CROMATOGRAFA EN PLACA FINA

Fundamento
La cromatografa en capa fina (en ingls thin layer chromatography o TLC) es una
tcnica analtica rpida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Qumica
Orgnica. Entre otras cosas permite:
- Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar as, por
ejemplo, la efectividad de una etapa de purificacin.
- Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podran ser idnticas. Si,
por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia.
- Realizar el seguimiento de una reaccin. Es posible estudiar cmo desaparecen los
reactivos y cmo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuando
la reaccin ha acabado.
La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lmina de plstico o
aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase
estacionaria). Entonces, la lmina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o
varios disolventes mezclados (eluyente o fase mvil). A medida que la mezcla de
disolventes asciende por capilaridad a travs del adsorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el
adsorbente.
Adsobentes y eluyentes
Los dos adsorbentes (fase estacionaria) ms ampliamente utilizados son la gel de
slice (SiO2) y la almina (Al2O3), ambas de carcter polar. La almina anhidra es el
ms activo de los dos, es decir, es el que retiene con ms fuerza a los compuestos;
por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos,
haluros de alquilo, teres, aldehidos y cetonas). La gel de slice, por el contrario, se
utiliza para separar sustancias ms polares (alcoholes, aminas, cidos carboxlicos). El
proceso de adsorcin se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o
enlaces de hidrgeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte
con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposicin. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interaccin
dipolo-dipolo o mediante enlace de hidrgeno si lo presentan.

.
El orden de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la
fase mvil o eluyente. El eluyente puede ser un disolvente nico o dos miscibles de
distinta polaridad. En el siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza
eluyente los disolventes ms comunmente empleados.
Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona
< 2-propanol <metanol < agua
En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullicin y
viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un
disolvente ms polar que el metanol. Usualmente se emplea una mezcla de dos
disolventes en proporcin variable; la polaridad de la mezcla ser el valor promediado
en funcin de la cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idneo para cada
caso ha de encontrarse por "el mtodo del ensayo y del error".
Determinacin del Rf

La retencin se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el

soluto a separar y la fase mvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase
estacionaria. As, las molculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase
estacionaria y a medida que se produce la elucin van siendo desplazadas por la fase
mvil. La retencin y la selectividad en la separacin dependen de los valores
respectivos de las constantes de los diferentes equilibrios qumicos que tienen lugar,
que estn en funcin de:
- la polaridad del compuesto, determinada por el nmero y naturaleza de los grupos
funcionales presentes. Los solutos ms polares quedarn ms retenidos puesto que
se adsorben ms firmemente a los centros activos de la fase estacionaria, mientras
que los no polares se eluirn con mayor facilidad.
- naturaleza del disolvente. As, para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad
del disolvente facilita su desplazamiento en la placa.
La relacin entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el
origen de la placa se conoce como Rf, y tiene un valor constante para cada compuesto
en unas condiciones cromatogrficas determinadas (adsorbente, disolvente, tamao
de la cubeta, temperatura, etc.). Debido a que es prcticamente imposible reproducir
exactamente las condiciones experimentales, la comparacin de una muestra con otra
debe realizarse eluyendo ambas en la misma placa.
Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresin:
Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)

La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si sta

es excesivamente grande se obtendr un valor errneo del Rf.
Se recomienda elegir un eluyente en el que los componentes de la mezcla presenten
un Rf medio entorno a 0.3-0.5. Para compuestos poco polares, se debe utilizar un
disolvente apolar como el hexano. En el caso de compuestos con polaridad media, se
aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de etilo en distintas proporciones. Los
productos ms polares, requieren disolventes ms polares como mezclas de
diclorometano/ metanol en distintas proporciones.
Revelado de las placas La mayor parte de las placas de cromatografa llevan un
indicador fluorescente que permite la visualizacin de los compuestos activos a la luz
ultravioleta (254 nm). El indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia
de un compuesto activo en el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en la
que se encuentra el producto, y el resultado es la visualizacin de una mancha en la
placa que indica la presencia de un compuesto.
En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualizacin (o revelado) del
cromatograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los
productos adsorbidos proporcionando compuestos coloreados.
Procedimiento
En esta prctica se llevar a cabo la cromatografa en placa fina de tres compuestos
orgnicos,
cido benzoico, 4-aminobenzoato de etilo y 9-fluorenona.

En tres viales diferentes disolver una pequea cantidad de las muestras en acetato de
etilo.
Con ayuda de una micropipeta de vidrio se depositan unas gotas de estas disoluciones
en la placa de cromatografa, a cierta distancia del borde.
Tras dejar evaporar el disolvente de la placa, sta se deposita dentro de una cubeta de
cromatografa, a la que previamente se ha aadido una pequea cantidad del eluyente
deseado. Hay que tener cuidado de que el nivel de eluyente est por debajo del punto
donde ha sido "pinchado" el producto (Figura c).
Se tapa la cubeta y se deja que el eluyente ascienda por capilaridad.
Antes de que el frente del disolvente llegue al otro extremo de la placa, sta se saca
de la cubeta con unas pinzas y con un lpiz se hace una seal indicando hasta dnde
ha llegado el eluyente (Figura d).
Tras dejar evaporar el disolvente de la placa, revelar la placa mirando en el visor de
UV.
Se hacen placas diferentes con distintos eluyentes tal como se indica en la cuestin 7,
estudiando las muestras de: F (fluorenona), A (amina) y B (benzoico). Se dibujan las
placas en el esquema de la cuestin 7 y se anotan los valores de Rf que se miden
sobre las placas.
Una vez que se ha encontrado el eluyente adecuado para ver las muestras separadas,
se estudia una muestra problema (MP) para averiguar los componentes que tiene, que
pueden ser uno o varios de los compuestos F, A, B utilizados en la prctica, siguiendo
el esquema de la cuestin 13.
Introduccin
La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de
vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro
para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen
las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las
placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase
estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general
menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se
desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo
aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas
Ventajas de la cromatografa en capa fina
La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros
mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya
que el utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para
conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel
destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son
fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para
fines analticos.

