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Hidrolizados de protena: Procesos y

aplicaciones
ARTICLE in ACTA BIOQUIMICA CLINICA LATINOAMERICANA JUNE 2008
Impact Factor: 0.13

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3 AUTHORS:
Ricardo Bentez

Albert Ibarz

Universidad del Cauca

Universitat de Lleida

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Jordi Pagn
Universitat de Lleida
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Qumica Biolgica

Actualizacin

Hidrolizados de protena:
procesos y aplicaciones
Protein hydrolysates: processes and applications
Ricardo Bentez1*, Albert Ibarz2**, Jordi Pagan2**

1. Magster en Ciencias Qumicas.

2. Doctor en Ciencias Qumicas
*

Grupo de Qumica de Productos Naturales,

Departamento de Qumica, Universidad del
Cauca, Popayn Colombia.
** Departamento de Tecnologa de alimentos
UTPV-CeRTA, Universidad de Lleida, Av.
Rovira Roure, 191, 25198 Lleida Espaa

Resumen
En la hidrlisis enzimtica de protenas hasta pptidos o aminocidos, por
accin de enzimas proteolticas, la composicin final y, por tanto, el uso de
los hidrolizados depender principalmente de la fuente proteica, del tipo de
proteasa usada, de las condiciones de hidrlisis y del grado de hidrlisis alcanzado en la reaccin. Los hidrolizados se utilizan ampliamente en la tecnologa alimentaria por sus propiedades nutricionales o funcionales (solubilidad, poder emulsificante, capacidad espumante). En este trabajo se
muestra la tendencia actual en las tcnicas empleadas para la obtencin
de hidrolizados mediante enzimas y los diferentes mtodos usados para el
control de estos preparados; se indican adems sus posibles aplicaciones.
Palabras clave: hidrlisis enzimtica * protenas * proteasas * caracterizacin * grado de hidrlisis

Summary

Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana

Incorporada al Chemical Abstract Service.
Cdigo bibliogrfico: ABCLDL.
ISSN 0325-2957
ISSN 1851-6114 en lnea

In the enzymatic hydrolysis of proteins up to peptides or amino acids, by

the action of proteolytic enzymes, the final composition and therefore the
use of the hydrolizates will depend on the protein source, on the type of
protease used, on the hydrolysis conditions and on the hydrolysis grade
reached in the reaction. Hydrolizates are used widely in food technology
due to their nutritional or functional properties (solubility, emulsifient
power, foaming capacity). This work shows the present trend in the skills
used to obtain hydrolizates by means of enzymes as well as the different
methods used for the control of these preparations; besides theirs likely
applications are also indicated.
Keywords: enzymatic hydrolysis * proteins * proteases * characterization *
degree of hydrolysis

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

228

Bentez R et al.

Introduccin
En los hidrolizados de protena se potencian diversas caractersticas funcionales, tales como viscosidad
baja, mayor capacidad de agitacin, dispersin y alta
solubilidad, que les conceden ventajas para el uso en
muchos productos alimenticios, respecto a las protenas originales (1-5).
Una de las aplicaciones ms importantes de los
hidrolizados de protenas es su utilizacin como fuente de nitrgeno en la formulacin de dietas enterales
con destino a la alimentacin infantil y/o de adultos
enfermos. Estas dietas entricas se disean para ser
absorbidas en el intestino sin una digestin previa en
el estmago y son esenciales en el tratamiento de
pacientes con desrdenes estomacales o problemas de
la mucosa intestinal, as como en lactantes con sindromes de malabsorcin-malnutricin, con cuadros alergnicos en la mayora de los casos (6).
Las caractersticas que deben cumplir estos hidrolizados de protenas para formar parte de una dieta
enteral son: no producir desequilibrios osmticos ni
alergias, presentar un alto valor nutritivo, no muy
inferior al de la protena de partida y tener un sabor
aceptable.
El grado de hidrlisis es la propiedad fundamental
de un hidrolizado y va a determinar en gran medida
las restantes caractersticas del mismo y por tanto su
posible uso. Se define como el porcentaje de enlaces
peptdicos rotos en relacin a la protena original. El
grado de hidrlisis final est determinado por las condiciones utilizadas, siendo stas, la concentracin de
sustrato, la relacin enzima/sustrato, el tiempo de
incubacin y las condiciones fisicoqumicas tales como
el pH y la temperatura. Otro factor que tambin va a
determinar el grado de hidrlisis es la naturaleza de la
enzima, caracterizada por su actividad especfica y tipo
de actividad. As, la naturaleza de la enzima usada no
slo va a influir en el grado de hidrlisis, sino tambin
en el tipo de pptidos producidos.
Los hidrolizados que se producen para su uso en
alimentacin se pueden agrupar en: hidrolizados con
bajo grado de hidrlisis, entre el 1% y el 10%, para la
mejora de las propiedades funcionales; hidrolizados
con grados de hidrlisis variable para su uso como
saborizantes y por ltimo, hidrolizados extensivos, con
grado de hidrlisis superior al 10%, para su uso en alimentacin especializada.
HIDRLISIS ENZIMTICA DE PROTENAS
La hidrlisis proteica se realiza normalmente en un
reactor, con control de agitacin, pH, temperatura y
tiempo del proceso. El sustrato se disuelve o resuspende en agua hasta que el pH y la temperatura se estabi-

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

lizan; a continuacin se agrega la proteasa dando inicio

a la hidrlisis. A medida que sta progresa se produce
una disminucin del pH debido a la rotura de los enlaces peptdicos. En los casos de hidrlisis enzimtica el
pH debe ser mantenido en el ptimo de la enzima
mediante la adicin de base diluida. Para finalizar la
hidrlisis proteica la enzima puede ser inactivada con
calor, mediante una disminucin del pH o con una
combinacin de ambos. O tambin puede ser retirada
del medio mediante filtracin y la protena finalmente
precipitada.
SUSTRATOS
El material de partida utilizado para la obtencin
de los hidrolizados proteicos puede ser de origen animal, vegetal o bacteriano.
Entre los vegetales, los ms usados son las protenas
de soja, trigo y arroz, principalmente en pases desarrollados. De los sustratos de origen animal se emplea
el pescado, principalmente en pases orientales, como
Japn o Corea. Tambin se han aprovechado las protenas de residuos crnicos como tendones o huesos y
de microorganismos, como algas.
Para la eleccin de una fuente protenica adecuada
debe tenerse en cuenta el uso que vaya a tener el hidrolizado, as como el valor agregado del producto final
con respecto al sustrato inicial. Por ejemplo, para la
obtencin de hidrolizados con propiedades gelificantes
y emulsificantes se suelen emplear colgeno y gelatina
por su capacidad para formar geles transparentes (7).
Tambin se ha extendido el uso para este fin de protenas de huevo, de carne, de sangre, de vsceras e incluso de cereales. Como fuente de fermentacin para el
crecimiento de microorganismos, se emplean los
hidrolizados de levaduras o casena: stas tambin son
las fuentes cuando los hidrolizados se usan en cosmtica. Cuando la finalidad del hidrolizado es su uso como
fuente de nitrgeno, se usan protenas de pescado y
protenas microbianas en alimentacin animal, y protenas de soja y lcteas en alimentacin humana, siendo estas ltimas, especialmente las protenas del lactosuero, la materia prima ideal para la preparacin de
alimentos infantiles y dietas enterales (2)(8-12).
Ya en la reaccin propiamente dicha, la secuencia
de aminocidos y la estructura tridimensional de la protena afectan su sensibilidad hacia el ataque proteoltico y el tipo de pptidos formados durante la hidrlisis.
Las casenas son protenas algo ms flexibles y son adems, fcilmente hidrolizadas. Las protenas del suero
por el contrario, son protenas globulares, difciles de
acceder para las enzimas proteolticas. Esta digestibilidad puede ser mejorada por una desnaturalizacin por
calentamiento previo. Otra diferencia importante
entre protenas es su estructura primaria. En protenas
de suero los aminocidos hidrofbicos e hidroflicos

Hidrolizados de protena

estn aleatoriamente distribuidos sobre la protena,

mientras las casenas contienen dominios hidroflicos e
hidrofbicos distintos. La hidrlisis de las protenas
con diferente distribucin de aminocidos hidrofbicos y grupos cargados producir pptidos que difieren
en la distribucin de grupos hidrofbicos e hidroflicos. En un estudio de hidrolizados de -lactoglobulina
y -casena se demostr que los pptidos obtenidos de
hidrlisis de la -lactoglobulina mostraron distribuciones similares de cargas y grupos hidrofbicos, careciendo de reas distintas de hidrofbicos o hidroflicos.

229

Por el contrario, la casena produjo pptidos que difieren en la distribucin de la carga y de los aminocidos
hidrofbicos en su secuencia (13-15).
PROTEASAS COMERCIALES
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente muchas proteasas grado-alimenticio (Tabla I).
Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su origen,
(animal, vegetal, bacteriano o fngico), por su modo
de accin cataltica (endo- o exo-actividad) o con base

Tabla I. Algunas de las proteasas disponibles comercialmente en grado alimenticio (15)(18).

Tipo de proteasa

Fuente

Nombre

Temp. (C)

Intervalo
de pH

Sitio de accin
catalitica

Porcino, bovino

30-60
45-55

7-9
8-9

Substilisin. Carlsberg,
Alcalasa
Subst. BPN,
Substilisin Novo

Bacillus licheniformis

50-60

6-8
6-10

-*Lis (o Arg) ---*Trp (o Tir, Fe,

Leu) ---*Ala----

Bacillus
amyloliquefaciens

40-55

6-10

Papana
Bromelaina
Ficina

Papaya
Pia
Ltex de Ficus

40-75
20-65

5-8
5-8
5-8

-*Fe (o Val, Leu)AAhf ---

Pepsina
Quimosina
Aspergilopeptidasa A
Newlasa

Porcino, bovino
Becerro
Aspergillus saitoi
Rhizopus sp.

1-4
4-6
2-5
3-6

-Fe (o Tir, Leu)*-Trp

(o Fe, Tir)
Glu, Asp, Leu *--Similar a la pepsina

Carboxipeptidasa A

Pncreas

Neutrasa
Termolisina

Bacillus amyloliquefaciens
B. thermoproteolyticus

Papana cruda

Fruto de la papaya

Pancreatina

Pncreas (bovino y
porcino)

Veron P, Sumicina LP,

Biocina A

Aspergillus oryzae

Pronasa

Streptomyces griseus

Serinproteasa
Tripsina
Quimotripsina
Animal

Bacteriana

Elastasa

-*AAhf----

Cisteinproteasas

Plantas

Aspartato proteasas
Animal
Fngica

35-50
40-50

Metalo proteasas
Animal
Bacteriana
Preparaciones enzimticas
Mezcla de papana,
quimopapana y lisozima.
Mezcla de tripsina,
quimiotripsina, elastasa y
carboxipeptidasa.
Mezcla de serin-, aspartatoy metalo- proteasas.
Mezcla de endo- y exoproteasas, actividad en pH
alcalino y neutro.

6-7,5
7-9

*Carbonilo del AA
terminal del pptido,
excepto Pro, Arg, Lis
-Fe, Leu, Val*---Ile, Leu, Val, Fe*---

5-9

Amplia especificidad

30-80

7-9

Muy amplia especificidad

40-55

4-8

Muy amplia especificidad

7-9

Muy amplia especificidad

7-8
40-55

* Indica sitio de accin de la proteasa sobre el sustrato.

AAhf Indica AAs hidrofbicos.

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

230

Bentez R et al.

en su sitio cataltico. Las endoproteasas hidrolizan

enlaces amdicos dentro de la cadena de la protena.
Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminocidos terminales de las protenas o pptidos. La naturaleza del centro cataltico de las proteasas difiere de
acuerdo con los aminocidos y otros ligandos que
intervienen en la formacin del complejo enzima-sustrato. El centro activo contiene aminocidos o bien
cationes metlicos que promueven la catlisis, denominndose serinproteasas, cisteinproteasas, aspartato
proteasas, segn intervengan los aminocidos serina,
cistena o cido asprtico. En las metalo-proteasas la
actividad est promovida por un catin metlico, siendo el ms frecuente el znc (16). Todas las serinproteasas tienen actividad endo. Contrariamente, las metalo-proteasas son sobre todo exo-proteasas (17).
Las primeras enzimas proteolticas utilizadas en la
industria alimentaria fueron proteasas pancreticas de
origen animal, si bien cada vez estn adquiriendo mayor importancia las de origen bacteriano o fngico. En
la Tabla I se presentan algunas de las proteasas comerciales de grado alimentario disponibles en el mercado
y se indica la especificidad de parte de ellas. Los preparados enzimticos suelen ser mezclas de estas enzimas
y normalmente se venden en estado lquido o como
polvos.
ETAPAS DE LA HIDRLISIS ENZIMTICA
La hidrlisis proteoltica no se desarrolla en una
sola reaccin. Se trata de un conjunto de reacciones
simultneas de ruptura de enlaces, con distintas especies cargadas en equilibrio, lo que da una gran complejidad a este tipo de procesos.
Se propone un proceso de hidrlisis constituido
por tres reacciones consecutivas. Primero, la formacin de un complejo enzima-sustrato (protena), y despus la rotura del enlace amdico dando como resultado la liberacin de un pptido. Finalmente, el
pptido restante se separa de la enzima despus de un
ataque nucleoflico de una molcula de agua. El proceso puede reiniciarse sobre los dos nuevos pptidos o
sobre uno solo de ellos. Estos tres pasos se representan
esquemticamente en la Figura 1.
H2O

k-1
E+S

ES
k1

EP + H-P
k2

E + P-OH+ H-P

el interior de la protena y no son accesibles para la

enzima, por esto, se considera que para protenas globulares es necesario efectuar la desnaturalizacin de la
protena antes de proceder a hidrolizarla, ya que despus de la desnaturalizacin estarn expuestos ms
enlaces peptdicos. En solucin, las protenas en estado plegado (nativo) y no plegado (desnaturalizadas)
estn en equilibrio. Solamente las molculas no plegadas son susceptibles a degradacin por enzimas proteolticas, como se representa esquemticamente en la
Figura 2.
V-0

E
Desnaturalizada

Nativa
V+0

E
Intermedios

V1

V2

Productos
finales

v: velocidades de reaccin, E: enzima

Figura 2. Teora de Linderstrm-Lang (17)

Si la velocidad de desnaturalizacin (v0 = v+0-v-0) es

menor que v1, la etapa de desnaturalizacin es la etapa
limitante de la velocidad de hidrlisis y cada protena
desnaturalizada ser rpidamente hidrolizada hasta
los productos finales. El hidrolizado resultante, adems de contener ambas protenas intactas, contendr
los productos finales, aunque sern deficientes en pptidos de tamaos intermedios. Este tipo de reaccin
est designada como una reaccin en etapas sucesivas. Si, adems, la desnaturalizacin de la protena es
ms rpida que la hidrlisis (v1<v0), las molculas de la
protena sern degradadas a intermedios pero posteriormente son degradadas lentamente en productos
finales. Este tipo de reaccin es llamada de cremallera, obtenindose un hidrolizado que contiene principalmente pptidos de tamao intermedio. Ambos
mecanismos de hidrlisis estn implicados en la mayora de las reacciones proteolticas (18).
Si la protena se desnaturaliza irreversiblemente antes de la hidrlisis, el nmero de enlaces de pptidos
disponibles se incrementa notablemente y la degradacin de la protena debera proceder de acuerdo con
un tipo de reaccin cremallera. Para estas protenas
desnaturalizadas otros factores tales como la disminucin de la solubilidad media influyen en la velocidad
de reaccin inicial (18).

k3

E: enzima, S: sustrato, P, P: pptidos resultantes, kx: constante velocidad de

reaccin.

Figura 1. Mecanismo cataltico de una proteasa (16).

Para la hidrlisis de protena, la unin sustrato-enzima es esencial. En el caso de protenas globulares, la

mayora de los enlaces peptdicos estn localizados en

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

CONDICIONES DE LA HIDRLISIS
Debe establecerse la relacin [protena]/[proteasa] una vez que se ha efectuado un posible pretratamiento de la protena si es necesario. A continuacin
deben ser definidas las condiciones de la reaccin del
proceso de hidrlisis. Las principales variables que determinan el resultado de la reaccin son temperatura,

Hidrolizados de protena

pH, relacin enzima-sustrato y el tiempo de reaccin.

Los primeros 3 factores determinan la velocidad de
reaccin y pueden influir en la especificidad de la enzima. El tiempo de reaccin solamente determina el
grado final de hidrlisis (18). Los efectos interactivos
entre los parmetros de la hidrlisis tambin influyen
en la composicin del hidrolizado. Si el proceso de hidrlisis no se controla, el pH de la solucin cambiar
despus del inicio de la hidrlisis debido a la formacin de grupos aminos nuevos, los cuales son capaces
de liberar o aceptar protones, dependiendo del pH
de la hidrlisis. A un pH bajo todos los grupos amino
estn protonados y solamente parte de los grupos carboxilo estn desprotonados, resultando en una captacin neta de protones por cada enlace peptdico roto,
causando un incremento del pH. A pH neutro y alcalino la hidrlisis resulta en una disminucin de pH,
pues todos los carboxilos estn desprotonados y solamente parte de los grupos amino estn protonados.
Con el fin de prevenir un cambio de pH durante la hidrlisis, la reaccin debera llevarse a cabo en un sistema buffer o en un sistema de pH-stat en el cual el pH
se fija en el valor deseado. En este laboratorio las reacciones con la enzima neutrase de Novozymes, se efectan en un biorreactor Minifors, de la empresa Infors
HT - Bottningen, Suiza, con control y regulacin automtica del pH, lo que permite que la enzima siempre acte en el valor ptimo de pH determinado y el
clculo final de base o cido consumido durante el
proceso, pueda traducirse en el clculo del grado de
hidrlisis, como se ver ms adelante.
Hasta el presente, los estudios efectuados sobre
cintica de la hidrlisis han sido escasos, aplicndose
en general la cintica de tipo Michaelis-Menten
(19)(20) que es demasiado simple para representar el
mecanismo de la hidrlisis de protenas, o bien cinticas empricas con 3-5 parmetros de ajuste lo que limita su aplicabilidad (21).

231

Caracterizacin del hidrolizado

Debido a la hidrlisis, las propiedades moleculares
de las protenas cambian, producindose la disminucin del peso molecular, el aumento de la carga y la
liberacin de grupos hidrofbicos, entre otros fenmenos (22). Estos cambios moleculares pueden ser
detectados con varios mtodos analticos, los cuales
reflejan una o varias propiedades fisicoqumicas de las
molculas (Fig. 3). Como resultado de los cambios
moleculares, las propiedades funcionales de las protenas se ven afectadas (Fig. 3). Aunque el trmino propiedad funcional con frecuencia se aplica solamente
para indicar propiedades tecno-funcionales de los
hidrolizados, esto debera tambin abarcar propiedades bio-funcionales, las cuales pueden ser subdivididas
en nutricionales y fisiolgicas o funcionalidad biolgica (23). Las propiedades nutricionales de la hidrlisis
reflejan por ejemplo su digestibilidad aumentada y
alergenicidad disminuida cuando se las compara con
las protenas parentales. Las propiedades fisiolgicas
abarcan bio-actividades potenciales del hidrolizado,
las cuales se originan de la liberacin de pptidos bioactivos. Finalmente, las propiedades tecno-funcionales
representan funcionalidad tecnolgica, tales como
solubilidad, propiedades emulsificantes y espumantes
(Fig. 3).
El parmetro ms usado para describir el resultado
de un proceso de hidrlisis es el grado de hidrlisis
(DH). Otro parmetro importante para la hidrlisis
de protena es la distribucin del peso molecular de
los pptidos en los hidrolizados. Para esto se emplean
tcnicas como SDS-PAGE (24) o cromatografa de
exclusin por tamao (20)(25)(26). Estas tcnicas se
usan frecuentemente para comparar la accin hidroltica de varias proteasas, o para caracterizar hidrolizados hipoalergnicos. Finalmente, los hidrolizados

Caracterizacin Molecular

Propiedades moleculares alteradas

Grado de hidrlisis
Distribucin de peso molecular
Perfil cromatogrfico
Tensin superficial (hidrofobicidad)

Carga
Peso molecular
Exposicin de:
Grupos hidrofbicos
Grupos R (AA-cadena lateral)

Tecno-funcionales
Solubilidad
Emulsin
Espuma
Gusto

Propiedades funcionales
Bio-funcionales
Nutricional
Fisiolgica
Digestibilidad
Bioactividad
Hipoalergenicidad
Inhibicin ACE
Actividad antimicrobiana
Biodisponibilidad

ACE: Enzima convertidora de angiotensina.

Figura 3. Cambios en las caractersticas de la protena debido a la hidrlisis.

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232

Bentez R et al.

se caracterizan ocasionalmente mediante cromatografa de fase reversa (20)(24), la cual detalla campos de
informacin acerca de la complejidad de los hidrolizados. Sin embargo, la comparacin directa de hidrolizados es difcil con los perfiles que determina esta
tcnica cromatogrfica (27).
A continuacin se describen las ventajas y limitaciones de los mtodos ms usados en la hidrlisis de protenas para el control del proceso y caracterizacin de
los hidrolizados obtenidos.
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Cuando se requiere determinar la actividad proteoltica de una enzima, uno de los ensayos ms empleados es el mtodo de Anson. En este mtodo, se hidroliza hemoglobina desnaturalizada con la proteasa
deseada a pH 7.5, temperatura de 25 C durante 10
min. La hemoglobina que no se hidroliz se precipita
con cido tricloroactico (TCA) y al sobrenadante,
despus de filtrado, se le aade reactivo fenlico de
Folin-Ciocalteu que produce una coloracin azul con
tirosina, triptfano y en menor grado con cistina, cistena e histidina. La absorbancia se mide a 750 nm.
Para obtener la lnea de calibrado se utiliza una proteasa de actividad Anson conocida, usualmente tripsina
pancretica, que se somete al mismo ensayo que la
proteasa problema (28).
GRADO DE HIDRLISIS
El grado de hidrlisis es el parmetro clave para el
seguimiento y control de las reacciones de hidrlisis
de protenas. Representa la proporcin de enlaces
peptdicos hidrolizados sobre el nmero total de enlaces. Se calcula de acuerdo con la ecuacin 1, donde h
es el nmero de enlaces peptdicos hidrolizados y htot
el nmero total de enlaces peptdicos presentes en la
protena nativa. Ambos h y htot son expresados en
meq/g (18).
DH = (h/htot ).100%

[1]

Los mtodos para medir el DH se basan en: la

determinacin de los grupos -amino libres, la determinacin de nitrgeno soluble tras precipitar la protena con cido tricloroactico y la valoracin del protn liberado tras la ruptura de un enlace peptdico a
determinados valores de pH.
DETERMINACIN DE LOS GRUPOS -AMINO
LIBRES
La cantidad de grupos -amino liberados puede ser
medida usando reactivos que reaccionen especficamente con grupos amino, produciendo derivados que

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

pueden ser detectados espectrofotomtricamente. Para

ello puede utilizarse la valoracin con formol (29), aunque el gran nmero de interferencias que presenta este
mtodo lo desaconsejan en el caso de los hidrolizados
de protenas. Tambin se utilizan reactivos como ninhidrina, ortoftaldialdehdo (OPA) y cido trinitrobencenosulfnico (TNBS), que reaccionan con los grupos
amino libres.
La tcnica ms antigua es la de reaccin con ninhidrina, de gran sensibilidad, que presenta el inconveniente de la larga duracin de los ensayos y la interferencia del amonio, adems de dar como resultado
valores mucho ms bajos de DH, cuando se compara
con OPA y TNBS, los cuales correlacionan bien (30).
El mtodo del TNBS (7), que se basa en la reaccin de
grupos amino primarios con el cido trinitrobencenosulfnico, ha sido utilizado por diferentes autores para
el anlisis de hidrolizados de protenas (31). Despus
de la incubacin de las muestras con tiempos entre 15
y 60 minutos y a temperaturas entre 30 y 50 C se mide
la absorbancia a 420 nm. Entre los inconvenientes de
este mtodo pueden mencionarse la inestabilidad del
reactivo, el riesgo de explosin, el alto valor de los
blancos, la contaminacin del reactivo con cido pcrico, la interferencia de azcares reductores y amonio,
la no reactividad de prolina e hidroxiprolina as como
la alteracin de los resultados por la reaccin de los
grupos -amino de lisina con el reactivo. Algunos
autores prefieren el mtodo de la OPA al mtodo de
TNBS tanto por su rapidez como por su seguridad. Sin
embargo, estos autores midieron el derivado de la
OPA por absorcin UV inmediatamente despus de la
adicin de los reactivos. Posteriores investigaciones
demostraron que la absorcin de la OPA fue estable
solamente durante 20 min. Adems, este mtodo tiene
el inconveniente de no reaccionar con prolina y slo
parcialmente con cistena (30).
DETERMINACIN DE NITRGENO SOLUBLE
En este caso las tcnicas ms usuales son el mtodo
Kjeldhal, la reaccin de Biuret o la determinacin
espectrofotomtrica en la regin UV de pptidos con
grupos aromticos. En este laboratorio se ha empleado el mtodo de Dumas, que consiste en la oxidacin
del compuesto con CuO, con lo que el nitrgeno de la
muestra pasa a nitrgeno gas (N2), midindose el
volumen desprendido, con buena correlacin contra
otros mtodos espectrofotomtricos (29)(32).
DETERMINACIN DE LOS PROTONES LIBERADOS
MEDIANTE POTENCIOMETRA
Algunos autores monitorean el DH adicionando
una base (o un cido, dependiendo del pH inicial de
la hidrlisis), para mantener el pH de la hidrlisis

Hidrolizados de protena

constante. La cantidad de base empleada es proporcional al DH. Sin embargo, este consumo no est relacionado de una forma simple con el grado de hidrlisis alcanzado, siendo necesario para establecer esta
relacin el conocimiento del pK medio de los grupos
-amino liberados en la hidrlisis (18)(33). El mtodo
slo es aplicable a la hidrlisis enzimtica de protenas
a pH neutro, alcalino o fuertemente cido (pH3) y
puede ser realizado de forma sencilla y precisa (34).
DETERMINACIN DE LA DISTRIBUCIN
APARENTE DE PESO MOLECULAR
Una vez determinado el DH, puede estimarse la distribucin y el promedio de la longitud de la cadena
peptdica (PCL) de los hidrolizados (ecuacin 2), asumiendo que todos los hidrolizados son solubles (18).
PCL = 100/%DH

[2]

La longitud de la cadena peptdica est relacionada

con el promedio del peso molecular de los pptidos
en los hidrolizados. Sin embargo, los hidrolizados con
PCL similar podran tener pptidos de distribuciones
de peso molecular sustancialmente diferente.
La distribucin de tamaos de los pptidos de un
hidrolizado puede ser til para predecir la capacidad
antignica del mismo, as como para mostrar diferencias en la actuacin de distintos pretratamientos del
sustrato o enzimas utilizadas. Normalmente se utilizan mtodos cromatogrficos o electroforticos para
este fin.
La electroforesis en gel, SDS-PAGE (gel de dodecil
sulfato de sodio-poliacrilamida) ha sido la tcnica ms
utilizada para la caracterizacin de hidrolizados y protenas a pesar de sus limitaciones en la separacin de
pptidos de peso molecular bajo (22). La cromatografa de exclusin por tamao (SEC) con columnas de
Sephadex G-25 o G-50, ha sido el mtodo elegido por
diferentes autores. En este mtodo las molculas son
separadas principalmente con base al volumen hidrodinmico, el cual depende del tamao y conformacin
de las molculas. Desafortunadamente, la separacin
tambin est influenciada por interacciones no especficas entre componentes proteinceos y el material de
la columna, como interacciones in-hidrofbico. Estas
interacciones dependen de la eleccin de eluentes y
del material de la columna (35-37). El efecto de las
interacciones no especficas en el clculo aparente de
la distribucin de tamao molecular (MWD) puede ser
reducido por inclusin de un gran nmero de pptidos para calibracin que difieren en sus propiedades
moleculares. Sin embargo, el mtodo que mejores
resultados ha dado, por su mayor resolucin y ms fcil
cuantificacin, ha sido la cromatografa lquida de
exclusin, SE-HPLC, con columnas de gel TSK (38).

233

Otro mtodo cromatogrfico, a menudo usado en

los anlisis y separacin de protenas hidrolizadas, es
la cromatografa de fase reversa (RPC). La caracterstica ms importante para la separacin en RPC es la
diferencia en hidrofobicidad entre aminocidos. Para
pptidos pequeos (<15 residuos), la hidrofobicidad
de las cadenas de aminocidos en los pptidos determina el tiempo de elucin de la columna de fase
reversa (39-41). Sin embargo, para pptidos grandes,
la longitud del pptido tambin influye en el tiempo
de retencin (41)(42). Generalmente, la resolucin
de la cromatografa en fase reversa es mejor que la de
la cromatografa de exclusin. Sin embargo es ms
difcil relacionar los resultados con las propiedades
moleculares de los hidrolizados, pues varias caractersticas, como la longitud de los pptidos, la composicin de aminocidos y la presencia de reas hidrofbicas influyen en el tiempo de retencin y por tanto
en el perfil cromatogrfico.
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE PPTIDOS Y
AMINOCIDOS
Una correcta separacin e identificacin de los
pptidos de un hidrolizado de protenas complementara la informacin dada por la determinacin del
grado de hidrlisis y la distribucin en pesos moleculares, y ayudara a un mejor conocimiento de la composicin del producto.
La electroforesis (SDS-PAGE) y los distintos mtodos cromatogrficos (fase reversa, RP-HPLC; exclusin, SE-HPLC; filtracin en gel, cambio inico) han
sido las tcnicas ms empleadas en la separacin de
pptidos y aminocidos, mientras que para la identificacin de los mismos, despus del fraccionamiento, se
ha utilizado generalmente espectrometra de masas,
cromatografa de gases, anlisis de secuencias o determinacin de aminocidos (43)(44). Lemieux y Amiot
(45)(46) evaluaron las distintas tcnicas empleadas
para la separacin de pptidos, concluyendo que la
cromatografa lquida de exclusin, SE-HPLC, es la
tcnica que mayor informacin aporta sobre la composicin del hidrolizado, ya que es el volumen molecular el criterio de separacin empleado, y no el estado de ionizacin, la carga o la hidrofobicidad de los
pptidos como en otras tcnicas, que no obstante pueden ser complementarias. Tambin pusieron de
manifiesto la ineficacia de los distintos mtodos en la
separacin de pptidos de peso molecular inferior a
1.000 Da. En este sentido, el desarrollo de nuevas tcnicas capaces de separar y cuantificar los pptidos de
PM inferiores a 1.000 Da puede ser importante, especialmente si el hidrolizado se va a utilizar en la formulacin de dietas enterales, en cuyo caso debe estar
constituido fundamentalmente por di- y tripptidos
(45)(46).

