AISLAMIENTO DE E.

COLI Y PLSMIDOS CON

RESISTENCIA A
DIVERSOS ANTIBITICOS
OBJETIVOS.
Preparar medio nutritivo para el crecimiento de bacterias y agar mac-conkey.
Aislar, identificar y verificar si hay resistencia a la ampicilina y otros antibiticos
por el microorganismo de inters.
FUNDAMENTO TEORICO.
La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo que permite el aislamiento de
bacterias que han sufrido transformaciones genticas. En algunos casos, por ejemplo, se
utiliza cristal violeta, sales biliares, acida sdica, telurito potasio, antibiticos, etc., en la
concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados
microorganismos.
La Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia 'koli/), tambin conocida por la abreviacin de
su nombre, E. coli, es quizs el organismo procariota ms estudiado por el ser humano.
Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos
animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados,
dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore
von Escherich, bacterilogo alemn, quien la denomin Bacterium coli. Posteriormente la
taxonoma le adjudic el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.
Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican
y transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en
bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su
tamao vara desde 3 a 10 kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su
tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula. Los vectores plasmdicos
permiten clonar ligandos de DNA exgeno de hasta 4 kb ya que un tamao mayor a ste
dificulta la clonacin en estos vectores. El trmino plsmido fue presentado por primera
vez por el bilogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952.1
Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al igual
que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera de los

mismos. Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN
cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas.
En general, no contienen informacin esencial, sino que confieren ventajas al
hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo ms comn es el
de los plsmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibitico, de
manera que el plsmido nicamente supondr una ventaja en presencia de ese
antibitico.
Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el
cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el cromosoma y se sitan en
su interior, con lo cual, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el
plsmido. Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plsmidos se utilizan como vectores de clonacin en ingeniera gentica por su
capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal as como
tambin porque es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias
genticas.
Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o dos genes que les
confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay
otros mtodos de seleccin adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en
fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos
nuevos mtodos de seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologa,
debido a la fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de
antibiticos en los organismos modificados genticamente.
Resistencia a los antibiticos
Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una
ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la bacteria resistente a los
antibiticos.
Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de
replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN), lo cual habilita al ADN
para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plsmidos de la

mayora de las bacterias son circulares, pero tambin se conocen algunos lineales, los
cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayora de eucariotas.
Tipos
Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los
plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan complejos procesos de
conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a otra bacteria. Los plsmidos
no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all que ellos pueden
transferirse nicamente con la asistencia de los plsmidos conjugativos y lo hacen por
accidente. Una clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan
solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un
plsmido conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente
plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos
sobrevive en la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones vitales de los
plsmidos. Por lo tanto, los plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de
compatibilidad.
Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases principales:

Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de

conjugarse.

Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir

resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como
Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.

Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la

produccin de) colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.

Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias

inusuales como tolueno o cido saliclico.

Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.

Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales.

Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria, debido a
la divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.
Algunos

plsmidos

incluyen

un

sistema

de

adicin

Sistema

de

Muerte

Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto

un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta. Las clulas hija que retienen una

copia del plsmido sobreviven, mientras que una clula hija que falla al integrar el
plsmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo
de la clula padre. Este es un ejemplo de plsmidos como el ADN replicante.
Extraccin del ADN plasmdico
En el maxiprep se cultivan volmenes mucho ms grandes de bacterias en suspensin.
Esencialmente, este es un escalado de la preparacin mini-prep, el cual es seguido por
una purificacin adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg)
de ADN plsmido muy puro.
En los ltimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la
extraccin plasmdica a varias escalas, purezas y niveles de automatizacin.
Las bacterias resistentes en la poblacin humana
Como hemos mencionado anteriormente las resistencias bacterianas han sido
identificadas desde hace mucho tiempo, aunque quizs no tan bien la magnitud de su
impacto en salud pblica y salud animal. Si bien no hay demasiados datos en lo que
hace a resistencias en bacterias que afectan seres humanos, la mayor informacin
proviene, en forma bastante lgica, del campo hospitalario.
Un listado de las bacterias resistentes de mayor trascendencia en infecciones
hospitalarias, debera incluir a:

