Microbiologa Ambiental

Laboratorio N1 y N2
Preparacin, fijacin y coloracin simple de frotis.

Objetivo de la clase:
Que el estudiante aprenda tcnicas de preparacin de frotis, fijacin y coloraciones ms usadas
en el estudio de cultivo de microorganismos, que identifique las principales formas de estos y la
importancia de las tinciones en su caracterizacin morfolgica.
Introduccin
Observacin Microscpica
De los mtodos generales que emplea la bacteriologa en el estudio de la clula bacteriana, el
primero de ellos es la observacin microscpica. Esta etapa primaria y fundamental puede ser
efectuada a travs de un sinnmero de tcnicas, cuya eleccin depende del objetivo mismo que
pretenda la investigacin. Por ejemplo es posible estudiar la forma de la bacteria, sus distintas
partes constitutivas, intra y extra celulares, su afinidad tintorial, su capacidad de movimiento,
etc. A continuacin presentamos una clasificacin de las principales tcnicas:

Observaciones Microscopicas

2. Por medio de
tinciones (bacterias
muertas)

1. Al fresco (con
bacterias vivas)

Microscopio
corriente luz
blanca

Microscopio
contraste de
fases

Microscopio
fondo oscuro

Tincin
simple

Tinciones
especiales

3. Por microscopia
fluorescente

Tinciones
diferenciales

La observacin microscpica con luz blanca transmitida es la ms usada, pero la observacin de

las clulas es dificultosa por el poco contraste entre la clula y el medio ambiente.
Mejores observaciones se logran con microscopios equipados con condensadores para campo
oscuro o para contraste de fases. Estos permiten un mayor contraste entre la clula bacteriana y
el medio ambiente y ello posibilita la visin de estructuras muy pequeas como las espiroquetas
invisibles al microscopio corriente de luz blanca.
1. OBSERVACION MICROSCPICA EN FRESCO
Esta tcnica permite determinar la MOVILIDAD de la clula bacteriana, movimientos de
traslacin de un punto a otro, desplazndose en forma rpida y zigzagueante. No confundir con
desplazamiento masivo ni con el movimiento vibratorio de partculas: BROWNIANO.
TCNICA DE LAS OBSERVACIONES MICROSCPICAS EN FRESCO:
a. Colocar sobre un portaobjeto limpio una gota de agua o suero fisiolgico y hacer una
emulsin con el cultivo de la bacteria que se desea observar (basta una pequea asada).
b. Sobre una emulsin colocar un cubreobjeto limpio.
c. Con lente objetivo 10x enfocar la preparacin con el condensador bajo para aumentar el
contraste, tambin se puede bajar la iluminacin cerrando el diafragma parcialmente.
RESULTADO: Los cuerpos bacterianos semitransparentes se ven desplazndose de un lado para
otro sin una direccin definida.
1. OBSERVACION MICROSCPICA POR MEDIO DE TINCIONES.
Mediante el empleo de colorantes se logra aumentar el contraste entre la clula bacteriana, o
parte de ellas, y el medio ambiente. En general, las bacterias tienen afinidad por los colorantes
bsicos y los derivados de la anilina. Estos llevan en su parte cromfora cargas electro positivas
que tienen afinidad por las cargas negativas de la superficie bacteriana, cidos nucleicos y
derivados. La atraccin entre los colorantes y las bacterias depende de ciertos factores, entre los
cuales el ms importante es el pH del medio. En un medio alcalino aumenta la electronegatividad
de la bacteria y por lo tanto hay mayor afinidad por los colorantes. La edad de la clula acta
negativamente, las clulas viejas se tien con dificultad o no se tien.

1.1.

TINCION SIMPLE. Se basan en el empleo de un solo colorante sobre las clulas

bacterianas, que quedan coloreadas todas del mismo color. Este tipo de tincin, por lo
tanto, nos permite solamente observar la forma exterior y la agrupacin de las
bacterias. Son por ello poco usadas.

1.2.

TINCIONES ESPECIALES. Tienen por objeto destacar, dentro de la clula misma,

algunas de sus partes constitutivas: ncleo, flagelo, cpsula, etc. Dado su complejidad
no son de uso rutinario, sino ms bien en trabajos de investigacin.

1.3.

TINCIONES DIFERENCIALES. Permiten efectan agrupacin de las bacterias de

acuerdo a su diferente afinidad por los colorantes que se utilizan. As, bacterias que
quedan teidas de color diferentes pertenece tambin a grupos distintos. su
importancia es bastante grande que ya existe cierta correlacin entre la afinidad
tintorial de las bacterias y otras propiedades como por ejemplo su susceptibilidad o
resistencia a determinados agentes antibacterianos.

Entre ellas las ms importantes son tincin de Gram y tincin de Ziehl Neelsen

2. OBSERVACION MICROSCOPICA POR FLUORESCENCIA.

Esta tcnica se basa en la observacin de clulas bacterianas a las cuales se han adosado,
superficialmente una sustancia capaz de producir fluorescencia. El microscopio usado debe estar
equipado con una fuente de luz ultravioleta, adems de un condensador de fondo escuro. No solo
es posible visualizar las bacterias, sino tipificarlas.

TCNICA DE LAS PRINCIPALES TINCIONES:

2.1 TINCON SIMPLE.
Hacer un frotis y fijarlo a la llama del Bunsen.
Cubrirlo con el colorante elegido:

Violeta de genciana o Cristal violeta (15 seg)

Safranina (20 seg)
Azul de metileno (30 seg)
Lavar con agua a chorro suave y secar (sacar el exceso de colorante)
Observar por inmersin.

2.2 TINCIONES ESPECIALES.

2.2.1. Tincin de cpsula. (Mtodo de Duguid).
RESULTADO: Sobre un fondo oscuro la capsula se ve como un halo claro que rodea la clula
bacteriana ms refringente.
2.2.2. Tincin de espora. (Mtodo de Bartholomew y Mitewer).
RESULTADO: El cuerpo bacteriano aparece de color rojizo en el cual se destaca la espora de
color verde.
2.2.3. Tincin de corpsculos metacromticos o granos de volutina.
RESULTADO: El cuerpo de la bacteria aparece teido de color azul morado plido, mientras los
corpsculos se ven de color azul morado plido, mientras los corpsculos se ven de color azul
oscuro (Casi siempre en los extremos).
2.2.4. Tincin de lpidos. (Mtodo de Burdon).
RESULTADO: El cuerpo bacteriano se tie de color rosado, mientras los lpidos en su interior
de color negro.
2.2.5. Tincin de flagelos. (Mtodo de Leifson).
RESULTADO: Sobre un fondo rosado destacan las bacterias teidas de rojo rodeadas por cilios
ondulados muy largos y finos.

2.3 TINCIONES DIFERENCIALES.

2.3.1. TINCION DE GRAM (Modificacin de Hucker)

METODOLOGA
Se explicar a los estudiantes:
1.- los principios de manejo del microscopio
a. Uso de cada objetivo y su rendimiento en la observacin.
b. Ubicacin apropiada del condensador segn sea el tipo de observacin, a fresco o por
inmersin.
c. Limpieza del microscopio.

2.-La asepsia necesaria para trabajar

con microorganismos, tanto para evitar las

contaminaciones de los materiales en uso y los medios de cultivo empleados, como la posible
infeccin delas personas que ingresan al laboratorio.
3.- Tcnicas de preparacin de frotis fresco y fijo.
4.-Tinciones simples y tinciones especiales.

ACTIVIDADES GENERALES
Laboratorio N1 29-09-15
Es importante considerar lo siguiente:
La asistencia y puntualidad a los prcticos es obligatoria. Hora de inicio 2.30 pm.
Cada estudiante debe presentarse con un delantal de color blanco y el cabello tomado en
el supuesto de que est largo.
Deben traer un cuaderno para laboratorio, lpiz de mina y goma.
Deben presentarse al laboratorio con un informe relativo a temas que deben desarrollar.

Instrucciones para el informe

Aspectos formales:
Letra Times New Roman 12
Justificado
Interlineado 1.5
Estructura del informe
Portada: Logo Institucin, Nombre, Fecha, N Laboratorio
Introduccin
Desarrollo
Conclusin
Referencias bibliogrficas

Tema para el informe del Laboratorio N1

1.-Averiguar cules son los reactivos y procedimiento para realizar cada una de las Tinciones
especiales indicadas en la gua.
2.-Averiguar cul es el fundamento terico de Microscopa de campo oscuro, contraste de fases y
fluorescencia.
ACTIVIDADES LABORATORIO
1. En el laboratorio encontrara cultivos de diferentes microorganismos. De acuerdo a la tcnica
ya descrita para observacin a fresco, haga una preparacin de c/u de estos microorganismos y
describa su morfologa. Observe con poca iluminacin y aumento no mayor de 40x.Dibuje sus
observaciones. Qu sucede si cambia el objetivo?
2. Con los cultivos que se le entreguen efecte tinciones simples. Trate de establecer, mediante la
observacin por inmersin (aumento de 100x), las diferentes morfologas de los
microorganismos. Dibuje sus observaciones.

3. A partir de la muestra entregada realice tincin de Gram siguiendo el procedimiento descrito

a continuacin, dibuje sus observaciones:
-Hacer un frotis y fijarlo a la llama.
-Cubrir el frotis con cristal violeta-oxalato por 1 minuto.
-Lavar con agua en chorro fino de la llave.
-Cubrir con solucin de yodo (lugol) por 1 minuto.
-Lavar.
-Decolorar con alcohol de 95 por 30 seg. No ms.
-Lavar
-Cubrir frotis con sol. De safranina por 10 seg.
-Lavar
-Secar en llama suave y observar por inmersin.
RESULTADO: Gram positivas se ven de color violeta y Gram negativas de color rojo.