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

234

Bentez R et al.

PROPIEDADES TECNO-FUNCIONALES
Los cambios de las caractersticas moleculares que
ocurren durante la hidrlisis de la protena pueden dar
lugar al comportamiento tecno-funcional modificado
del hidrolizado cuando se lo compara con la protena
intacta, por ejemplo solubilidad alterada, viscosidad,
caractersticas sensoriales, emulsin y caractersticas de
la espuma (22)(47).
SOLUBILIDAD
En el punto isoelctrico (pI) de la protena, la solubilidad generalmente aumenta con la hidrlisis, ya que
es principalmente el resultado de la reduccin en peso
molecular y del aumento en el nmero de grupos polares (22)(48). El efecto de la hidrlisis sobre la solubilidad a otros valores de pH depende de la protena estudiada. Los caseinatos por ejemplo, son muy solubles en
los valores de pH sobre y debajo del pI (pH 4-5) (49).
Para la protena del suero, que es algo menos soluble
que la casena, excepto en el pI, se ha observado un
aumento de solubilidad con hidrlisis en la gama entera de pH (50)(51).
SABOR AMARGO
Un efecto secundario negativo importante de la hidrlisis de la protena es la liberacin de los pptidos
generalmente con sabor ms amargo que la protena
nativa (7). Se ha demostrado que el sabor amargo de los
pptidos puros, a pesar de depender de la fuente de
protena y de la especificidad de la enzima, est relacionado con la presencia y posicin de aminocidos hidrofbicos en los pptidos del hidrolizado. (52)(53). Se
han propuesto varios mtodos analticos para predecir
el sabor amargo de los hidrolizados. Adler-Nissen (34)
postula el aislamiento de pptidos hidrofbicos extrados con butanol en los que a travs de la determinacin
de la hidrofobicidad y del peso molecular medio de estos pptidos, podra predecirse el grado de sabor amargo. Tambin se han utilizado parmetros qumicos (54)
y a travs de la espectroscopa infrarroja (55) podra
predecirse el grado de amargor.
EMULSIONES Y ESPUMA
Las caractersticas de la emulsin y de formacin de
espuma de la protena y de los hidrolizados de la protena dependen del pH del sistema y de la enzima
empleada para la hidrlisis. Chobert (56), divulga la
mejora en la emulsin y formacin de espuma para los
hidrolizados trpticos de la casena, que est de acuerdo con los resultados encontrados por otros autores.
La formacin y estabilizacin de la espuma y las emulsiones deben ser medidas por separado (1)(4)(57-59).
Dentro de las tcnicas, se determinan el ndice de

Acta Bioqum Cln Latinoam 2008; 42 (2): 227-36

actividad de la emulsin (EAI) que mide la turbiedad

de las emulsiones con cierta fraccin de aceite, mientras que la capacidad de emulsionar (EC) determina la
cantidad de aceite que se puede dispersar por cierta
cantidad de protena o de hidrolizado. Aunque ambos
mtodos se utilizan para cuantificar la capacidad de
formacin de emulsin y formacin de espuma de los
hidrolizados, no miden realmente las mismas caractersticas (60).
AGRADECIMIENTO
Los autores agradecen al Ministerio del Medio Ambiente Espaol, Expediente 521/2006/3-8.2, por la financiacin del proyecto de investigacin.
Ricardo Bentez agradece a COLCIENCIAS - Colombia por el financiamiento para su programa doctoral.

CORRESPONDENCIA
RICARDO BENTEZ B.
rbenitez@unicauca.edu.co
rbenitez@tecal.udl.cat
Calle 5 # 4 - 70 POPAYN - Colombia
Tel: 0057 2 8209800 EXT 2334 - 2320
Fax: 0057 2 8209800 EXT 2306.
JORDI PAGAN i GILABERT
jpagan@tecal.udl.cat
Av. Alcalde Rovira Roure, 191
25198 LLEIDA Espaa
Tel : 0034 - 973702817
Fax : 0034 973702596 -973238264
Para solicitud de separatas:
Jordi Pagan i Gilabert
jpagan@tecal.udl.cat

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