Validation d'une mthode analytique

Exercices d'application avec WinNonlin

Exemple 1 : Construction d'une droite du jour et son rejet en cas
d'inadquation des rsultats obtenus par talonnage
inverse (back calculation)
Exemple 2 : Construction d'une droite du jour et acceptation sur la
base des rsultats obtenus par talonnage inverse
Exemple 3 : test de linarit d'une droite (test de lack-of-fit) Test de
la composante quadratique (test raliss lors de la
validation initiale)
Exemple 4 Essai de rptabilit et de reproductibilit : calculs
effectuer la main pour comprendre la dmarche
gnrale
Exemple 5 : Essai de rptabilit et de reproductibilit. Analyse
d'un essai avec trois niveaux de concentrations.

P.L. Toutain A. Bousquet-Mlou D. Concordet

Ecole Nationale Vtrinaire de Toulouse
UMR 181 de Physiopathologie et Toxicologie Exprimentales INRA/ENVT
Mai 2008

1.

EXEMPLE N1

1.1. Objectifs :
L'objectif de ce premier chapitre est de montrer
1- comment construire une droite ou une courbe d'talonnage avec WinNonlin
(WN version 5.2 ou suprieure).
2- Comment utiliser les diffrents outils statistiques disponibles sur WinNonlin
pour valuer la validit de la courbe de calibration vis--vis des objectifs
assigns une technique analytique.
Une connaissance minimale de WinNonlin est ncessaire pour raliser les
diffrents exemples.

1.2. Les donnes

Soit la gamme d'un analyte obtenue le 13/09/1993 (tableau 1.1.)
Tableau 1.1 : Concentrations en analyte et rponses chromatographiques
Concentration (g/mL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9

0.10
0.15
0.25
0.50
1.25
2.50
5.0
10
20

Rponses
chromatographiques
0.33
0.72
0.64
1.51
4.45
10.04
21.29
51.73
90.29

Le niveau de quantification (LOQ) a t fix 0.10 g/mL. Pour cette concentration,

prcision et exactitude doivent tre de 20% par rapport la valeur nominale : pour
les autres concentrations, la tolrance est de 15%.

1.3. Ouvrir ou entrer les donnes dans une feuille de WN

Ouvrir un nouveau dossier dans WinNonlin ou ouvrir le workbook de WinNonlin
contenant les donnes (fig. 1.1). Elles sont places sur 2 colonnes intitules :
concentrations et rponse.
Nous allons utiliser ces donnes pour effectuer diffrents ajustements avec une
droite simple avec ou sans pondration.
Figure 1.1 : Concentrations en analyte et rponses entres dans le workbook de WN
et correspondant au tableau 1.1
Bouton pour accder aux diffrents types de modles

Editer les colonnes en allant dans "Data" puis "column properties".

1.4. Ajustement des donnes

a)

Ajustement une droite y = ax + b sans pondration

Se placer dans le module de WinNonlin soit en allant dans "Tools", soit avec l'icne
correspondante (fig.1.1).
3

Figure 1.2 : cran daccueil pour slectionner le module d'analyse de rgression

linaire et faire "Next".

L'cran d'accueil du modle apparat, cliquer alors sur "Linear" (fig 1.3)
Figure 1.3.: cran d'accueil du module de rgression linaire aprs la slection du
modle "Linear" (modle 502)

Faire "Next" et "Finish". Apparat alors l'cran de la figure 1.4.

Figure 1.4 Pour slectionner ses variables, aller dans "Model" puis "Data Variables"
ou cliquer sur l'icne

Icne "Data variables"

Pour raliser une rgression, il convient de dclarer le nom de la variable

indpendante et de la variable dpendante. Pour cela il faut aller dans "Data
variable" soit en cliquant sur l'icne (fig. 1.5) soit en allant dans le menu Model>Data
variable puis par simple glissement, placer le vecteur "concentration" dans la bote "X
variable" et le vecteur "Response" dans la bote "Y variable" (fig.1.5).
Figure 1.5.: Ecran d'accueil de "Data variable". Les noms des variables dpendantes
(response) et indpendantes (concentration) sont placs dans les fentres ad hoc
par glisser-coller pour dclarer les variables.

