Informe #6 Bioquimica I

Actividad Enzimtica II
Mesa N 1
Lunes 10-2 PM
INTEGRANTES
Castro Buitrn Diego
DIaz Minchan Roberto
Fernndez Rebaza Gustavo
Flores Choque Pool
Garamendez Castillo Edson
INTRODUCCIN
Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como

catalizadores en todas las reacciones del metabolismo. Para que ocurran
estas reacciones es generalmente necesaria la presencia de un
catalizador, que facilitara la reaccin y de este modo aumenta la
velocidad a la que esta se desarrolla, catalizador que, adems, ha de ser
especifico para determinada reaccin.
Las enzimas, por tanto, adems de catalizadores, han de ser capaces de
reconocer sobre que sustrato han de actuar y tambin han de ser
capaces de provocar una transformacin y solo esa de las muchas que
serian posibles.
Las enzimas se unen a sus sustratos teniendo lugar la transformacin
del sustrato dando lugar a los productos de reaccin. Estos se separan
de la enzima, quedando el centro activo de esta libre y la enzima lista
para volverse a unir a otra molcula de sustrato, es decir, lista para
volver a actuar, es por eso que a) Determinaremos el efecto de la
concentracin de enzima sobre la accin de la enzima fosfatasa alcalina.
Al tratarse de protenas con estructura terciaria globular estn
influenciados por las condiciones del medio en el que tiene lugar la
reaccin.
As el pH, puede alterar la forma de la molcula de la enzima,
dificultando, o incluso impidiendo, su unin con el sustrato sobre el
acta. Cuanto afecta a la enzima es tpico de cada una de ellas.
En general, hay un valor de pH optimo en el cual la actividad es mxima,
es por eso que
b) Determinaremos el efecto de la variacin del pH
sobre la velocidad de reaccin de la fosfatasa alcalina.
En el caso de la temperatura la situacin es diferente. En las reacciones
catalizadas por enzimas un aumento de la temperatura tambin
supondr un aumento de la velocidad, pero un aumento de temperatura
puede provocar una alteracin en la estructura de enzima, por ello se
c) Determinara el efecto de la variacin de la temperatura sobre la
actividad enzimtica.
UNMSM-FFyB-Bioqumica I
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Por ltimo, d) Determinaremos el efecto del tiempo de incubacin sobre
la actividad de enzimtica de la fosfatasa alcalina y as poder evaluar los
cambios que se puedan en la accin enzimtica de esta enzima.
MARCO TERICO
Las propiedades catalticas de las enzimas y por ende su actividad
reciben la influencia de numerosos factores que deben ser controlados y
optimizados en su totalidad si se desea que las mediciones de la
actividad enzimtica tenga sentido y sean reproducibles. Entre estos
factores
figuran
magnitudes
fsicas
(temperatura,
presin),
las
propiedades qumicas de la solucin (valor del pH, fuerza inica) y la