Estafilococos meticilino-resistentes

Enterobacter cloacae

Enterococos

Pseudomonas aeruginosa

Por su parte, en la poblacin urbana o rural, las infecciones por microorganismos

resistentes seran causadas por:

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Neisseria gonorrheae

Salmonella

Campylobacter

Clases de medios de cultivo

Medios

microorganismos.
Medios de enriquecimiento. Favorece el crecimiento de un determinado

microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto celular.

Medios selectivos. Permiten el desarrollo de un microorganismo determinado,

inhibiendo el desarrollo de otros.

Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades

generales.

En

stos

se

desarrollan

una

gran

variedad

de

de un microorganismo determinado
MATERIALES.

Tubos de ensayo.
Aza.
Discos de antibitico.
Estufas de cultivo.
Mechero.

Preparaciones a cantidades necesarias de:

Agar mac-conkey.
Agar nutritivo.
Medio de nutritivo liquido:

Extracto de levadura
Triptona y peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
csp.

5 g.
10g.
10g.
1000ml.

PROCEDIMIENTO
Para esta prctica traer una muestra que contenga

escherichia

coli especfica y

exclusivamente, ya que no nos interesa saber ni investigar e. coli en muestras x.

Colocar al frente nuestro el mechero y la muestra que contiene los
microorganismos, as como es resto del material.
Flamear el filamento del aza, hasta que alcance el rojo incandescente.
Realizar todas las operaciones en la proximidad de la llama, introduzca el aza de
la siembra a la muestra. Trasfiera el inoculo al medio de cultivo solido (medio
mac-conkey ) y siembra de zigzag sobre la superficie.
Inocular a 37 c por 24 horas o el tiempo necesario para que se desarrollen las
bacterias.
Aislamiento de identificacin.
Despus del desarrollo bacteriano en la caja Petri, transfiera una colonia con el
asa, siembre por agotamiento por estras en agar nutritivo preparado la anterior
clase prctica.

 Colocar los discos de antibitico que se les proveern, equidistantes entre s.

Incubar a 24-48 h horas a 37c.
Analizar e interpretar los resultados, como un antibiograma cualquiera.

ESQUEMA
Martes
Desinfectamos el rea de trabajo

Preparar nuestros materiales

Realizar la siembra: introducir el aza de la siembra a la muestra

Identificar la muestra

Mircoles
Colocar los discos de antibitico

Observados el desarrollo de e.coli

Jueves
Realizados las diferentes lecturas de los 3 grupos

RESULTADO

Sea identificado presencia de e. coli lo cual cambia de color, con un olor ftido y de
presencia caracterstico.
Se ha observado que hay ms sensibilidad en los antibiticos ms comnmente
conocidos.
ANTIBITICO

1 GRUPO

2 GRUPO

3 GRUPO

CRO

sensible

sensible

sensible

CIP

sensible

sensible

resistente

Nal

resistente

resistente

resistente

AMC

sensible

sensible

sensible

ERY

resistente

CONCLUSION.
Se ha realizado las respetivas siembras en el agar mac-conkey y agar nutritivo en el cual
observamos el desarrollo bacteriano en la caja Petri despus Colocamos los discos de
antibitico en el medio de cultivo y se observa mayor sensibilidad en los antibiticos
usados mas comnmente.
CUESTIONARIO.
1.- Qu componentes tiene el medio de cultivo mac-conkey?
Frmula (en gramos por litro)
Peptona
17.0
Pluripeptona
3.0
Lactosa
10.0
Mezcla de sales biliares
1.5
Cloruro de sodio
5.0
Agar
13.5
Rojo neutro
0.03
Cristal violeta
0.001
pH final: 7.1 0.2

Instrucciones
Suspender 50 g del polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar
suavemente y hervir 1 a 2 minutos
hasta disolver. Esterilizar en autoclave
a 121C durante 15 minutos.

2.- Qu diferencia hay entre el medio nutritivo lquido y el sdico?

- Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta
razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto
principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente

cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada

concentracin.
- Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente
gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal
obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas
bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a
temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es
la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos.
3.- para que se utiliza el medio nutritivo, y que contiene?
El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de
bacteria. Es muy til porque permanece slido incluso a relativas altas temperaturas.
Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se
distinguen mejor las colonias pequeas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece como una sustancia
espesa, con colonias difcilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente
(p/v):1

0,5 % de peptona;

0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura;

1,5 % de agar;

0,5 % de cloruro de sodio;

agua destilada;

pH casi neutro (6,8) a 25 C.

El caldo nutritivo se hace exactamente igual, excepto por la omisin del agar.
4.- Qu microorganismos se usan comnmente en el estudio de laboratorio de
biotecnologa?

Levaduras
Mohos
bacterias

5.- Cules son las ventajas de usar microorganismos en las tcnicas

biotecnolgicas?
Ventajas

Ofrece los medios para producir alimentos de mejor calidad, en forma ms eficiente y

segura para la salud y el medio ambiente.

Desde el punto de vista productivo, el uso de estas nuevas tecnologas.

permite aumentar la competitividad de pases agroexportadores como la Argentina.

aumentando los rendimientos, disminuyendo los costos y aumentando la seguridad

de la cosecha.
generar innovaciones y mejoras en los alimentos conduciendo a prcticas agrcolas
ms ecolgicas, contribuyendo a una agricultura sustentable, que utiliza con respeto
los recursos del medio ambiente y sin hipotecar generaciones futuras.

6.- Qu particularidades tiene la e. coli para ser usada en biotecnologa?

Mayor velocidad especfica de crecimiento que las levaduras y clulas de
mamferos; fcil manipulacin gentica, no posee requerimientos costosos
asociados a medios de cultivo o equipamiento a diferencia de las clulas de
organismos superiores; existencia de gran variedad de vectores de expresin
estables, y ser un microorganismo aprobado por las entidades reguladoras
para su utilizacin como hospedero en la produccin de biofrmaco.
7.- Qu son los plasmodios y donde se encuentran?
Un plasmodio es una clula multinucleada formada por fusin de varias (al contrario que
el sincitio, que es tambin multinucleado, pero en ese caso por divisin celular sin citocinesis,
solo cariocinesis). Estos agregados tienen forma de masa gelatinosa, y suelen producirse en
alguna etapa del ciclo vital de algunos protistas.
Se encuentran en ambientes hmedos deslizndose muy lentamente por el suelo en busca
de las partculas de alimento.

8.- Qu otro microorganismo est siendo usado en reemplazo de e. coli, qu

ventajas tiene?
Salmonella cholerausis
9.- Qu otros medios podemos emplear en el laboratorio en lugar de maccomkey?
Agarnsalmonella- shiguella
10.-qu

medio

se

utiliza generalmente

en

la clnica para

antibiogramas?
Mtodo de difusin en agar.
BIBLIOGRAFIA.

https://biotaetscientia.wordpress.com/tag/medio-de-cultivo/
https://www.google.com.bo/search?
q=ventajas+de+usar+microorganismos+en+las+t
%C3%A9cnicas+biotecnol

realizar

los

%C3%B3gicas&oq=ventajas+de+usar+microorganismos+en+las+t
%C3%A9cnicas+biotecnol
%C3%B3gicas&aqs=chrome..69i57.374j0j8&sourceid=chrome&es_sm=
93&ie=UTF-8#q=Qu%C3%A9+otro+microorganismo+est
%C3%A1+siendo+usado+en+reemplazo+de+e.+coli
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm