31/07/2013

VETORES DE CLONAGEM
PARA EUCARIOTOS
Disciplina: Biotecnologia Farmacutica

VETORES DE CLONAGEM
Vetores para leveduras e outros fungos
Vetores para plantas superiores
Vetores para animais

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VETORES PARA LEVEDURAS E

OUTROS FUNGOS

A maioria das estirpes de S. cerevisae tem um plasmdeo natural,

o plasmdeo 2m que apresenta algumas caractersticas:

Pequeno (6Kbp).
70-200 cpias por clula.
Tem origem de replicao.

No tem marca de seleo

um problema.

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As marcas de seleo introduzidas no plasmdeo 2m

so geralmente marcas metablicas.

YEps Plasmdeos epissomais de

levedura
YEps so plasmdeos derivados do 2m e so do tipo vaivm pois replicam tanto em E. coli como em S. cerevisae.
Um exemplo deste tipo de plasmdeos o YEp13:
- Tem origem de replicao do plasmdeo 2m permite replicao em
levedura.
- Tem gene LEU2 permite seleo de recombinantes em meio mnimo de
leucina (seleo em levedura).
- Tem sequncia de pBR322
permite replicao e seleo
em E. coli.
-20-50 cpias.
- um vetor de transferncia
transferncia.

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YACs Cromossomos artificiais de

levedura
YACs so utilizados para clonar longos (at 1400Kbp)
fragmentos de DNA.
Tm a estrutura de um cromossomo e, portanto,
apresentam 3 componentes essenciais:
Centrmero: necessrio correta
separao do cromossomo durante a
diviso celular.
Telmeros: para replicao das
extremidades do cromossomo e
proteo contra exonucleases.
Origens de replicao: vrias ao
longo do cromossomo permitem a
replicao do DNA.

Colnias
brancas so
recombinantes

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VETORES PARA PLANTAS

SUPERIORES

Trs tipos de Vetores tm sido empregados:

1 Vetores baseados nos plasmdeos que ocorrem

normalmente em Agrobacterium;
2 - Transferncia gnica direta utilizando diversos
tipos de DNA plasmidial;

3 Vetores baseados nos vrus de plantas.

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Vetores baseados nos plasmdeos que

ocorrem normalmente em

Agrobacterium

Os vetores de clonagem mais usados so baseados no

Ti, plasmdeo natural de Agrobacterium tumefaciens
tumefaciens.
Menor Engenheiro gentico da Natureza.
- encontrado do Solo;
- Causador da doena do tumor
da Galha em muitas espcies de
plantas;
- A capacidade de causar a
doena est associada a
presena do Plasmdeo Ti das
clulas bacterianas;
- O A. tumefaciens
geneticamente programa as
clulas da planta para seu
prprio benefcio.
 Percebe-se ento que o
Plasmdeo Ti poderia ser
utilizado para introduzir novos
genes no interior de clulas
vegetais.

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Produo de plantas transformadas com o

Plasmdeo Ti
 Se a A. tumefaciens
com
plasmdeo
Ti
modificado foi inserido
pelo ferimento no caule.
Somente as clulas do
tumor
da
galha
resultante iro possuir o
gene clonado.

- Plasmdeo de Agrobacterium rhyzogenes;

- Semelhante ao Ti;

- A diferena est no T-DNA;

- O plasmdeo Ri no resulta em um tumor de Galha, mas na
doena da raiz Cabeluda.
Limitaes de A.tumefaciens e A. rhizogenes infectam
apenas dicotiledneas

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Transferncia gnica direta

utilizando diversos tipos de DNA
plasmidial

BIOBALSTICA

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Vetores baseados nos vrus de plantas

Caulimovrus Vrus do
mosaico da couve flor
(CaMV)

- Experimentos restritos a faixa

de hospedeiros deste vrus

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VETORES PARA ANIMAIS

Vetores de clonagem para

animais
- Existem dois sistemas de clonagens para Animais:
- Vetores de Clonagem para Insetos;

- Vetores de Clonagem para Mamferos.

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Clonagem em Insetos
Moscas-das-frutas:

Drosophila melanogaster

- Como nenhum plasmdeo conhecido na Drosophila,

a clonagem obtida, atravs de um transposon,
chamado elemento P colocado dentro de um
plasmdeo.

Ou vetores de clonagem baseados em Vrus de Insetos:

- Vetores Virais no so desenvolvidos para a clonagem
gnica em Drosophila;
- Outros insetos possuem como vetores de clonagem o vrus
bacolovrus;
- A utilizao dos vetores destes vrus est na produo de
protenas recombinantes.

Clonagem em Mamferos
 Realizada por 3 Razes:
1 Para obteno de um Gene-Nocaute;
2 Para produo de Protena Recombinante;
3 Na Terapia Gnica

Atualmente, os retrovrus so os vetores mais utilizados

para a clonagem de genes em clulas de mamferos.

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Clonagem gnica sem um vetor

- Realizada atravs de microinjeo de plasmdeos
bacterianos, dentro do ncleo das clulas de
mamferos;

- mais satisfatrio que a utilizao de um vetor

Viral, pois evita a possibilidade de que o DNA viral
infecte as clulas e promova mutaes.

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... E continua na prxima aula !!!

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