X
Y

Faire OK
5

Ensuite, aller vrifier qu'aucun facteur de pondration n'est utilis en allant sur l'icne
"Model options" ou en allant dans le menu Model > Model options (fig 1.6). Dans la
fentre Model options (fig 1.6) cliquer sur "Weight" et vrifier que le programme est
configur par dfaut "uniform weighting". Cliquer sur OK. On peut donner un titre aux
futures figures, tableaux etc. en ditant le tableau qui s'ouvre en cliquant sur "Title"
(fig. 1.6). De mme on peut changer l'algorithme d'optimisation en allant dans "Linear
setting" (ici on gardera l'option "Gauss Newton" offerte par dfaut).
Figure 1.6.: cran daccueil pour slectionner des options de modlisation dont
lutilisation dun facteur de pondration (Weight)

Figure 1.7. : cran daccueil pour la gestion des facteurs de pondration ; par dfaut,
il ny a pas de pondration et la boite Pre-Selected Scheme indique "Uniform
Weighting" ce qui veut dire que le mme poids sera donn toutes les donnes

Pour excuter les calculs cliquer sur l'icne "Start modeling" ou en allant dans le
menu Model > Start modeling (fig. 1.8)
Figure 1.8. : bouton pour dmarrer les calculs

Start modeling

Aprs l'excution des calculs, apparaissent 3 feuilles intitules respectivement

"Linear workbook", "Linear text", et "Linear Chart" (fig 1.9). Pour bien visualiser ces 3
feuilles aller dans le menu Window > Cascade. Dcaler les feuilles avec le pointeur.
7

En allant dans l'onglet "Non-transposed final parameters" (fig 1.11) on peut visualiser
les rsultats avec les deux paramtres estims savoir l'ordonne l'origine =
intercept : INT = -0.414471 et la pente : Slope = 4.647302.
Figure 1.9. : cascade de fentres montrant les 3 feuilles de rsultats pour lanalyse
des donnes par rgression linaire des donnes du tableau 1.1.

Figure 1.10 : Premire fentre des tableaux de rsultats de lanalyse des donnes
du tableau 1.1 avec un modle de rgression linaire simple et sans pondration.
Les onglets situs au bas de la feuille permettent de faire dfiler les diffrents
tableaux de rsultats.

Onglets de dfilement pour les tableaux de rsultats

"Non transposed
final parameters"
donnant l'ordonne l'origine de la pente

Figure 1.11 : fentre intitule "Non transposed final parameters" donnant la valeur de
la pente (Slope= 4.6473) et de lordonne lorigine (INT=-0.4144)

Sur cette fentre sont galement donns des intervalles de confiance (CI) des
estimateurs. On peut constater que pour l'intercept, l'intervalle de confiance est de 2.778 et +1.949 ce qui veut dire que l'intercept n'est pas significativement diffrent de
0. Cela dit, il est usuel de garder l'ordonne l'origine comme variable d'ajustement
pour avoir les meilleures prdictions possibles sur l'intervalle d'interpolation.
Toujours sur cette feuille, aller l'onglet "Diagnostic" (fig. 1.12) pour avoir la valeur
du coefficient de corrlation : CORR-(Obs,pred)=0.997. On notera que le coefficient
de corrlation est trs lev mais qu'il ne prjuge en rien de la qualit de la droite de
rgression.
Figure 1.12 : fentre ouverte avec longlet Diagnostic et donnant la valeur du
cfficient de corrlation (r=0.997)

En cliquant sur l'onglet "Summary table" on pourra visualiser le tableau des valeurs
observes et des valeurs prdites correspondantes (figure 1.13). On notera aussi
que tous les poids (colonne Weight) sont gaux 1 (pas de pondration).
Figure 1.13 : fentre ouverte avec longlet Summary Table donnant les valeurs
prdites des rponses chromatographiques par le modle de rgression linaire.