concentracin de los sustratos, enzimas y cofactores ms importantes 1.
Efecto de la temperatura.
El aumento de la temperatura incrementa el movimiento de las cadenas
de aminocidos y de los grupos laterales y, por lo tanto, aumenta la
fuerza y la frecuencia de las colisiones entre las enzimas y las molculas
que las rodean. Este aumento de las colisiones entre las molculas de la
enzima y del sustrato favorece, por el contacto, la reaccin que estas
catalizan. Sin embargo, a temperaturas muy elevadas, las colisiones son
capaces de romper los puentes de hidrogeno y las fuerzas de van der
Waals que, desde la perspectiva individual, son relativamente dbiles; a
medida que esto ocurre, el re arreglo tridimensional que posee la enzima
se altera y se pierde su estructura funcional.
En el rango comprendido entre los 0 0C y los 40 0C, se aumenta la
actividad enzimtica y ocurren cambios muy pequeos en la estructura
de la misma; aproximadamente, por cada incremento de 10 0C, aumenta
la tasa de reaccin al doble; esto refleja el efecto de la frecuencia de los
choques de las molculas del sustrato y de la enzima. Si la temperatura
aumenta por encima de los 40 0C, las colisiones se tornan mas violentas
y se inicia el rompimiento de los enlaces. A los 55 0C la actividad
enzimtica empieza a disminuir hasta que, cerca de los 70 0C, cuando la
protena se desnaturaliza, su actividad llega a cero.
Efecto del pH.
Los cambios en el pH alteran la actividad enzimtica porque modifican
las cargas de los aminocidos que no son neutros (por ejemplo, el
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glutamato y la arginina). Al afectarse las uniones electrostticas de los
aminocidos, se pierde la estructura tridimensional de la protena y, por
lo tanto, su funcin. Existe, al igual que ocurre con la temperatura, un
valor de pH ptimo, alrededor, de 7,0 (pH neutro), en el que se alcanza
la actividad enzimtica mxima para la mayora de las enzimas; sin
embargo, hay casos que se salen de ese patrn.
Por las razones expuestas, es importante que el organismo cuente con
los mecanismos necesarios para que, en las diferentes regiones
celulares o corporales, los valores de la temperatura y del pH se
encuentren siempre dentro de cierto mbito ptimo2.
Efecto del Tiempo.
La manera ms usual de medir la actividad de una enzima es incubar la
preparacin enzimtica, generalmente a 37 0C, por periodos variables de
tiempo, y medir el producto de la reaccin enzimtica en un tiempo
dado. Si la reaccin es lineal en el tiempo, hasta un periodo
determinado, se puede expresar la actividad enzimtica en trminos de
velocidad, o sea la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.
La velocidad de la reaccin se expresa generalmente como micromoles
de producto formado por minuto, aunque cualquier otra expresin es
correcta si los valores se toman dentro de la linealidad de la reaccin.
Las razone de que la grafica no sea indefinidamente lineal son varias.
Una es, desde luego, que la reaccin haya alcanzado su equilibrio, es
decir, que el sustrato se haya agotado para formar ms producto. La
segunda razn es que la enzima, siendo una protena, empiece a
desnaturalizarse al cabo de cierto tiempo, y por lo tanto pierda su
actividad. Una tercera razn es que el producto de la reaccin tenga un
efecto inhibidor sobre la actividad de la enzima, de modo que sta
disminuye cuando el producto llega a cierta concentracin3.
Pgina 3
Efecto de la concentracin de enzima.
En toda reaccin enzimtica, si se incrementa la concentracin de
enzima, se forma mayor cantidad de producto por unidad de tiempo.
El incremento en la velocidad de reaccin es directamente proporcional
al incremento en la concentracin de enzima, siempre y cuando la
cantidad de sustrato no sea limitante, es decir, que el sustrato no llegue
a agotarse4.
Si la concentracin de la enzima se mantiene constante, la velocidad
inicial de reaccin enzimtica es directamente proporcional a la
concentracin del sustrato presente. En este caso la concentracin del
sustrato es el factor limitante de la velocidad de reaccin. Sin embargo,
aunque se aumente la concentracin del sustrato la velocidad de
reaccin no aumentara porque las molculas de enzima se saturaran de
l5.
Pgina 4
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Efecto de la
concentracin de la
enzima (fosfatasa
Preparar una batera de 5
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Agregar 2 ml solucin
buffer glicerofosfato
0.02 M pH 8.6
Adicionar Agua
3.25
3 ml
2.5
Pre- incubar 5 minutos a 37 C
Pgina 5
2 ml
1.5
Adicionar Enzima
0.25
1 ml
0.5
1.5
Incubar 30 minutos a 37 C
ATC 10 % 4.5 ml A
Centrifug
ar ml) Y
SOBRENADANTES (2.5
PATRN (1.5 ml)
Agregar:
Molibdato de amonio (0.5

ml)
Sol cido Amino Naftol
Sulfnico (0.5 ml)
Agua destilada (1.5 ml a
sobranadantes, 4ml al
blanco y2.5 ml al patrn)
*Comparar con blanco y patrn

(mismos reactivos a adicionar)
Agitar y dejar
en oscuridad
(10 minutos)
ESPECTROFOT
METRO (660 nm)
2. Efecto de
variacin de pH en
la velocidad
(fosfatasa alcalina)
Pgina 6
2 ml
Tubo
Tubo
Tubo
Glicerofosfato en agua: 2 ml a
Buffer pH 5-8.6-10
respectivamente (mismo
volumen)
Pre-incubar 5 minutos a 37 C
Adicionar Enzima diluida

(0.5 ml a todos)
Incubar 30 minutos a 37 C
ATC 10 % 4.5 ml A
Centrifug
ar
Dosaje del fosfato liberado

con el procedimiento igual
al primer ensayo
Pgina 7
3. Efecto del
tiempo de
incubacin sobre la
actividad de la
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Adicionar Agua destilada: 3ml
Pre-incubar 5 minutos a 37 C

(0.5 ml a todos)
Incubar a 37 C en BM
10
20
30
Pgina 8
40
ATC 10 % 4.5 ml A
Centrifug
ar
al primer ensayo
4. Variacin de la
temperatura sobre la
actividad enzimtica
Tubo
Tubo
Tubo
Adicionar Agua destilada: 3ml
Pre-incubar 5 minutos a 0C,