Adsorbentes
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de
las partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor
ser su adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un
adherente (yeso,...). Algunos de los adsorventes ms utilizados son:
Celulosa
Almidn
Azucares
Gel de slice (silicagel)
xido de aluminio (almina)
Carbn activo (carbn en polvo)
Kieselguhr
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de
plantas y animales.
-Silicagel
El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es dbilmente
cido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deber utilizar con
sustancias que se corrompan con los cidos. Los geles de slice normales
suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor tambin se
debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamao del
grano suele ser de 10 a 40 micras () y el tamao de poro vara de 20 a
150.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de
clcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin
han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por
separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de slice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos
para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar
componentes lipfilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas
liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografa de fase
reversa (silanizado).
-Almina
La almina u xido de aluminio es un adsorbente ligeramente bsico debido
a que en el proceso de extraccin de la almina a partir de la bauxita
quedan algunas molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina,
dndole a sta un carcter bsico. No consigue un desarrollo tan alto de la
sustancia depositada como el gel de slice.
La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas
cidas, bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores
ultravioletas. Es un adsorbente de carcter polar, de tal forma que retendr
con mayor avidez a los componentes polares.
Preparacin de placas.
El adsorbente se desle en agua destilada. Para mezclar la papilla
homogneamente es preferible agitar de modo mecnico. La proporcin de
adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y
una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante,
habrn de consultarse la instrucciones del fabricante.
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de
vidrio, pero en la actualidad tambin se utilizan lminas de otros
compuestos orgnicos ms flexibles. Dependiendo del tipo de separacin
que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizar un tamao de placa u
otro. En general para realizar una separacin preparativa de un gramo de
muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de
adsorbente y 80 ml. de agua destilada.

Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la

adicin de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para
mantener el pH deseado. En la preparacin de las placas tambin se pueden
adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.
Cabe destacar la adicin de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le
denomina argentacin, y se utiliza para separar componentes insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa,
en general suele ser de:
0.1-0.2 mm. para separaciones analticas.
0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al
desarrollo del proceso cromatogrfico. Para ello existen en el
mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecnica placas
homogneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el proceso
a seguir es el siguiente:
Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.
Agitar enrgicamente.
Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo
despus de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metlicas. En este
momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas
reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentndolas durante
30-60 minutos a 105-110 C (las placas de celulosa no deben calentarse
ms de 10 minutos a 105 C) para expulsar as el aire. Es conveniente dejar
secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se
produciran por efecto del cambio de temperatura.
Aplicacin de las muestras
Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un
disolvente orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin lo
suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin.. Sin
embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean
disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20 g
de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 g
de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de
impurezas.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar
el proceso de siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden usarse
tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del
capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una
distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de
aplicacin de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de
forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar.
Eleccin del eluyente
La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se va
a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
Eter de petrleo.
Eter dietlico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.

Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
cido actico.
*compuestos cancergenos.
En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la
polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando
la misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta dar con el
ms apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar
varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar
distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite
desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separacin se realiza de una manera ms
eficaz.
Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por
el mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por
una placa casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa
se realiza en una cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la
atmsfera de la cmara, las parades se tapizan con papel impregnado del
eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner
papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse.
Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del
desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el
tiempo de una cromatografa preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se
alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace

para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10

cm.; parece ser la ms conveniente para medir valores de RF. Despus del
desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una corriente de aire
caliente.
La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio
entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las
impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del
eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una
cmara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.
Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la
posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos.
Mtodos fsicos.
-Mtodos qumicos
Consisten en ralizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los
componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos
reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma,
o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el reactivo
revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber realizarse en
una vitrina de gases bien ventilada.
La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no
puede realizarse el baado del cromatograma (en cromatografa en papel
s).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma
complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillomarrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es
conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que
reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras.
El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de
componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).
Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminocidos).
-Mtodos fsicos.
El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente.
De tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y
dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas
fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos
aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con
lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.
Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la
posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide
la retencin de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el

centro de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10.
Para que los RFsean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de
muestra). El mximo valor de RFque se puede alcanzar es de 1, lo ideal es
un RF entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la
misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se
calculan losRF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no
se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los
compuestos pueden ser iguales o no serlo.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la
misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta
apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar
reveladores qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indIcador
ultravioleta.
Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un
compuesto (X), que tenga una posicin de desarrollo conveniente; todos los
dems compuestos sobre la placa se relacionan con ste. De esta manera
se tiene el ,RX , ya que: