe numa mistura de tetrmeros e dmeros,
tendo cada subunidade uma massa molecular de 50 kDa (38). O Km aparente da enzima para a
fenilalanina, na presena de BH4, de 50M (39)
202
A enzima possui diferentes domnios funcionais: o domnio regulador contm um resduo

de serina, envolvido na sua activao por fosforilao; o domnio cataltico contm um
motivo de cerca de 27 aminocidos responsvel pela ligao ao cofactor pterinnco; o domnio
C-terminal pensa-se estar relacionado com a ligao inter-subunidades (38).
A PAH extremamente sensvel a variaes na concentrao de fenilalanina. Esta
sensibilidade assegura que a exposio dos tecidos a altas concentraes de fenilalanina seja
mnima e assegura que a hidroxilao de fenilalanina em tirosina no conduza a uma depleo
da fenilalanina de maneira a comprometer a sntese proteica (29). Este equilbrio conseguido
atravs dos seguintes mecanismos de regulao: activao/inactivao alostrica causada pela
interaco com o substrato fenilalanina ou com o cofactor BH4, respectivamente (29);
activao/desactivao por processos de fosforilao/desfosforilao, catalisados por aco da
protena cinase cAMP-dependente (29, 40).
O gene PAH encontra-se localizado no brao longo do cromossoma 12, na regio 12q23.2,
ocupa cerca de 171,266 pb de DNA genmico e estrutura-se em 13 exes (40, 41). O
mensageiro tem cerca de 2,4 kb, constituindo 2,9 % da sequncia genmica e codifica um
polipptido de 452 aminocidos (Figura 4) (29).
O gene humano da PAH apresenta uma grande variao allica tendo sido j descobertas
528 nos 13 exes do gene e nas regies que o ladeiam (3).
Figura 62 Estrutura do gene PAH humano. Fonte: (42)
As mutaes podem ser de vrios tipos (29):

Mutaes missense: 62% dos alelos PAH;
Pequenas e grande deleces: 13%;
Defeitos de splicing: 11%;
Polimorfismos silenciosos: 6%;
203
Mutaes nonsense: 5%
Inseres: 2%
Algumas mutaes so mais graves que outras, dependendo do seu efeito na estrutura e
funo da enzima. No entanto, o efeito destas no fentipo do indivduo varivel (43), no
havendo ainda um consenso se, por exemplo, existe ou no uma correlao entre o quociente
de inteligncia do indivduo fenilcetonrico e o seu gentipo PAH (44) (45). Vrios estudos
relacionam a gravidade das mutaes com as taxas de hidroxilao da fenilalanina na maioria
dos indivduos (46). No entanto, existem excepes relacionadas com o facto de a actividade
da PAH depender do cofactor BH4 (47), pelo que h gentipos que respondem melhor a um
tratamento com BH4 que outros (48), fenmeno discutido no captulo 7.
204
Patognese da Fenilcetonria
4. PATOGNESE DA FENILCETONRIA
A PKU quando no tratada, como se verifica nalguns casos de abandono da teraputica na
adcolescncia (9) apresenta um fentipo anmalo que inclui microcefalia, deficincia no
crescimento, convulses (29), um atraso intelectual e mental profundo, distrbios motores,
problemas na ateno e percepo (49), verificando-se tambm alguns comportamentos
alterados como hiperactividade e agressividade (50).
Clinicamente, o principal efeito da hiperfenilalaninmia no fentipo da PKU ocorre a nvel
do desenvolvimento e funo cerebrais. Os mecanismos propostos para explicar esta aco
patognica so os seguintes: hipomielinizao e desmielinizao; um efeito nos processos de
transporte e distribuio de metabolitos no crebro; efeitos nos processos neuroqumicos e
metablicos.
A primeira hiptese baseia-se no facto de elevados nveis de fenilalanina inibirem uma via
metablica essencial dos oligodendrcitos, comprometendo a produo e manuteno de
mielina por parte destes (50). A mielina parece influenciar o desenvolvimento axonal, durante
o qual ocorre a produo de neurotransmissores. Por outro lado, a fenilalanina pode diminuir
a produo das aminas neurotransmissoras, dopamina, noradrenalna e serotonina, cujos
precursores so a tirosina e triptofano. O excesso de fenilalanina pode provocar a inibio
competitiva da tirosina e triptofano hidroxilases, conduzindo a uma deficiente produo das
aminas (51). Outra hiptese baseia-se no facto de os aminocidos neutros grandes (Large
Neutral Amino Acids - LNAA) e a fenilalanina partilharem o mesmo transportador de barreira
hemato-enceflica. Assim, numa situao de hiperfenilalaninmia, a competio pelo
transportador vai provocar uma diminuio no transporte dos LNAA pela barreira, afectando
a sntese proteica no crebro. No entanto, nenhuma destas hipteses consegue explicar por si
s, o fentipo cerebral evidenciado pelos doentes fenilcetonricos.
205
Fenilcetonria Materna
5. FENILCETONRIA MATERNA
A fenilcetonria materna um problema conhecido h muito tempo mas adquiriu especial
ateno quando a primeira gerao sujeita ao rastreio neonatal atingiu a idade gestacional. O
sndrome da fenilcetonria materna trata-se ento de uma embriopatia/fetopatia que afecta
crianas nascidas de mes hiperfenilalaninmicas, que no seguiram um controlo metablico
durante a gravidez. As crianas apresentam este sndrome independentemente do seu gentipo
pois, uma vez que a fenilcetonria uma doena autossmica recessiva, todas as crianas
nascidas de mes fenilcetonricas possuem pelo menos 1 gene mutado no locus PAH, herdado
da me homozigtica. A criana ser homozigtica ou heterozigtica (portador) para a
fenilcetonria, dependendo do gentipo do pai.
Esta patologia consequncia de um excesso de fenilalanina intrauterina no
compartimento fetal devido a um gradiente transplacentrio positivo (52). A razo feto:me
mdia para a hiperfenilalaninmia materna de 1,5 tendo-se, contudo, registado valores que
variam desde 1,1 a 2,9, o que torna difcil prever o valor plasmtico de fenilalanina do feto a
partir do valor correspondente da me (29). Assim, o tratamento pr-concepcional ter como
objectivo a manuteno dos valores de fenilalanina o mais prximo possvel do normal e o
mais cedo possvel na gravidez. Os valores recomendados so de 100-360mol/L (53).
A fenilcetonria materna tem uma grande relevncia clnica na medida em que est
provado que altas concentraes de fenilalanina so teratognicas e aumentam o risco de
aborto (54). Alm disso, constatou-se que as crianas e/ou fetos, que nascem de mes
hiperfenilalaninmicas no tratatas, apresentam atraso no crescimento intra-uterino,
dismorfismo facial, baixa estatura, microcefalia, doena cardaca congnita, anomalias sseas
e atraso intelectual (53, 55, 56).
A preveno torna-se assim o caminho correcto a seguir. Tem-se constatado que a
implementao de uma dieta restrita em fenilalanina, iniciada antes da concepo e mantida
at ao parto, promove o nascimento de uma criana mental, psicolgica e fisicamente normal,
a partir de uma mulher hiperfenilalaninmica (57-59). A normalizao dos nveis de
fenilalanina no sangue deve ocorrer antes da concepo e os valores medidos semanalmente
(29). Este controlo metablico essencial principalmente no 1 trimestre uma vez que este
corresponde ao perodo de menor tolerncia materna fenilalanina e de maior
desenvolvimento dos rgos fetais. No segundo e terceiro trimestres verifica-se um aumento
da tolerncia devido ao aumento da sntese proteica e, provavelmente, de uma maior
capacidade do feto heterozigtico em metabolizar a fenilalanina (29). Alm disso, um estudo
206
Fenilcetonria Materna
demonstrou que mulheres que engravidam durante uma dieta no restrita sentem maiores
dificuldades em conseguir um bom controlo metablico durante o resto da gravidez (57).
Torna-se ento certo que as mulheres com fenilcetonria devem iniciar uma dieta restrita em
fenilalanina antes da concepo, a fim de melhorar o crescimento cerebral e neurolgico do
feto (57).
A fenilcetonria materna bem como a fenilcetonria clssica resultam em atraso mental,
como j foi referido. No entanto, o mecanismo responsvel por este fentipo nas duas
patologias parece ser distinto uma vez que um dos sintomas da fenilcetonria materna a
microcefalia, enquanto na hiperfenilalaninmia ps-natal o mesmo no acontece. Assim,
apesar dos efeitos da fenilcetonria clssica serem, possivelmente mediados pela reduo na
funo das clulas gliais, como j foi referido anteriormente, o atraso mental e a microcefalia
no feto parecem estar relacionados com a reduzida proliferao de astrcitos, provocada pelo
excesso de metabolitos de fenilalanina, tais como cido fenilactico, cido fenil-lctico, cido
fenilpirvico, cido hidroxifenilactico, feniletilamina e cido mandlico (60).
Apesar dos esforos, a fenilcetonria materna continua a ser um grande desafio pois
existem factores no biolgicos, que nem sempre so fceis de contornar, como o nvel
socioeconmico e educacional, a adeso ao tratamento, a qualidade do apoio emocional e
psicolgico da mulher em tratamento bem como o ambiente ps-natal para a criana (20). A
soluo para estes problemas requer a identificao de obstculos, sociais, comportamentais e
polticos que poder conduzir a reestruturaes dos servios de sade, formao de pessoal
especializado no cuidado de adultos com doenas metablicas hereditrias, bem como uma
educao adequada da mulher desde a infncia, a fim de dar a conhecer a doena e a
necessidade de uma dieta restrita antes da concepo (57, 61). Alm disso, tem-se verificado
que no existe uma correlao simples entre o fentipo intelectual de doentes fenilcetonricos
e o seu gentipo devido, provavelmente, a factores ambientais e outros genes que possam
contribuir para o fentipo clnico (43, 57), o que poder influenciar a fenilcetonria materna.
207
Rastreio e Diagnstico
6. RASTREIO E DIAGNSTICO
Os objectivos do rastreio neonatal e do diagnstico da hiperfenilalaninmia so a
interveno mdica precoce e correcta, respectivamente, de doenas que seriam detectadas
apenas com o aparecimento de manifestaes irreversveis ou mesmo da morte. A deteco e
interveno precoces conduziram, nos ltimos anos, a uma eliminao ou diminuio da
mortalidade e das incapacidades associadas a estas doenas (24, 62), pois a fenilcetonria,
apesar de relativamente rara, tem uma morbilidade significativa (63). A introduo do rastreio
neonatal veio alterar muito o prognstico da doena, permitindo que muitas das crianas e
adultos fenilcetonricos sejam mental e fisicamente normais. O prognstico depende da idade
em que diagnosticada a doena e iniciado o tratamento mas tambm do tipo de mutao no
gene PAH. Actualmente, cr-se que cerca de 95-100% da populao dos pases
desenvolvidos, est coberta pelo rastreio neonatal (62, 64).
Os valores de fenilalanina no sangue dos recm-nascidos fenilcetonricos apenas comeam
a aumentar aps a separao da placenta. Segundo o American Academy of Pedriatics
Committee on Genetics, as determinaes de fenilalanina plasmtica devem ser feitas entre o
2 e o 4 dia de vida (65). Caso seja dada alta antes das 24 horas de vida do recm-nascido,
recomendado uma colheita inicial no hospital e uma repetio ao fim de 7-21 dias de vida
(65).
6.1. Mtodos de Rastreio

O rastreio neonatal uma actividade de sade pblica que teve incio na dcada de 60
graas ao Dr. Robert Guthrie, que desenvolveu um teste de diagnstico para a fenilcetonria
Teste de Guthrie (23). O teste feito partir de uma pequena poro de sangue colhida do
calcanhar do recm-nascido e depositada num papel de filtro (Figura 5) (23). O mtodo
original simples e baseia-se numa inibio bacteriana: uma cultura padro de Bacillus
subtilis incubada em agar na presena de um antagonista da fenilalanina (-2-tienilalanina)
que impede o crescimento bacteriano. Quando os discos de sangue seco so postos em
contacto com o agar, a presena de fenilalanina supera a inibio do crescimento bacteriano,
permitindo a determinao de excesso de fenilalanina atravs do crescimento bacteriano (23).
208
Figura 63 Exemplo de um carto para gotas de sangue seco usado para a colheita de sangue de recm-nascidos. Fonte:
(30)
O teste tem como vantagens ser barato, simples e fivel pois o sangue seco no papel de
filtro estvel durante anos, apresentando uma taxa de erro baixa (29). Apesar destas
vantagens, a baixa preciso para nveis baixos de fenilalanina uma limitao, levando ao
aparecimento de falsos negativos (66). Nos ltimos anos, este mtodo foi sendo substitudo
por outros mais eficazes como mtodos enzimticos, cromatogrficos, fluorimtricos e, mais
recentemente, a espectrometria de massa, que medem o contedo em fenilanina das amostras
de sangue colhidas em papel de filtro (29).
Actualmente, a tendncia a me e o recm-nascido permanecerem no hospital o menos
tempo possvel depois do parto de modo a diminuir os custos com os cuidados de sade. Esta
condio, juntamente com o facto do mtodo microbiolgico apresentar uma taxa de falsos
negativos significante (67), conduziu necessidade de mtodos mais sensveis e rpidos sem
conduzir ao aumento de resultados falsos positivos (63). Assim, a espectrometria de massa
tornou-se o mtodo de rotina para os testes de rastreio, substituindo os mtodos anteriormente
descritos (63). Alm disso, com a espectrometria de massa possvel fazer o rastreio de mais
de 25 doenas genticas num s ensaio (63, 68), tais como: hipotiroidismo congnito,
homocistinria, tirosinmia, galactosmia, hemoglobinopatias, fibrose qustica, distrofia
muscular de Duchenne, hiperlipidmia familiar fazem tambm parte das doenas que so
possveis determinar no rastreio neonatal (69). Este mtodo altamente sensvel, rpido e
eficaz em amostras de recm-nascidos apenas com 24 horas de vida sem aumentar a taxa de
resultados falsos positivos (70).
209
A taxa de casos no diagnosticados do rastreio neonatal para a fenilcetonria clssica

muito pequena (1 em 70 casos) (62). Os resultados falsos negativos podem ser causados por
erros no procedimento (62) ou mesmo ter causas biolgicas como o caso de
hiperfenilalaninmia no-PKU (62, 67). Alm disso, os resultados podem ser enviesados
devido a contaminao da amostra com ampicilina, nutrio parentrica, suplementao de
aminocidos ou variao entre lotes dos papis de filtro (29).
6.2. Diagnstico
Um resultado positivo do teste identifica um recm-nascido com hiperfenilalaninmia e o
teste de diagnstico identifica o fentipo metablico atravs da quantificao dos nveis
plasmticos da fenilalanina que devem ser inferiores a 150uM nos recm-nascidos e a 120 uM
nos restantes doentes (29). Embora alguns casos correspondam a hiperfenilalaninmias
transitrias, sem consequncias clnicas posteriores (por exemplo a deficincia em 4carbinolamina desidratase transitria), ou resultarem de hiperfenilalaninmia materna, cerca
de 98% dos casos de hiperfenilalaninmia causada por mutaes no locus PAH (29). Alguns
alelos PAH causam um fentipo PKU, no qual a concentrao de fenilalanina no sangue
excede os 600uM (10,5 mg/dL) enquanto outros alelos causam hiperfenilalaninmia no-PKU
no qual os valores de fenilalanina se encontram abaixo de 600uM (29). A distino destes
fentipos importante, uma vez que hiperfenilalaninmia no-PKU no causa danos
neurolgicos, ao contrrio da PKU clssica. Os restantes 2% correspondem a
hiperfenilalninmia causada por deficiente sntese e regenerao do cofactor tetrahidrobiopterina (BH4) (71), em que os doentes so tratados de maneira diferente dos doentes
fenilcetonricos, de modo a compensar a deficincia em BH4.
A
identificao
da
deficincia
em
fenilalanina
hidroxilase
como
causa
da
hiperfenilalaninmia, ou seja, excluso da deficincia em BH4, pode ser feita atravs das
seguintes determinaes:
Teor urinrio em metabolitos pternicos (biopterina total e neopterina) (72); O cofactor
BH4 pode tambm ser determinado a partir do sangue seco dos cartes de Guthrie
(73). Os nveis de BH4 encontram-se abaixo do normal no plasma, LCR e urina dos
doentes com deficincia no cofactor enquanto a razo neopterina:biopterina apresenta
um valor dentro dos parmetros normais no caso das hiperfenilalaninmias provocadas
pela deficincia em PAH (29).
210
Actividade enzimtica da dihidropterina redutase (DHPR) a partir do sangue seco do

papel de filtro (74). A deficincia em BH4 pode ser devido a uma sntese deficiente na
enzima DHPR (Figura 2), encontrando-se esta abaixo do normal nos casos de
hiperfenilalninmia causada pela deficincia no cofactor e em nveis normais na
hiperfenilalaninmia causada por uma mutao no gene PAH. A determinao desta
enzima pode ento permitir diferenciar os dois tipos de hiperfenilalninmia (75).
Nveis de neurotransmissores (76). Os nveis, no LCR, de cido homovanlico e cido
5-hidrox-indoleactico (derivados da tirosina e do triptofano, respectivamente) esto
diminudos nas doenas relacionadas com a sntese e regenerao de BH4.
Na figura seguinte encontra-se um algoritmo para o diagnstico diferencial acima
descrito, recomendado pelo American College of Medical Genetics, ACMG.
Figura 64 Algoritmo para um resultado de fenilalanina elevada no rastreio de recm-nascidos. Adaptado de (77)
211
6.3. Rastreio Pr-Natal

O diagnstico pr-natal uma alternativa ao rastreio neonatal e consiste na caracterizao
genotpica do feto atravs da anlise de DNA fetal, com a condio de j haver um filho
fenilcetonrico na famlia (78). O DNA fetal pode ser obtido a partir de amnicitos;
vilosidades corinicas, tendo em conta que estas podem estar contaminadas com tecidos
maternos; ou ainda de sangue fetal, caso a cultura dos amnicitos no seja bem sucedida (78).
Caso as mutaes de ambos os alelos mutados do paciente fenilcetonrico j estejam
identificadas, feita a pesquisa das mesmas no DNA fetal. Quando isto no possvel,
procede-se ao estabelecimento do haplotipo atravs da identificao dos padres de restrio
polimrficos (Restriction Fragment Length Polymorphisms RFLP) do locus PAH de ambos
os pais e a sua associao com a mutao (40, 79). At agora os RFLPs usados so: Bgl II,
Pvu II(a), Pvu II(b), Eco RI, Msp I, Xmn I, Hind III, Eco RV, assim como um VNTR no stio
Hind III (80, 81).
6.4. Diagnstico Molecular

O rastreio e diagnstico da PKU pode ser feito tambm ao nvel do gentipo, atravs da
identificao de mutaes no DNA do doente. A anlise de mutaes no gene PAH pode ser
especialmente til no diagnstico pr-natal e na deteco de portadores, como referido
posteriormente. Actualmente, usada uma grande variedade de tcnicas de gentica
molecular, tais como southern blotting, digesto com enzimas de restrio, anlise de
heteroduplex, electroforese em gel com gradiente desnaturante, chemical cleavage of
mismatch, hibridizao com oligonuclotidos especficos de alelos e RT-PCR (29). Existem
diversos tecidos usados como fonte de DNA, tais como sangue venoso, sangue seco a partir
dos cartes de Guthrie, clulas da cavidade bucal e fibroblastos (29, 82).
A anlise de DNA tem grande potencial por possibilitar a correspondncia entre o
gentipo e o fentipo atravs da determinao da actividade enzimtica de PAH, permitindo
um melhor prognstico e a implementao de uma dieta mais personalizada, de acordo com o
grau de deficincia em PAH (83, 84).
212
Tratamento
7. TRATAMENTO
A fenilcetonria, alm de ser uma doena gentica hereditria, pode ser tambm
considerada uma doena nutricional por depender do teor de um aminocido essencial, a
fenilalanina, encontrado numa dieta normal. O tratamento clssico da hiperfenilalaninmia a
normalizao das concentraes de fenilalanina no sangue, atravs de uma dieta restrita ou
pobre em fenilalanina, a fim de prevenir os danos psicolgicos e neurolgicos, caractersticos
desta doena. No entanto, devido dificuldade em manter a dieta na adolescncia e vida
adulta tm surgido vrias alternativas, como substituintes proteicos, terapia com tetrahidrobiopterina, substituio enzimtica, uso de aminocidos grandes neutros e terapia genica.
Os substituintes proteicos com hidratos de carbono, gordura, vitaminas e minerais so
normalmente os substituintes de eleio (9) pois so fceis de preparar e asseguram a
quantidade certa de vitaminas e minerais prescritos. No entanto, estes substituintes so
altamente calricos e necessrio consumir um grande volume para atingir a dose adequada
de aminocidos (9).
Estudos demonstram que chaperones farmacolgicos constituem uma abordagem
teraputica realista uma vez que so capazes de restaurar a actividade da PAH quando o gene
apresenta mutaesmenos graves (16).
A relevncia do misfolding de protenas em doenas hereditrias levou ao aparecimento de
novas estratgias teraputicas com base na estabilizao da conformao proteica ou na
restaurao a funo de algumas vias metablicas. Uma delas o BH4, recentemente
aprovado pela FDA e EMEA (27).
O modo de actuao da BH4, na deficincia de PAH no est relacionado com a aco do
cofactor mas sim com a estabilizao da protena ao desacelerar a agregao e a degradao e
reduzindo a hidrofobicidade da protena (85)
7.1. Restrio Diettica

O tratamento com base na dieta pobre em fenilalanina permite o controlo dos nveis deste
aminocido no sangue a fim de prevenir os danos neurolgicos e, consequentemente,
melhorar o desempenho psicolgico e neurolgico e (86), uma vez que se sabe que as
manifestaes clnicas caractersticas, como a deficincia mental e intelectual na
fenilcetonria, so devido acumulao de fenilalanina ou um dos seus metabolitos (2, 87).
213
Tratamento
No entanto, antes de iniciar o tratamento, aconselhado que a hiptese de deficincia em

tetra-hidrobiopterina seja excluda.
O tratamento ptimo deve ser: iniciado o mais cedo possvel aps o nascimento; mantido
para o resto da vida mesmo durante a concepo e gravidez em mulheres fenilcetonricas;
restrio do consumo de fenilalanina a pequenas quantidades, de maneira a manter os seus
nveis no sangue o mais perto possvel do normal, mas o suficiente para garantir a normal
sntese proteica (a restrio excessiva pode comprometer o bom desenvolvimento e
crescimento) (1, 88). A altura correcta para iniciar a dieta ainda no de consenso geral mas
alguns profissionais concordam que a dieta deve ser iniciada ao fim de 7-10 dias de vida para
recm-nascidos que apresentem nveis de fenilalanina superiores a 10 mg/dL (1). A
importncia do seguimento da dieta para o resto da vida deve-se ao facto de, a sua
interrupo, conduzir deteriorao na capacidade de aprendizagem e concentrao,
resultante de um desenvolvimento de doena neurodegenerativa da matria branca e, no caso
das grvidas com PKU, teratognese com deficincia no desenvolvimento fetal, microcefalia,
atraso mental e doena cardaca congnita, designado sndrome de PKU materna (como
discutido anteriormente) (13, 87). A restrio diettica inicia-se com pequenas quantidades de
fenilalanina proveniente do leite materno ou de frmulas comercializadas adequadas (42). Em
crianas mais velhas o consumo de protena dirio calculado, dependendo das concentraes
de fenilalanina no plasma e o controlo metablico conseguido atravs da ingesto de
pequenas quantidades de fenilalanina atravs do consumo de comidas medicinais, fontes de
protenas medicinais, produtos modificados de baixo teor proteico bem como de vegetais e
frutas (pobres em fenilalanina) (1, 89). A monitorizao feita atravs de determinaes
peridicas de fenilalanina no sangue juntamente com uma anlise do consumo e estado
nutricional (1).
A tolerncia fenilalanina (200-500 mg/dia) tem uma variao quer interindividual quer
intrafamiliar, ou seja, doentes com o mesmo gentipo mutante de PAH apresentam tolerncias
diferentes, mesmo dentro da mesma famlia, o que dificulta o tratamento (45). Isto pode
dever-se influncia do estado metablico e de sade de cada doente. O exerccio fsico,
crescimento, gravidez e infeces so exemplos de factores que podem alterar as necessidades
de fenilalanina pelo que, a dieta deve ser calibrada para cada doente de modo a que: os
metabolitos de fenilalanina no atinjam nveis txicos e; o consumo de outros aminocidos
seja suficiente para as necessidades metablicas do doente.
Os valores ptimos de fenilalanina no sangue ainda no so consensuais. A poltica
britnica, por exemplo recomenda valores de fenilalanina no sangue de 2-6 mg/dL para
214
Tratamento
crianas (1). Estes so tambm os valores recomendados para crianas menores de 12 anos
nas clnicas dos Estados Unidos, sendo recomendado os valores de 2-10 mg/dL para pessoas
com idade superior aos 12 anos. Por outro lado, o German Working Group for Metabolic
Diseases recomenda que os valores de fenilalanina no sangue devem ser mantidos no
intervalo de 0,7-4 mg/dL at aos 10 anos, 0,7-15 mg/dL para idades compreendidas entre os
10 e 15 anos e 0,7-20mg/dL para pessoas maiores de 15 anos (1).
A composio da dieta sofreu poucas alteraes desde a sua introduo na dcada de 50.
Consiste numa dieta pobre em protenas suplementada com uma mistura de aminocidos, sem
fenilalanina, minerais, vitaminas e outros nutrientes (1). Para os doentes fenilcetonricos,
alimentos como leite, produtos lcteos, carne, ovos, trigo, feijo, milho e lentilhas so
proibidos. O leite materno, frutas e vegetais devem ser consumidos controladamente (1, 9). A
dieta extremamente restritiva e difcil de manter especialmente, na adolescncia e vida
adulta (9, 90). No incio da adolescncia, o cumprimento da dieta torna-se complicado devido
a um menor controlo parental, e ao surgimento de ocasies sociais, em que os doentes
fenilcetonricos esto mais expostos a comidas proibidas e por isso a tentao maior (9).
Alm disso, fazer as refeies na escola pode implicar descriminao por parte dos colegas
por causa da dieta e das comidas proibidas. Isto aliado ao paladar desagradvel da maior parte
das comidas leva ao comprometimento da qualidade de vida e a adeso dieta diminui com a
idade do doente (89). Apesar dos esforos a nvel clnico para encorajar a aceitao do
tratamento, ainda existem poucas tentativas para avaliar os efeitos sociais de tal tratamento e,
no final, depende do prprio indivduo, a adeso dieta de acordo com a sua percepo dos
aspectos positivos e negativos relacionados com o cumprimento da mesma (13). Assim, a
motivao pode ser o factor determinante na adeso dieta e pode ser adquirida atravs de
programas coordenados por equipas mdicas, que impliquem uma formao, a fim de
promover uma melhor compreenso da doena, as desvantagens do descontrolo ou
interrupo da dieta e conhecimento de novas opes teraputicas (9, 13). Como j referido, o
controlo frequente de fenilalanina e a comunicao dos resultados podem ser uma maneira de
encorajar o seguimento da dieta (13). O apoio na dieta como, por exemplo, dar a conhecer
comidas alternativas de baixo contedo proteico ou receitas alternativas de acordo com a
gastronomia local podem ser solues viveis para a descriminao social a que os doentes
esto sujeitos. Por fim, essencial assistncia financeira e apoio psicolgico tanto para os
doentes como para as prprias famlias a fim de encorajar uma melhor aceitao do
diagnstico de PKU.
215
Tratamento
Outro problema inerente a este tratamento o risco de deficincia nutricional em

aminocidos essenciais, colesterol, cidos gordos e distrbios no metabolismo dos folatos (28,
89, 91). Este problema tem sido contornado atravs do consumo de substituintes proteicos,
ricos em aminocidos e nos nutrientes deficitrios (14, 92, 93). Apesar de, inicialmente, estes
substituintes terem um paladar desagradvel e terem de ser consumidos em grandes
quantidades, essas caractersticas tm vindo a ser melhoradas nos ltimos anos. Estes
substituintes proteicos so, maioritariamente, indicados para doentes fenilcetonricos adultos
e existem principalmente em forma de pasta ou gel que deve ser tomada juntamente com gua
ou sumo (92). Como exemplo de substituintes proteicos temos as saquetas PKU Gel (Figura
7) e PKU Express (Figura 8), comercializadas pela Vitaflo (94). Ambos os produtos so de
baixo volume, encontram-se disponveis em vrios sabores e contm vitaminas, minerais,
aminocidos no essenciais e baixo teor em hidratos de carbono. (92).
Figura 66 Saqueta de PKU Express. Fonte: (94)

Figura 65 Saqueta de PKU gel. Fonte: (94)
Apesar do grande nmero de solues disponveis para melhorar a qualidade de vida do

doente, a interrupo da dieta e desmotivao em retom-la continua a ser recorrente, o que
conduziu a uma emergente investigao de terapias alternativas, como ser discutido
seguidamente.
7.2. Terapia com BH4

Nos ltimos 30 anos, tm surgido estudos que demonstraram ser possvel aumentar a
tolerncia fenilalanina, no s em doentes com fenilcetonria moderada, como tambm
severa, aps a administrao do cofactor tetra-hidoxibiopterina BH4 (95-98). No entanto,
estudos demonstraram que o fentipo de fenilcetonria severa apenas apresenta resposta
216
Tratamento
positiva administrao de BH4, caso o doente possua pelo menos uma mutao moderada
que respondero (95, 96).
A administrao de BH4 promove uma resposta positiva contnua neste subgrupo de
doentes permitindo a eliminao de dieta como tratamento ou uma diminuio na restrio
diettica, dependendo do seu gentipo (95-97, 99). Os mecanismos inerentes a esta resposta
positiva parecem ser: estimunar os alelos variantes que apresentam cinticas que afectam a
ligao de BH4 enzima PAH e; o cofactor actuar como chaperone, evitando o misfolding da
PAH mutante e a sua degradao proteoltica, mantendo a enzima numa configurao activa
(100-103)
A
descoberta
desta
caracterstica
farmacolgica
incentivou
investigao
desenvolvimento de frmacos com base numa forma sinttica de BH4, dicloridrato de

sapropterina (16, 99, 104, 105). Um dos exemplos desses frmacos o Kuvan, comercializado
pela BioMarin Corporation e pela Merck-Serono (106), aprovado recentemente pela FDA e
Comisso (105, 107, 108). O dicloridrato de sapropterina (Figura 9) a verso sinttica do
cofactor tetrahidrobiopterina (BH4). Como j referido, para os indivduos, como doentes BH4responsive, a terapia com dicloridrato de sapropterina permite melhorar o controlo e at
mesmo eliminar a necessidade de restrio diettica em indivduos com formas muito
moderadas de hiperfenilalaninmia, tornando-se assim uma alternativa dieta vivel e
aliciante para muitos doentes. O Kuvan comercializado em embalagens de comprimidos de
100 mg que podem ser tomados directamente ou dissolvidos em gua (105, 106). Apenas
doentes com idade igual ou superior a 4 anos e com resposta positiva para o teste de
sobrecarga em BH4 que podero tomar Kuvan (97, 107). O tempo de semi-vida mdio da
sapropterina em doentes fenilcetonricos de 6,7 horas e estudos indicam que excretada na
urina (105).
Figura 67 Dicloridrato de sapropterina. Fonte: (105)
217
Tratamento
Apesar de a introduo deste frmaco no uso clnico representar uma grande evoluo no
tratamento da fenilcetonria, no acessvel a todos os doentes devido aos seus custos
elevados. O custo da terapia diria com dicloridrato de sapropterina na dose de 20mg/kg/dia,
nos EUA, de 100,000$ a 150,000$ por ano, enquanto a dieta de 15,000$ a 20,000$ por ano
(105).
7.3. Terapia de Substituio Enzimtica