22C, 37C Y 45C en BM
respectivamente
(0.5 ml a todos)
Incubar 30 minutos a 0 C, 22C,

37C y 45C en BM respectivamente
ATC 10 % 4.5 ml A
Pgina 9
Centrifug
ar
Tubo
4. Variacin de la
temperatura sobre
la actividad
enzimtica
al primer ensayo
RESULTADOS
Ensayo N 1: Efecto de la concentracin de enzima ( =660 nm)
Tubos
Absorban
cias
Absorban
cias real
Blanc
o
0.060
Patrn
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
0.315
0.438
0.514
0.560
0.562
0.566
0.255
0.378
0.454
0.5
0.502
0.506
A partir de las absorbancias obtenidas hallar los mg de

fosfato del producto:
Concentracin del patrn de fosfato: 0.015 mg/ml

Se midi 1.5 ml del patrn, haciendo el siguiente clculo hallaremos los
mg de fosforo contenidos:
1 ml
0.015 mg
1.5 ml
X = 0.0225 mg P
Ahora la absorbancia del patrn fue de 0.255, relacionamos esta con las
absorbancias de los tubos para poder hallar la cantidad de mg de fosfato
en cada tubo:
Para el tubo 1: (0.25 mL de enzima)

0.0225 mg P
X mg P
0.255
0.378
X = 0.0333 mg P
Pgina 10
Para el tubo 2: (0.5 mL de enzima)

0.0225 mg P
X mg P
0.255
0.454
X = 0.0400 mg P
Para el tubo 3: (1 mL de enzima)

0.0225 mg P
X mg P
0.255
0.5
X = 0.0441 mg P
Para el tubo 4: (1.5 ml de enzima)

0.0225 mg P
X mg P
0.255
0.502
X = 0.0442mg P
Para el tubo 5: (2 mL de enzima)

0.0225 mg P
X mg P
0.255
0.506
X = 0.0446 mg P
Ensayo N 2: Efecto del pH ( =660 nm)

Tubos
Blanco Patrn
Absorbanci
as
Absorbanci
as real
0.016
0.318
Tubo
1
0.131
Tubo
2
0.504
Tubo
3
0.202
0.302
0.115
0.488
0.186
Pgina 11


1 ml
0.015 mg
1.5 ml
X = 0.0225 mg P
en cada tubo:
Para el tubo 1: (pH= 4)

0.0225 mg P
X mg P
0.302
0.115
X = 0.0085 mg P
Para el tubo 2: (pH= 8.6)

0.0225 mg P
X mg P
0.302
0.488
X = 0.0363 mg P
Para el tubo 3: (pH= 10)

0.0225 mg P
X mg P
0.302
0.186
X = 0.0138 mg P
Ensayo N 3: Efecto del tiempo de incubacin ( =660 nm)

Tubos
Patrn
Tubo
Tubo
Pgina 12
Tubo
Tubo
Tubo
Absorbanci
as real
0.315
1
0.133
2
0.354
3
0.426
4
0.458
5
0.478


1 ml
0.015 mg
1.5 ml
X = 0.0225 mg P
en cada tubo:
Para el tubo 1: (Tiempo: 0 minutos)

0.0225 mg P
X mg P
0.315
0.133
X = 0.0095 mg P
Para el tubo 2: (Tiempo: 10 minutos )

0.0225 mg P
X mg P
0.315
0.354
X = 0.0252 mg P

0.0225 mg P
Pgina 13
0.315
X mg P
0.426
X = 0.0304 mg P

0.0225 mg P
0.315
X mg P
0.458
X = 0.0327 mg P

0.0225 mg P
0.315
X mg P
0.478
X = 0.0341 mg P
Ensayo N 4: Efecto de la temperatura ( =660 nm)
Tubos
Blanco Patrn
0.341
Tubo
1
0.285
Tubo
2
0.436
Tubo
3
0.504
Tubo
4
0.516
Absorbanci
as
Absorbanci
as real
0.046
0.295
0.239
0.39
0.458
0.47


1 ml
0.015 mg
Pgina 14
1.5 ml
X = 0.0225 mg P
en cada tubo:
Para el tubo 1: (Temperatura: 0 C)

0.0225 mg P
X mg P
0.295
0.239
X = 0.0182 mg P
Para el tubo 2: (Temperatura: 19 C )

0.0225 mg P
X mg P
0.295
0.39
X = 0.0297 mg P

0.0225 mg P
X mg P
0.295
0.458
X = 0.0349 mg P

0.0225 mg P
X mg P
0.295
0.47
X = 0.0358 mg P
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DISCUSIN
La cintica enzimtica se preocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas, lo que nos proporciona informacin directa acerca del mecanismo de la
reaccin cataltica y de especificidad de la enzima, en este caso la fosfatasa alcalina,
utilizada en esta prctica.
Durante la prctica observamos y cuantificamos la actividad enzimtica en relacin con
algunos factores que van a modificar el curso normal de la reaccin en condiciones
normales en el organismo de la enzima mencionada anteriormente.
En una reaccin tpica, la [E] puede estar presente en concentraciones de orden nanomolar,
mientras que la [S] puede ser 5 o 6 rdenes de magnitud mayor. Por lo tanto a medida que
aumentemos la [E], habr una mayor cantidad de enzima que catalice la reaccin del
sustrato, aumentando as la velocidad de reaccin y por ende el producto obtenido ser
mayor.1
Esto es lo que se puede apreciar en la primera parte de la prctica realizada, en la cual a una
cantidad igual a 0.25 mL de fosfatasa alcalina, el producto obtenido en dicha reaccin fue
de 0.0333 mg/ml, Y a medida que aumentamos la concentracin de la enzima, el producto
tambin aumenta, siendo este igual a 0.0446 mg/ml cuando se le agreg 2 mL de enzima.
Para poder cuantificar este cambio en la actividad enzimtica a medida que aumentamos la
cantidad de enzima, se midi la cantidad total de producto formado, es decir el fosfato en
relacin a la [E], luego de haber sido agregada la enzima a la solucin con su sustrato glicerofosfato, este producto se pudo medir detectando la presencia de fosfato en la
solucin ya que este forma un compuesto azulado al unirse al Molibdato y la solucin
reductora, leyendo su absorbancia en el espectrofotmetro, a una longitud de onda de
660nm.
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Se sabe que la absorbancia es proporcional a la cantidad de fosfato presente en el producto;
por lo que a mayor cantidad de fosfato generado por la reaccin, mayor ser la absorbancia
de la solucin obtenida como producto, tal como se muestra lneas arriba.
La medida de la velocidad de reaccin se realiza siempre en condiciones ptimas para la
enzima fosfatasa alcalina, o sea un pH= 8.6 y una temperatura de 37C, por lo que fue de
mucha importancia la preincubacin de la solucin; ya que solo despus de 5 minutos en el
bao mara, sistema en el que hay agua destilada calibrada que mantiene a la T deseada,
gracias a un termostato electrnico; comprobando que esta necesita un medio ptimo para
poder reaccionar y cumplir su funcin, que es disminuir la energa de activacin, por lo que
se debe continuar con la incubacin hasta el termino del experimento.
Las enzimas tienen un pH ptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es mxima, a
valores superiores o inferiores de pH la actividad disminuye, esto debido a que algunas
cadenas laterales de aminocidos pueden actuar como cidos o bases dbiles que
desarrollan funciones crticas en el sitio activo del enzima que dependen del mantenimiento
de un cierto estado de ionizacin, mientras que en otras zonas de la protena algunas
cadenas laterales ionizadas pueden jugar un papel esencial en las interacciones que
mantienen la estructura de la protena.1
Para el casos de la fosfatasa alcalina esta es una enzima que hidroliza el enlace ster
fosfrico entre un grupo fosfato y un radical orgnico a pH bsico (pH ptimo entre 9 y 10)
liberando fosfato inorgnico. Por lo tanto como la enzima tiene actividad optima a un pH
bsico, esta al encontrarse en un medio cido, es decir pH bajo, la Enz- adquiere protones y
pierde su carga negativa, mientras que a valores de pH altos, el sustrato se ioniza y pierde
su carga positiva, por lo tanto los valores extremos de pH disminuirn las concentraciones
efectivas de Enz- y SH', con lo cual se reduce la velocidad de reaccin Conforme cambia la
carga en este grupo, la protena puede desenrollarse, volverse ms compacta o disociarse en
protmeros, todo lo cual conduce a la prdida de la actividad.2
Esto se demostr con en el segundo experimento, en la cual a un pH igual a 4 la enzima
tiene una actividad disminuida, lo cual se puede comprobar con la cantidad de producto
obtenido, el cual es igual a 0.0085 mg/mL. Mientras que a un pH igual a 8.6 la actividad
enzimtica es mayor, reflejndose en la cantidad de producto obtenido que es igual a
0.0363 mg/mL, y finalmente tenemos que a un pH igual a 10, la cantidad de producto
obtenido es igual a 0.0138. Por lo tanto se puede decir que el pH ptimo en el cual la
actividad de la fosfatasa alcalina es ptima es igual a 8.6.
Por otro lado En cualquier momento de la reaccin catalizada por una enzima, este existe
en dos formas, la forma libre o sin combinar E y la forma combinada ES. A baja [S], la
mayor parte de enzima estar en la forma sin combinar E. aqu la velocidad ser
proporcional a [S] porque el equilibrio ser empujado hacia la formacin de ms ES a
medida que [S], aumenta. La velocidad inicial mxima de la reaccin catalizada se
observar cuando virtualmente toda la enzima este en forma de complejo ES y la
concentracin de E sea extremadamente pequea. En estas condiciones, la enzima est
saturada con su sustrato. Esta condicin se producir cuando la [S] sea lo suficientemente
alto como para que toda la enzima libre se haya convertido en la forma ES. Es cuando el
complejo Es se descompone dando el producto P, el enzima queda libre para catalizar la
otra reaccin de otra molcula de sustrato. 1 De esto podemos deducir que en un tiempo
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prolongado de catlisis enzimtica, una vez terminada esta, la enzima nuevamente
catalizar otra reaccin, aumentando con esto el producto de la reaccin a medida que el
tiempo pase.
Esto se puede comprobar con el experimento nmero tres, en la cual segn aumentamos el
tiempo de reaccin, se obtuvo una mayor cantidad de producto, siendo este a un tiempo
igual a cero 0.0095 mg/mL. Y a un tiempo igual a 40 minutos, la cantidad de producto
obtenido fue de 0.341 mg/mL.
Finalmente elevar la temperatura en una reaccin incrementa el nmero de molculas que
pueden reaccionar, ya que aumenta la energa cintica e incrementa la frecuencia de las
colisiones. Adems, cualquier elevacin de temperatura, acelera el movimiento molecular y,
por ende, la frecuencia de colisin. Los dos factores contribuyen al incremento en la
velocidad de reaccin que acompaa a un aumento de temperatura. Al principio, la
velocidad de la reacci6n aumenta cuando la temperatura se eleva, debido al incremento en
la energa cintica de las molculas reactantes. Sin embargo, al final, la energa cintica de
la enzima excede a la barrera energtica para romper los enlaces dbiles de hidrgeno e
hidrofbicos que conservan su estructura secundaria-terciaria, A esta temperatura,
predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la actividad cataltica.2 En el
caso de la fosfatasa alcalina despus de aproximadamente 45C, se comienza a producir
desnaturalizacin trmica de la enzima, ya que esta es una protena.3
En la prctica se obtuvo una mayor concentracin de producto a medida que se aument la
temperatura siendo el producto obtenido a 0C igual a 0.0182 mg/mL y 0.0358 mg/mL a
una temperatura igual a 45 C, sin embargo segn la bibliografa consultada, a la
temperatura igual a cero la actividad optima debe de ser nula o casi nula, debido a que a
esta temperatura la energa de activacin que se necesita para que se pueda dar la reaccin
no es suficiente, es decir, la energa en ese instante no sobrepasa la barrera energtica y por
ende no se produce el alineamiento de los grupos reactivos para que puedan reaccionar de
forma favorable. Y al 45 C esta actividad debe verse disminuida, debido a que a esta
temperatura los enlaces de hidrogeno y otros enlaces dbiles empiezan a romperse lo cual
lleva a una desnaturalizacin de la enzima.
Segn la teora la temperatura ptima de la fosfatasa alcalina es de 37 C, y es a esta
temperatura donde debe de obtenerse la mayor cantidad de producto, lo cual no sucedi en
la prctica, esto puede deberse a que la enzima empieza a desnaturalizarse recin a los 45
C, a esta temperatura la enzima an se encuentra completa y sin variaciones en su
estructura y como las colisiones entre las molculas es mayor entonces las reacciones se
darn de forma ms rpida.
Por ltimo Ser rigurosos durante el desarrollo de la prctica es importante en aspectos

como, medir volmenes exactos, la responsabilidad de integrante que maneja el tiempo, la
lectura en el espectrofotmetro; para as tener datos reales de la actividad de la Fofatasa
Alcalina en los determinados grficos.
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CONCLUSIONES
-
Se demostr el efecto de la concentracin de la enzima sobre la accin enzimtica de la

fosfatasa alcalina, obteniendo un mayor producto a medida que aumentamos la
concentracin.
Se demostr el efecto de la variacin del pH sobre la velocidad de reaccin de la
fosfatasa alcalina, donde se obtuvo una mayor cantidad de producto al pH ptimo igual
a 8,6.
Se demostr el efecto del tiempo de incubacin sobre la actividad enzimtica, siendo
mayor el producto obtenido en un tiempo mayor (40 min.).
Se demostr el efecto de la variacin de la temperatura sobre la actividad enzimtica
encontrndose una mayor actividad entre 37 45 C.
CUESTIONARIO
1. Enzima y su pH ptimo.
ENZIMA
pH
Anhidrasa carbnica
6-8
Colinesterasa
7,5
Lactato deshidrogenasa
7,8
Quimiotripsina
8-9
DNA polimerasa I
8,1 - 9,1
Lisozima
5,2
Ribonucleasa
7.8
Amilasa
57
Pgina 19
Pepsina
1.5
Arginasa
9.7
2. Enzimas con pH ptimo en el rango acido.

Enzima con pH ptimo en el rango cido:
Pepsina
1.5 1.6
Lipasa (Estomago)
45
Invertasa
4.5
Maltasa
6.1 6.8
Amilasa (Pncreas)
6.7 7
Amilasa (Malta)
4.6 5
3. Enzimas Termoestables.
Las enzimas termoestables presentan
resistencia y capacidad de
funcionamiento a elevadas temperaturas.
Las enzimas termoestables se pueden clasificar en tres grupos, de
acuerdo al rango
de temperatura de estabilidad: termoestables
moderadas (45-65C), termoestables
(65-85C) y termoestables
extremas (>85C).
Debido a que las reacciones enzimticas son especficas, las enzimas
con caractersticas de termoestabilidad pueden ser utilizadas para
llevar a cabo reacciones que no poda ser posible realizarlas por
enzimas mesfilas y por catlisis qumica. La viabilidad que tienen las
enzimas termoestables les proporciona la caracterstica para poder ser
utilizadas en nuevas aplicaciones en el futuro.
La importancia que han adquirido las enzimas termoestables es debida a
que pueden ser utilizadas en procesos industriales exigentes tales como
la industria de la piel, lavado de equipo a temperaturas elevadas, la
industria de lcteos, la industria del
almidn, farmacutica, de
Pgina 20
alimentos, textil, sntesis de aminocidos, hidrolizados de protena,
sntesis orgnica, petrleo, qumica y papel. Asimismo, la operacin a
altas temperaturas tiene influencia significativa en la viabilidad y
solubilidad de compuestos orgnicos; por ello las
enzimas
termoestables tambin son usadas en biorremediacin.
Entre las estrategias desarrolladas para obtener enzimas termoestables
se encuentra las tcnicas de biologa molecular, tcnicas de
inmovilizacin, o bien la produccin de enzimas a partir de
microorganismos termfilos (crecimiento por encima de 45 C) y en
algunos casos hipertermfilos (por encima de 90 C).
Las enzimas producidas por estos microorganismos se caracterizan por
presentar una elevada estabilidad trmica e incluso resistencia a
desnaturalizantes qumicos (sales caotrpicas, disolventes orgnicos o
detergentes). Estas ventajas facilitan que puedan ser utilizadas en
procesos a temperatura elevada con prdidas mnimas de actividad y el
consiguiente incremento en la velocidad de reaccin.
La presenta invencin, por ejemplo, tiene por objeto el desarrollo de un
procedimiento industrial para la obtencin de enzimas termoflicas con
actividad lipoltica de microorganismos termfilos del gnero Thermus, a
travs de su crecimiento en un preparado de agua termal mineral y la
recuperacin de la actividad del medio de fermentacin mediante un
proceso secuencial de descongelacin, congelacin y centrifugacin de
la biomasa.
El procedimiento es de aplicacin inmediata en la industria de
produccin de enzimas lipolticas (lipasas, esterasas) y sus sectores de
aplicacin, como la industria farmacutica, qumica fina, alimentaria y
tratamiento de aguas residuales.
4. La ecuacin de Arrhenius.
La asombrosa velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, se
debe principalmente a dos factores descritos por Arrhenius.
En primer lugar, las enzimas disminuyen considerablemente la energa
de activacin, necesaria para que las molculas reaccionen.
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En segundo lugar las enzimas poseen un sitio cataltico o sitio activo,
donde el sustrato y los cofactores y coenzimas necesarios, como
molculas reaccionante, se encuentran con la estreo especificidad
adecuada para que interaccionen correctamente, a diferencia de lo que
ocurre en la reaccin no catalizada, en que las molculas chocan al azar
en cualquier posicin.
Tal vez pueda mencionarse un tercer factor, las enzimas se hallan,
dentro de la clula, restringidas en compartimentos funcionales
especficos, ncleo, membrana, mitocondria, etc. donde deben realizar
su accin, y/o formando grandes complejos enzimticos donde los
sustratos y productos pasan de un componente del complejo a otro,
facilitando su interaccin.
Como se sabe la ecuacin de Arrhenius es:
Se sabe adems que esta expresin A = A (T) y varia segn T 0.5. Si se