Avant de travailler avec cette fentre, notamment pour faire les "Back calculations",
nous allons inspecter la feuille donnant les graphiques. Pour la faire rapparatre
faire Window > Cascade et slectionner 3-Linear Chart (fig.1.14) ou encore rduire la
feuille de rsultats pour faire apparatre les graphiques.
La premire figure qui apparat est celle des "X vs. observed Y and predicted Y" (fig.
1.15A). L'inspection visuelle de ce premier graphique plaide pour un ajustement
satisfaisant. Pourtant on doit considrer que la gamme des concentrations tait plutt
large (de 0.1 20) et que ce type de graphique est incapable de permettre de faire
un bon diagnostic de la qualit de la rgression car les grandes valeurs "crasent"
les petites valeurs. La seule faon de juger visuellement de la qualit de l'ajustement
est d'inspecter les rsidus. Pour cela cliquer sur l'onglet "X vs. weighted residual Y"
(fig 1.15B).

10

Figure 1.14: Ecran montrant comment slectionner une feuille de rsultats partir
de la cascade donne par WinNonlin

Figure 1.15A : figure montrant lajustement des donnes du tableau 1.1 par
rgression linaire ; premire vue cet ajustement parat satisfaisant.

Les onglets

11

Figure 1.15B : reprsentation des valeurs des rsiduelles en fonction des

concentrations testes (X) ; on notera la prsence de structure c'est--dire dune
rpartition des rsiduelles qui nest pas alatoire de part et dautre de la ligne
horizontale dordonne 0.

Les rsidus sont la diffrence entre les valeurs observes et les valeurs prdites par
le modle. Les rsiduelles peuvent tre ngatives ou positives et un bon ajustement
implique une alternance rgulire de rsiduelles positives et ngatives. Ici, on
remarque que les rsiduelles ne se rpartissent pas de faon alatoire autour de la
ligne horizontale d'ordonne 0. Au contraire, on a une tendance claire la
dcroissance des rsiduelles pour les concentrations allant de 0.1 6 et une
remonte des rsiduelles pour les concentrations gales 10. On dit qu'il y a de la
"structure" dans le graphique des rsiduelles. Pour mieux le visualiser on peut diter
les symboles des points en double-cliquant sur l'un des points. Cela fait apparatre
une fentre (fig. 1.16) qui permet d'diter la figure en y ajoutant une ligne (onglet
Lines) ou en changeant les symboles des points ( gauche aller dans Series cliquer
sur Series 1 > data point > markers > filled circle). Le rsultat est donn par la figure
1.17.

12

Figure 1.16 : fentre permettant dditer la figure en y ajoutant une ligne entre les
points et en changeant le symboles des points pour les rendre plus visibles.

Figure 1.17 : aprs dition ; la prsence dune ligne pour rejoindre les points des
rsiduelles facilite lindentification dune tendance dans la rpartition des rsidus

En retournant sur le tableau "Summary table" (fig 1.13) on peut voir la valeur des
rsidus. On remarquera immdiatement que les rsiduelles des 2 premires
concentrations (0.27, 0.437) sont positives alors qu'elles sont ngatives pour toutes
les autres concentrations l'exception de la concentration "10". Cela suggre dj
un mauvais ajustement.
Dans un ajustement idal, on aurait une alternance rgulire de rsiduelles positives
et ngatives.
L'inspection des rsidus suggre que l'ajustement une droite n'est pas acceptable.

13

Pour mieux se convaincre du caractre inacceptable de cette droite qui nous tait
pourtant apparue comme adquate et qui nous avait donn un cfficient de
corrlation lev (r=0.997), nous allons "recalculer" les concentrations
nominales avec la droite ajuste c'est--dire recalculer les valeurs de X avec
cette droite. On parle de "back calculation" ou encore d'talonnage inverse.
Pour cela, nous allons utiliser directement WinNonlin qui permet de faire les calculs
simplement. Si on veut utiliser la feuille "Summary Table" contenant les "Residuals" il
faut pouvoir l'diter. Pour cela il faut d'abord la dverrouiller avec la fonction "Detach"
qui est obtenu par un click droit de la souris.
Remarque cette fonction "Detach" n'est pas accessible par le menu "Edit".
Ensuite on peut grer cette feuille exactement comme une feuille EXCEL. Enlever les
colonnes inutiles avec "Delete". Ensuite, calculer les concentrations prdites par la
droite avec l'quation (fig. 1.19) :
=

=( +

Figure 1.19 : Calcul des valeurs prdites par la droite de calibration pour les
concentrations ayant servi construire la droite et biais relatif par rapport aux valeurs
nominales.

Ensuite, calculer le pourcentage de dviation c'est--dire (tableau 1.2) :

14

Deviation (%) =

[(

) (

)]

Tableau 1.2 : calcul des concentrations thoriques de la gamme de l'exemple 1.1

partir de la droite ajuste par rgression linaire et sans pondration.
Concentrations
thoriques
(mg/mL)

Rponses
chromatographiques

Concentrations
Dviation (%)
thoriques recalcules
avec les paramtres de
la droite issus du
tableau 1.1
0.10
0.33
0.160
+60
0.15
0.72
0.244
+62.7
0.25
0.64
0.226
-9.6
0.5
1.51
0.414
-17.2
1.25
4.45
1.046
-16.3
2.50
10.04
2.249
-10.04
5.0
21.29
4.670
-6.6
10
51.73
11.22
+12.2
20
90.29
19.52
-2.4
Concentration calcule = (rponse + 0.41447)/4.647
L'inspection du tableau 1.2 montre clairement que cette droite est incapable de
prdire les concentrations ayant servi construire la gamme avec une exactitude
approprie (<15%) notamment pour les plus petites concentrations pour lesquelles le
biais est de l'ordre de 60%.
Nous allons tenter d'amliorer cette droite en calculant ses paramtres avec un
facteur de pondration c'est--dire donner plus de poids aux petites concentrations
pour qu'elles "psent" davantage sur l'estimation de a et b c'est--dire la pente et
l'ordonne l'origine.

1.5. Ajustement des donnes du tableau 1.1 une droite y = aX+b

et pondration par 1/X
Pour raliser une rgression pondre avec WinNonlin, on va reprendre le mme
modle dans WinNonlin mais en prenant en compte une pondration. Pour cela
repartons dans notre feuille initiale de donnes et saisissons 2 nouvelles
colonnes une nomme 1/X et l'autre 1/X dans lesquelles on calculera les

15

valeurs de 1/X et 1/X. Nous allons utiliser les 2 vecteurs de pondration 1/X
(weight 1) et 1/X (weight 2). (Aller dans l'onglet Window > Cascade > workbook)
En reprenant le modle de rgression on va refaire tous les calculs prcdents mais
avec la pondration. Nous allons slectionner le vecteur "Weight_1" dans la cellule
"Weights on file in column".
Figure 1.20 : Fentre pour le calcul dune droite pondre avec 1/X. On doit dabord
dclarer le vecteur des poids dans la bote Weights on File in Column avec
l'ascenseur.

Pondration

Faire OK et lancer les calculs. Aller inspecter les rsultats de la nouvelle feuille dans
l'onglet "Non transposed final parameters".
Les paramtres estims avec une droite pondre par 1/X sont la pente (4.6125) et
l'ordonne l'origine (-0.2606). La figure 1.21 montre la droite de rgression
obtenue. Ici encore, la droite parat satisfaisante mais l'inspection des rsidus
suggre que cette droite obtenue avec un facteur de pondration n'est toujours pas
acceptable (fig 1.22).