A enzima fenilalanina amnia liase (PAL) (EC 4.3.1.5) tem sido investigada nas ultimas
dcadas como potencial enzima para terapia de substituio enzimtica (109-111),
constituindo outra alternativa teraputica da fenilcetonria. A PAL, com origem em
bactrias ou leveduras, no necessita de cofactor e provou ser capaz de metabolizar a
fenilalanina num derivado no txico, o cido trans-cinmico e numa pequena quantidade de
amnia (Figura 10). A enzima degrada a fenilalanina no lmen intestinal prevenindo a sua
absoro.
Figura 68 Degradao da fenilalanina. Reaco catalisadapor: (A) Fenilalanina Hidroxilase (PAH) e (B) Fenilalanina
amnia liase. Fonte: (111)
No entanto foram observados trs principais problemas na utilizao de PAL (112, 113):
necessidade de grande quantidade de PAL purificada com elevada actividade especfica; por
ser uma enzima tem de ser bem tolerada pelo organismo dos doentes fenilcetonricos pois a
administrao repetida pode conduzir produo de anticorpos contra PAL levando
eliminao da sua actividade cataltica e a reaces alrgicas; a enzima tem de ser estvel em
circulao para assegurar os efeitos teraputicos por um longo perodo de tempo.
Muitas foram as vias estudadas e propostas para a administrao de PAL a doentes
fenilcetonricos a fim de evitar os problemas acima descritos. Na dcada de 80, foi testada a
218
Tratamento
administrao de PAL a doentes fenilcetonricos por dois mtodos: colocao de um reactor

ligado a circulao extracorprea e ingesto oral de cpsulas de revestimento entrico (29).
Apesar de os estudos terem sido breves e de curto mbito foi possvel observar uma queda
modesta nos nveis plasmticos de fenilalanina. Sarkissian et al. estudou o uso de enzima
recombinante a partir de R. toruloides com o objectivo de diminuir os custos e aumentar a
biodisponibilidade da enzima (114). Recentemente a PEGilao (acoplamento covalente de
molculas de polietilenoglicol (PEG) protena de interesse) de PAL tornou-se uma via
vivel para eliminar a imunogenecidade da molcula e torn-la farmacologicamente vivel
(114-116). PEG-PAL mostrou ser uma molcula imunogenicamente inactiva, promovendo
uma reduo de fenilalanina 16 vezes maior que a PAL nativa, devido sua alta estabilidade
em circulao e com um tempo de semi-vida maior (112, 114, 115). O mecanismo reside no
facto de a pegilao mascarar os epitopos imunognicos de PAL e, consequentemente,
diminuir a resposta imunolgica (117).
Alm da PAL, parece ser possvel a terapia de substituio enzimtica com PAH. Gamez et
al. Relatou vrias tentativas em produzir uma forma estvel e no imunognica da PAH vivel
para a terapia de substituio enzimtica (115). Apesar de o uso de PAH em terapia de
substituio enzimtica implicar a administrao do cofactor BH4, a PAH apresenta grandes
vantagens, como sejam a estabilidade aps a sua pegilao e o facto da suplementao de
tirosina ser dispensvel.
Os avanos na terapia de substituio enzimtica tm sido grandes. No entanto, ainda
existem problemas por contornar relacionados com a estabilidade das enzimas, consistncia
na resposta e respostas imunolgicas no desejadas.
7.4. Terapia com Aminocidos Neutros Grandes

Como discutido anteriormente, um dos mecanismos propostos para a deteriorao neuronal
na PKU a competio entre a fenilalanina e outros grandes aminocidos neutros (Large
Neutral Amino Acid - LNAA) para o transportador de aminocidos do tipo L (118).
Na fenilcetonria, a fenilalanina plasmtica encontra-se em muito maior quantidade que os
outros aminocidos neutros pelo que pode impedir a ligao destes ao transportador e
atravessar a barreira hemato-enceflica (118).
Os LNAA incluem tirosina, triptofano, treonina, metionina, valina, isoleucina, leucina e
histidina (119). Nos indivduos saudveis todos, com excepo da tirosina, so aminocidos
essenciais. No entanto, como j referido, em indivduos fenilcetonricos, a tirosina torna-se
219
Tratamento
um aminocido essencial. O facto de estudos terem observado que alguns doentes

adolescentes em dieta apresentavam nveis reduzidos dos neurotransmissores serotonina e
dopamina (120), cujos precursores so tirosina e triptofano, conduziu investigao do uso de
LNAA no tratamento da PKU. Constatou-se ser possvel bloquear o influxo de fenilalanina
atravs da barreira hemato-enceflica, mesmo com concentraes plasmticas superiores a
1000umol/L, atravs da suplementao de LNAA (121, 122). O consumo de LNAA reduz os
nveis de fenilalanina, no s no crebro como tambm no sangue (123, 124), apesar de
alguns autores no terem referido esse efeito (121, 122). Assim, os objectivos do tratamento
com LNAA so: diminuio de concentraes de fenilalanina no crebro (122), no sangue
(124) e aumentar a sntese de neurotransmissores no crebro (125) a fim de evitar danos
neurolgicos.
A suplementao de LNAA permite uma dieta com menor restrio e por isso tem a
vantagem de possibilitar que os doentes mantenham uma vida socialmente activa com o
normal acesso a actividades como a escola, trabalho, desportos e frias. Consequentemente, a
adeso a este tratamento maior que restrio diettica simples.
Ao contrrio da terapia com BH4, os LNAA diminuem as concentraes plasmticas de
fenilalanina em todos os doentes fenilcetonricos (123). A terapia com LNAA demonstrou
assim ser uma nova opo de tratamento de fenilcetonria quando o tratamento de rotina com
comidas especializadas de baixo teor proteico no bem sucedido em diminuir os nveis de
fenilalanina no sangue. No entanto, alguns autores defendem que o suplemento no um
substituto da dieta mas sim um complemento (124) e que, apesar de a suplementao reduzir
os nveis de fenilalanina no sangue, a restrio diettica continua a ser a melhor interveno
para crianas a fim de evitar futuros danos neurolgicos (125).
Como exemplos de LNAA comercializados existe os comprimidos PreKUnil e NeoPhe da
Solace Nutrition (126). Estes comprimidos sem fenilalanina, so suplementados com
vitaminas B12 e B6 e esto indicados para indivduos fenilcetonricos com idade superior aos
8 anos e podem ser tomados por indivduos no tratados ou diagnosticados tardiamente. No
devem ser usados durante a gravidez. PreKUnil e NeoPhe permitem assim uma dieta mais
relaxada com consumo moderado de comida natural reduzindo o consumo de produtos
modificados de baixo teor proteico e, consequentemente, os custos inerentes a estes (126).
220
Tratamento
7.5. Terapia Gnica

semelhana do que acontece com outras doenas genticas, tambm para a PKU a
terapia gnica tem sido alvo de investigao. A terapia gnica, no caso da PKU, consiste na
incorporao de um gene funcional de PAH no genoma das clulas hepticas por ser o local
de expresso da fenilalanina hidroxilase.
Para que esta metodologia seja bem sucedida necessrio: um clone de cDNA que produza
uma protena funcional (127); vectores que permitam uma transferncia eficiente desse cDNA
para as clulas alvo bem como a sua integrao no genoma molecular (128-130); e um
modelo animal que permita testar a sua eficincia (26, 131). O modelo animal foi conseguido
atravs de mutagnese qumica de um ratinho com o agente alquilante N-etil-N-nitrososurea
(ENU) (26). O resultado foi um ratinho hiperfenilalaninmico com uma mutao missense
(F263S, designada de Pahenu2. Consequentemente, o ratinho PAHenu2 tem muitas
caractersticas fenotpicas comuns fenilcetonria humana, nomeadamente, atraso no
crescimento, permetro da cabea menor que o normal, distrbios comportamentais e PKU
materna (26, 131).
O desenvolvimento do mtodo mais eficaz para a transferncia gnica para o tratamento de
PKU tem sido a prioridade. No entanto, o desenvolvimento de resposta imunitria aos
vectores utilizados na transferncia de cDNA para as clulas alvo e a dificuldade da sua
integrao no genoma nuclear e uma expresso gnica sustentada tm sido um obstculo para
o avano desta terapia (129, 132). Nos ltimos anos, muitos tm sido os esforos para
ultrapassar esses obstculos e a expresso do cDNA de PAH j foi possvel em muitas
culturas de clulas de mamferos. Peng et al conseguiu infectar hepatcitos de ratinhos
infectados com retrovrus permitindo a expresso cDNA de PAH humana nestas clulas
(133). Harding et al mostrou ser possvel a expresso da PAH humana, com o auxlio do
promotor de creatina cinase do msculo, em clulas do msculo cardaco e esqueltico de
ratinhos mas no em clulas do fgado e dos rins (134). A expresso do gene PAH na medula
ssea de ratinhos fenilcetonricos, apesar de bem sucedida a nvel molecular, no teve
qualquer efeito no fentipo metablico (135). Cristiano et al. usou adenovrus recombinantes
como vectores e conseguiu restabelecer a actividade heptica de PAH (10-80%) e normalizar
os nveis plasmticos de fenilalanina em ratinhos transgnicos com deficincia em PAH (129,
130). A integrao nem sempre estvel, a expresso transitria e a readministrao do
vector exprimindo o cDNA da PAH parece ser inactivada por uma resposta imunitria ao
adenovrus. Os vectores adenovirais foram modificados para diminuir ou eliminar a expresso
221
Tratamento
dos genes adenovirais responsveis por promover uma resposta imunitria mediada por
linfcitos T (129).
Muitos foram os estudos com vectores virais do tipo adenovrus recombinantes
(recombinant adeno-associated viral rAAV) (135-137). Estes vectores mostraram ser
promissores por possibilitarem a reconstituio da actividade da PAH heptica com
reconstituio do fentipo normal em ratinhos PKUenu2, incluindo reduo da fenilalanina
plasmtica expresso do gene e uma resposta teraputica prolongada (mais de 40 dias) (136),
melhorias
neuropatolgicas
(138),
melhorias
no
comportamento
correco
da
hipopigmentao (136).
A terapia gnica assim um tratamento promissor para a PKU, ainda que com muitos
obstculos relativamente integrao e expresso gnica, por ultrapassar.
222
Fenilcetonria em Portugal
8. FENILCETONRIA EM PORTUGAL
Em Portugal, o rastreio neonatal iniciou-se em 1979 pelo Programa Nacional de
Diagnstico Precoce da PKU, por iniciativa conjunta do Ministrio da Sade e do Instituto de
Gentica Mdica para a PKU. Dois anos mais tarde, inicia-se o rastreio simultneo do
Hipotiroidismo Congnito, o primeiro alargamento do rastreio neonatal (139). Aps
divulgao dos objectivos do rastreio e discusso do modelo organizativo proposto, os
distritos de Porto, Braga e Funchal foram os primeiros a apresentar taas de cobertura
significativas. Em 1986 a taxa de cobertura atingiu os 85%.
Em 1987, a Faculdade de Farmcia de Lisboa iniciou o estudo de excluso de PKU
maligna atravs do perfil de metabolitos pternicos e da actividade de DHPR e, no ano
seguinte, o Ministrio da Sade aprovou a comparticipao no custo dos alimentos
hipoproteicos. Em 1992, um milho de crianas tinha sido rastreado e em 1993, foi criada a
Associao Portuguesa de Fenilcetonria (APOFEN). A APOFEN foi criada com o objectivo
de implementar um melhor relacionamento dos pais e doentes PKU portugueses com os dos
outros pases europeus.
O rastreio em Portugal efectuado atravs do sangue colhido por picada no p,
actualmente entre o 3 e o 6 dia, para uma ficha com um papel de filtro adequado. Esta
colheita de sangue pode ser efectuada nos vrios Centros de Sade do pas. Desde 2005, o
rastreio realizado apenas por espectrometria de massa em Tandem (MS/MS) (140).
Presentemente, o rastreio identifica 25 doenas: o Hipotiroidismo Congnito e 24 Doenas
Hereditrias do Metabolismo, das quais 16 ligadas ao metabolismo das protenas (140).
O rastreio em Portugal voluntrio e abrange actualmente cerca de 99% da populao,
com um tempo mdio de inicio de tratamento de 11,2 dias aps o nascimento (141). Em 2009,
a prevalncia para a PKU em Portugal foi de 1/16.635 com o rastreio de 6 novos casos em
99.809 recm-nascidos rastreados. Desde o incio do programa at final de 2009 foram
rastreados 3.003.159 recm-nascidos, tendo sido detectados cerca de 300 casos de PKU e
HPA. A prevalncia em Portugal, desde o inicio do Diagnstico de Precoce at ao final de
2009, foi de 1/10.960 (142).
Na populao Portuguesa, a mutao mais frequente a IVS10nt-11G>A (143), sendo o
que acontece em todos os pases da orla mediterrnica. Seguidamente, a segunda mutao
com maior expresso na nossa populao a R261Q (143), sendo uma das mais prevalentes a
nvel mundial. Com igual incidncia, seguem-se as mutaes R270K e V388M e a fechar o
grupo das mutaes mais frequentes na populao Portuguesa temos a I65T, sendo uma das
223
Fenilcetonria em Portugal
cinco mais prevalentes mundialmente e que origina fentipos desde formas clssicas s suave
(143).
Um estudo com 83 doentes fenilcetonricos do sul de Portugal identificou 34 mutaes,
sendo os resultados semelhantes aos descritos anteriormente: IVS10nt-11G<A (14,6%),
V388M (10,8%), R261Q (8,2%) e R270K (7,6%) (144). Das mutaes identificadas, com
excepo de R270K, todas tinham sido descritas noutras populaes. A mutao R270K tinha
apenas sido descrita nos Estados Unidos em indivduos com ascendncia Portuguesa (143,
144).
Cerca de metade das mutaes identificadas na populao do sul de Portugal pertencem a
um grupo de 70 identificadas em doentes BH4 responsive, ou seja, respondem positivamente
a uma terapia com BH4. Assim, Rivera et al concluiu que cerca de 30-35% dos doentes
fenilcetonricos do sul de Portugal podem ser tratados com BH4 em combinao com uma
dieta menos restrita ou, eventualmente, em monoterapia, contribuindo para uma melhoria na
qualidade de vida dos doentes (144).
224
Concluso
9. CONCLUSO
A fenilcetonria um erro metablico hereditrio de grande importncia uma vez que
permitiu uma melhor compreenso e identificao dos componentes genmicos inerentes
sade e doena e impulsionou a investigao relacionada com outros erros do metabolismo.
A sua descoberta h 70 anos permitiu fazer a ligao entre a doena metablica e o atraso
intelectual e a investigao que surgiu aps a sua descoberta permitiu demonstrar o quanto um
tratamento, com base numa restrio em fenilalanina, importante para que os indivduos
afectados pudessem ter uma vida relativamente normal, ausente de sintomas clnicos.
O ensaio de inibio bacteriana criado por Guthrie rapidamente conduziu ao
desenvolvimento de programas de rastreio neonatal aceites e implementados a nvel mundial.
Presentemente, encontra-se em investigao a possvel implementao do rastreio pr-natal
com base na anlise de RFLPs, que permitir a deteco precisa de portadores de PKU e
possibilitar que famlias em risco tenham conhecimento do diagnstico pr-natal de
gravidezes futuras.
O actual rastreio neonatal da PKU, a implementao precoce de uma dieta restritiva em
fenilalanina e a possibilidade de evitar os danos cerebrais caractersticos da doena tm sido
um grande sucesso. No entanto, as dificuldades em aderir a uma dieta rigorosa para a vida e a
presena de dfices neurolgicos, apesar do tratamento, fizeram com que a busca de outros
mtodos teraputicos fosse indispensvel.
Nos ltimos anos, verificou-se um crescimento exponencial na investigao de novas
abordagens teraputicas, medida que os conhecimentos sobre a patognese da doena foram
aumentando. Actualmente, j existem muitas alternativas restrio diettica mas, a sua
aplicao clnica tem encontrado muitos obstculos. No caso da terapia de substituio
enzimtica, ainda h muito que investigar de forma a melhorar a estabilidade das enzimas
bem como aumentar a tolerncia do organismo s mesmas. Por outro lado, a terapia com
LNAA vista como um suplemento e no uma substituio total da dieta restritiva. A terapia
gnica, apesar de bastante promissora, um tratamento ainda com muitas caractersticas por
melhorar, uma vez que se tem sentido dificuldades em produzir vectores que permitam uma
transferncia eficiente para as clulas alvo bem como a sua integrao eficaz no genoma
molecular. O uso da tetra-hidrobiopterina j se encontra clinicamente disponvel mas no
possvel a sua aplicao em todos os doentes fenilcetonricos uma vez que depende do
gentipo do doente.
225
Concluso
Muitas questes sobre as terapias existentes continuam por ser respondidas e muito
trabalho tem ainda de ser feito antes das novas tecnologias serem aplicadas no contexto
clnico. De referir ainda que o sucesso do tratamento depende no s da sua eficcia, como
tambm da aceitao pelo prprio indivduo, pelos profissionais de sade responsveis pelo
diagnstico da PKU, pediatras, nutricionistas e profissionais de sade mental, encarregados
pelo supervisionamento da terapia e de um melhor aconselhamento do doente e famlia
envolvente.
Assim, no futuro, aps uma melhor compreenso das bases moleculares, bioqumicas e
genticas da PKU, vrias terapias estaro disponveis permitindo um tratamento mais
personalizado, dependendo do gentipo de cada indivduo e de outras condies como a idade
e a gravidez.
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UNIVERSIDADE DE LISBOA

Catarina Carapucinha Cabeadas

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS

Relatrio e monografia apresentados Faculdade

Catarina Carapucinha Cabeadas

MESTRADO EM ANLISES CLNICAS

Preparao das amostras ................................................................................ 5

2. BIOQUMICA CLNICA .................................................................................................... 7

Interesse Clnico .......................................................................................... 16

Sector de Imunoqumica .............................................................................. 36

Sector dos Marcadores tumorais .................................................................. 62

Deteco Directa e Indirecta dos Agentes Virais .......................................... 80

Controlo de qualidade interno ...................................................................... 93

Avaliao externa da qualidade.................................................................. 109

INTRODUO CLNICA DE DIAGNSTICOS DR. FERNANDO TEIXEIRA ......................... 116

Objectivo ................................................................................................... 117

Introduo ................................................................................................. 117

Laboratrio de Microbiologia .................................................................... 118

Produtos Biolgicos................................................................................... 130

Controlo de qualidade ................................................................................ 186

7. CONCLUSO .............................................................................................................. 195

Introduo ao Instituto Portugus de Oncologia Francisco Gentil

INTRODUO AO INSTITUTO PORTUGUS DE ONCOLOGIA FRANCISCO

Seleccionar uma veia que seja facilmente palpvel;

No seleccionar o brao do lado de uma mastectomia;

Nunca puncionar uma fstula;

No seleccionar um local do brao onde o doente foi submetido a uma infuso

No seleccionar um local com hematoma, edema ou contuso;

No seleccionar um local com mltiplas punes.

Aps desinfectar o local da puno com lcool a 70 e com o garrote colocado,

1.1.2. Colheita de urina

Para que serve

urina Primeira urina da manh,

da manh (urina colhida

noite Assegura um maior tempo da

deteco de protenas e analitos

hora do dia para frasco

til para testes de diagnstico de

Rejeitar toda a 1. urina da

apropriado, toda a urina, Para amostra representativa de um

por exemplo, das 3 horas analito.

manh e anotar a hora desta Semelhante anterior. Usada para

1.1.3. Colheita de outros lquidos biolgicos

1.2. Preparao das amostras

Avaliao de critrios de critrios de aceitao. Caso se verifique um dos

de critrios de rejeio (acima descritos), a amostra dada

maneira a solicitar nova colheita.

Aps entrada os produtos so centrifugados e/ou

minutos aps formao completa do cogulo. Os tubos

Rejeio aps centrifugao

o grau de hemlise apresentado e dos parmetros a

As amostras destinadas central automtica so

Conservaes das amostras Aps as 16h, as amostras destinadas aos restantes

diferentes laboratrios so conservadas na central automtica. As

laboratrios aps as 16h00, amostras

em caso de avaria dos processadas at as 20h e aps esta hora apenas so

so dos equipamentos ou no caso de anlise dos

Quimioluminescncia (CMIA) e Imunoensaio de Fluorescncia Polarizada (FPIA).

Soro, plasma e urina

Soro, plasma e urina

Soro, plasma e urina

Soro, plasma e urina

Enzimtica, colesterol esterase