considera que el termino de la exponencial es no nulo y grande, es muy
probable que la variacin de la constante de velocidad de reaccin con
la temperatura sea mucho mas sensible a la exponencial que el factor
frecuencia (A) y por tanto es posible asumir que A es una constante sin
equivocarse demasiado.
Con el fin de facilitar el clculo de la energa de activacin, se puede
manipular la expresin de Arrhenius aplicando logaritmo natural
obteniendo:
Tomando ln k = Y, ln A = b y -1/RT = X se tiene la recta de tipo Y = b +

mX con m = Ea. Por tanto, es razonable tomar series de datos de
temperatura vs constante de velocidad. Calculando X e Y y realizando
una regresin lineal se obtiene los valores buscados.
Pgina 22
5. Durante un ensayo de cineticas de una reaccin catalizada
enzimticamente, los siguientes datos fueron registrados:
E0 (g/L)
T ( C)
I (mmol/mL)
S
(mmol/mL)
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
0.92
0.92
0.92
0.92
0.92
0.92
30
30
30
30
30
49.6
49.6
49.6
49.6
49.6
30
30
30
30
30
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.6
0.6
0.6
0.1
0.033
0.02
0.01
0.005
0.1
0.033
0.01
0.0067
0.005
0.1
0.02
0.01
0.1
0.033
0.02
V
(mmol/mLmin)
2.63
1.92
1.47
0.96
0.56
5.13
3.7
1.89
1.43
1.11
1.64
0.90
0.58
1.33
0.80
0.57
a) Determine la constante de Michaelis-Menten para la reaccin

sin inhibidor presente en 30 C y en 49.6 C.
Para 30C y EO= 1.6 g/L
Utilizando la recta de Linenweaver-Burk o de dobles inversos
y=bx +a
(a= 0.303428
b= 7.4080 x 10-3 )
Ahora la ecuacin de Linenweaver-Burk
Reemplazando
Pgina 23
1/Vmax =a
Vmax = 1/a
Vmax = 3.2956 (mmol/mL-min)
Luego
Km/Vmax =b
Km= (Vmax)(b)
Km= 0.0244 mmol/mL
y=bx +a
(a= 0.4881
b= 0.0123)
Reemplazando
1/Vmax =a
Vmax = 1/a
Luego
Km/Vmax =b
Km= (Vmax)(b)
Km= 0.0251 mmol/mL
Para 49.6C y EO= 1.6 g/L
y=bx +a
(a= 0.1576
b= 3.6897 x 10-3 )
Pgina 24
Reemplazando
1/Vmax =a
Vmax = 1/a
Luego
Km/Vmax =b
Km= (Vmax)(b)
Km= 0.0234 mmol/mL
b) Determine la velocidad mxima de la reaccin no inhibida en

30 C y una concentracin enzimtica de 1.6 g/L.
y=bx +a
(a= 0.303428
b= 7.4080 x 10-3 )
Pgina 25
Reemplazando
1/Vmax =a
Vmax = 1/a
Vmax = 3.2956 mmol/mL-min
c) Determine el Ki para el inhibidor en 30 C y decida qu tipo de

inhibidor est siendo usado.
Utilizando la recta de Linenweaver-Burk o de dobles inversos en
presencia de inhibidor
y=bx +a
(a= 0.4977
b= 0.02505)
Reemplazando
1/Vmax =a
Vmax = 1/a
Vmax = 2.009 mmol/mL-min
Luego
Km/Vmax =b
Pgina 26
Km= (Vmax)(b)
Km= 0.0503 mmol/mL