16

Figure 1.21 : droite obtenue avec les donnes du tableau 1.1 ajuste par un modle
de type y = aX + b et avec une pondration de 1/X. Linspection visuelle de la figure
suggre un bon ajustement

Figure 1.22 Inspection des rsidus pondrs (weighted_residuals)

L'inspection de la figure 1.22 montre une mauvaise rpartition des rsidus pondrs.

17

Le mauvais ajustement est confirm par un calcul "back calculation" = talonnage

inverse (fig 1.23).
L'inspection du tableau montre que les concentrations calcules par talonnage
inverse sont meilleures qu'avec celles calcules avec la droite non pondre mais
les dviations restent inacceptables.
Figure 1.23 : Calcul des concentrations thoriques de la gamme de l'exemple 1.1
partir de la droite ajuste par rgression linaire avec une pondration 1/X

Nous allons reprendre tous les calculs avec une droite pondre par 1/X (fig. 1.24).
Pour cela il faut re-slectionner la feuille des donnes avec Window > workbook.
Puis dans la fentre des "Model > options" remplacer "Weight_1" par "Weight _2" et
lancer les calculs.
Les paramtres obtenus sont b = -0.0738 et a = 4.1098. Le tableau des rsidus
pondrs est donn dans la figure 1.23. La figure 1.24 donne une reprsentation
graphique des rsidus pondrs. L'inspection de la figure 1.24 montre nouveau
que la rpartition des rsidus n'est pas satisfaisante.

18

Figure 1.24. : rsidus pondrs (weighted_residuals) calculs partir de

lajustement ralis avec un facteur de pondration de 1/X2

Figure 1.25.:Inspection des rsidus pondrs (weighted_residuals) calculs partir

de l'ajustement ralis avec un facteur de pondration de 1/X

19

L'inspection du tableau de la figure 1.26 des "Back-calculations" montre que les

valeurs prdites sont meilleures que celles obtenues prcdemment mais qu'elles ne
sont pas encore satisfaisantes car les dviations de plusieurs d'entre elles dpassent
encore 20% c'est--dire la tolrance acceptable.
Aprs avoir tent les diffrents schmas de pondration, il apparat impossible
d'ajuster correctement les donnes du tableau 1.1 avec une droite pondre ou
non.
Figure 1.26. : concentrations obtenues par talonnage inverse avec la droite
obtenue avec une pondration par 1/X2 .

En fait, l'inspection des donnes brutes du tableau 1.1 montre que les
observations 2 et 3 mritent d'tre reconsidres dans la mesure o la rponse
chromatographique est plus leve avec une concentration de 0.15 (0.72)
qu'avec la concentration de 0.25 mg/mL (0.64).
Selon les recommandations internationales, deux points de la gamme peuvent tre
rejets. Lorsque les observations 2 et/ou 3 sont enleves, on peut recalculer la droite
et en valuer comme prcdemment, les performances en terme d'aptitude prvoir
les concentrations de la gamme. De mme, on peut rduire l'tendue de la gamme
en excluant les concentrations les plus leves (10 et 20 g/mL). Cela a t ralis
et aucune des droites calcules n'a t acceptable. Il est donc raliste de mettre en
20

doute les donnes brutes c'est--dire la validit les rponses obtenues pour raliser
des dosages exprimentaux.

1.6. Conclusion
Sur la base des arguments statistiques usuels, les diffrentes droites obtenues avec
ou sans pondration sont rejeter car l'exactitude des valeurs prdites sera
inacceptable vis--vis de nos objectifs analytiques.
L'analyste devra donc reconstruire une nouvelle droite.
Cet exemple nous aura permis de montrer comment on peut construire une droite
avec WinNonlin et en discuter la valeur vis--vis des objectifs analytiques.
Dans l'exemple suivant nous allons construire une droite du jour c'est--dire celle qui
est ralise en routine.

21