Utilizando la recta de Linenweaver-Burk o de dobles inversos en
ausencia de inhibidor
y=bx +a
(a= 0.4881
b= 0.0123)
Reemplazando
1/Vmax =a
Vmax = 1/a
Luego
Km/Vmax =b
Km= (Vmax)(b)
Km= 0.0251 mmol/mL
Se trata de una inhibicin competitiva:
Hallando el Ki:
V0 = Vmax (S) / (S) + Km
=1 + I/KI
0.57 mmol/mL-min= (2.009 mmol/mL-min x 0.02 mmol/mL ) /
0.02 mmol/mL + 0.0503 mmol/mL x
Pgina 27
= 1.0019
Finalmente:
1.0019= 1 + 0.6x 10-3/ Ki
Ki= 0.3157 M/L
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Lenhinger Principios de Bioqumica. David L. Nelson Michael M. Cox, cuarta
edicin. P. 203-212.
2. Harper Bioqumica Ilustrada. Robert K.Murray, Daryl K.Granner, Peter A. Mayes,
Victor W. Rodwell; 14 edicin; p. 92-99.
3. Caracterizacin cintica de la fosfatasa alcalina. Jos Antonio Brcena Ruiz,
Concepcin Garca Alfonso, Carmen Alicia Padilla Pea, Emilia Martnez Galisteo,
Jess Dez Dapena; Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus
Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba
4. Koolman J y Rhm K. Bioqumica: texto y Atlas. Editorial Panamericana. Tercera
Edicin. Madrid, 2004. Pg. 92-95
5. Fornaguera j y Gmez G. Bioqumica Editorial Universidad Estatal. Primera
Edicin. San Jose, 2007. Pg. 65-67
Pgina 28
6.
Pea A. Bioqumica. Editorial Limusa S.A.Segunda Edicin. Mexico, D.F.Pg.

194-201
7. Quesada S. Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioqumica. Editorial
Universidad Estatal. Primera Edicin. San Jose, 2007. Pg. 47
8. Montoya H. Microbiologa bsica para el rea de salud afines. Editorial Universidad
de Antioquia. Segunda Edicin. Medelln, 2008. Pg. 47
Pgina 29

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Actividad Enzimtica II

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como

propiedades qumicas de la solucin (valor del pH, fuerza inica) y la

Pre- incubar 5 minutos a 37 C

Molibdato de amonio (0.5

*Comparar con blanco y patrn

Adicionar Enzima diluida

Dosaje del fosfato liberado

Adicionar Agua destilada: 3ml

Adicionar Enzima diluida

Adicionar Agua destilada: 3ml

Pre-incubar 5 minutos a 0C,

Incubar 30 minutos a 0 C, 22C,

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

A partir de las absorbancias obtenidas hallar los mg de

Concentracin del patrn de fosfato: 0.015 mg/ml

Para el tubo 1: (0.25 mL de enzima)

Para el tubo 2: (0.5 mL de enzima)

Para el tubo 3: (1 mL de enzima)

Para el tubo 4: (1.5 ml de enzima)

Para el tubo 5: (2 mL de enzima)

Ensayo N 2: Efecto del pH ( =660 nm)

A partir de las absorbancias obtenidas hallar los mg de

Concentracin del patrn de fosfato: 0.015 mg/ml

Para el tubo 1: (pH= 4)

Para el tubo 2: (pH= 8.6)

Para el tubo 3: (pH= 10)

Ensayo N 3: Efecto del tiempo de incubacin ( =660 nm)

A partir de las absorbancias obtenidas hallar los mg de

Concentracin del patrn de fosfato: 0.015 mg/ml

Para el tubo 1: (Tiempo: 0 minutos)

Para el tubo 2: (Tiempo: 10 minutos )

Para el tubo 3: (Tiempo: 20 minutos)

Para el tubo 4: (Tiempo: 30 minutos)

Para el tubo 5: (Tiempo: 40 minutos)

Ensayo N 4: Efecto de la temperatura ( =660 nm)

A partir de las absorbancias obtenidas hallar los mg de

Concentracin del patrn de fosfato: 0.015 mg/ml

Para el tubo 1: (Temperatura: 0 C)

Para el tubo 2: (Temperatura: 19 C )

Para el tubo 3: (Temperatura: 37 C)

Para el tubo 4: (Temperatura: 45 C)

Por ltimo Ser rigurosos durante el desarrollo de la prctica es importante en aspectos

Se demostr el efecto de la concentracin de la enzima sobre la accin enzimtica de la

2. Enzimas con pH ptimo en el rango acido.

Se sabe adems que esta expresin A = A (T) y varia segn T 0.5. Si se

Tomando ln k = Y, ln A = b y -1/RT = X se tiene la recta de tipo Y = b +

a) Determine la constante de Michaelis-Menten para la reaccin

Ahora la ecuacin de Linenweaver-Burk

Ahora la ecuacin de Linenweaver-Burk

b) Determine la velocidad mxima de la reaccin no inhibida en

Ahora la ecuacin de Linenweaver-Burk

c) Determine el Ki para el inhibidor en 30 C y decida qu tipo de

Ahora la ecuacin de Linenweaver-Burk

Para 30C y EO= 0.92 g/L

Ahora la ecuacin de Linenweaver-Burk

Pea A. Bioqumica. Editorial Limusa S.A.Segunda Edicin. Mexico, D.F.Pg.

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