Agronoma Tropical. 39(4-6): 249-268.

1989

PROPAGACION CLONAL DE PLANTAS DE CAF (Coffea arabica L. 'Catimor') A

PARTIR DE MICROESQUEJES CULTIVADOS IN VITRO
Eva G. de Garcia* y Margarita Rafael*
* Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias. Centro de Botnica
Tropical. Apdo. 47114. Caracas 1041. Venezuela.
RECIBIDO: febrero 22, 1989.

RESUMEN
El cafeto 'Catimor' (Coffea arabica var. 'Caturra' x Hbrido de Timor ) constituye un
cultivar de particular inters por la alto resistencia que presenta frente a la roya
anaranjada (Hemilia vastatrix Berk y Br.), combinada con importantes caractersticas
agronmicas como son buena calidad en taza, alto rendimiento y bajo porte. En este
trabajo se estudi su micropropagacin, tomando en cuenta la influencia de
nutrimentos y el efecto de las condiciones de crecimiento de la planta donadora, sobre
el establecimiento y produccin de brotes a partir de microesquejes aislados del cafeto
Catimor cultivados in vitro. Los explantes procedentes de plantas crecidas in viva
presentaron problemas de oxidacin que fueron controlados al colocar las plantas
donantes a una baja intensidad luminica, pretratando los explantes con una mezcla
antioxidante (300 mg/1 de cido ascrbico + 100 mg/1 de cido ctrico, previo a su
cultivo en medio lquido con cistena (60 mg/l). En los microesquejes aislados de
plantas in vitro se determin que aquellos constituidos por el nudo apical presentan
una mayor capacidad de brotacin in vitro que los nudos subyacentes. Una alto
concentracin de BAP, entre 12 y 16 mg/l, permiti romper la latencia de las yemas,
incrementndose el porcentaje de explantes con brotes sin BAP de 5,% a 62%.
Estudios morfoanatmicos comparativos realizados en plantas in vitro, a los tres mesas
de crecimiento, revelaron la preservacin de caractersticas juveniles. Los clculos
realizados basados en los resultados obtenidos perrniten afirmar que el rendimiento
potencial de la metodologa empleada en este trabajo (5 793 a 10 985 vstagos en un
ao), para la propagacin vegetativa del Catimor, es superior al reportado para los
mtodos hortcolas convencionales (100 a 200 vstagos en dos aos).
P.C.: Coffea arabica, cultivo de tejidos, microesquejes, regeneracin.
INTRODUCCION
E1 cafeto 'Catimor' (Coffea arabica cv. 'Caturra Rojo' x Hbrido de 'Timor') es un
cultivar de particular importancia, ya que combine una alto resistencia a todas o casi
todas las razas conocidas de la roya anaranjada (Hemileia vastatrix) con caractersticas
agronmicas deseables como: bajo porte, rendimiento, vigor, as como calidad de la
bebida idntica a las "arbicas" tradicionales (2).

Se estima que la propagacin a gran escala de genotipos de caf mejorados medionte

mtodos hortcolas convencionales tomara ms de 30 aos, tiempo que resulta
demasiado largo en vista de la amenaza inminente de la roya. Una posible solucin al
problema es la propagacin vegetativa in vitro de aquellos genotipos mejorados,
resaltantes de los programas de hibridizacin y seleccin, lo cual acelerara el proceso
y permitira hacer una seleccin ms precoz, ya que el cultivo in vitro conduce a un
coeficiente de multiplicacin macho mayor que la reproduccin vegetativa por va
hortcola, por permitir la ruptura de la latencia de las yemas y un rpido crecimiento de
las mismas, lo que da lugar a un verdadero "brote en cascada".
la multiplicacin por medio de microesquejes es una de las formas ms prcticas de
utilizacin de este mtodo in vitro, y ha resultado de primordial importancia para la
conservacin y reproduccin a gran escala de genotipos excepcionales.
En la presente investigacin se analizan los requerimientos nutricionales y ambientales
necesarios para lograr una multiplicacin clonal eficiente del cafeto 'Catimor', medionte
el uso de microesquejes. Se analiza, adems, la influencia de la edad y condiciones de
crecimiento de la planta donadora sobre el establecimiento y produccin de brotes a
partir de dichos microesquejes.
REVISION DE LITERATURA
Se denomina propagacin por microesquejes al mtodo que se basa en el cultivo de
una seccin (explante) proveniente del vstago de la planta (nudo o entrenudo), con el
fin de obtener nuevos vstagos medionte el desarrollo de yemas preexistentes o
neoformadas, las cuales podrn, a su vez, proporcionar nuevos esquejes, o ser
enraizados, obtenindose as mltiples plantitas, idnticas, en principio, a la planta
madre (13).
E1 primer informe sobre microesqueje en caf fu el realizado por SHARP et al. (14) en
el que se obtuvo la formacin de brotes y races a partir de explantes caulinares
orttropos y plagitropos de C. arabica cv. 'Mundo Nuevo' y cv. 'Bourbon Amarillo'.
De gran importancia han sido las investigaciones realizadas en esta rea por DUBlIN
(4, 5, 6) con el hbrido 'Arabusta'. En stas se ha logrado el de desarrollo de vstagos
que posteriormente fueron enraizados a partir de yemas preformadas o neoformadas,
de nudos o entrenudos, respectivamente. Basndose en sus investigaciones, DUBlIN
(5, 6) concluye que la estrategia de esqueje in vitro para Arabusta comprende las fases
siguientes a) obtencin y multiplicacin de los microesquejes, b) enraizamiento y c)
traspaso a condiciones ordinarias de cultivo. Por otra parte, el autor estima que un solo
microesqueje podra proporcionar, en un ao, 20 000 plntulas aproximadamente, lo
que significa un altsimo rendimiento, el cual unido a la garanta de conformidad
genotpica que ofrece esta tcnica, lo convierte en una muy buena alternativa para la
propagacin masiva de genotipos interesantes.
Otros investigadores que tambin han aplicado exitosamente las tcnicas de
microesquejes son NAKAMURA y SONDAHl (11), quienes trabajaron con nudos de
ramas orttropas de C. arabica cv. Mundo Novo, obteniendo el desarrollo del 45% de
las yemas preformadas, con una eficiencia de 7,5 plntulas por nudo cultivado en slo

seis meses.
En Venezuela, RAFAEL (13) obtuvo la regeneracin de plantas completas de Catimor, a
partir de microesquejes procedentes tanto de plantas crecidas in viva como in vitro por
embriognesis somtica. E1 medio utilizado el de MURASHIGE y SKOOG (MS) (10),
suplementado con distintas concentraciones de Bencilaminopurina (BAP) y Acido
Naftalenactico (ANA). En este trabajo se seala la superioridad en rendimiento de la
metodologa empleada cuando se compare con los mtodos hortcolas convencionales.
VIZCAYA (16) tambin ha informado sobre la obtencin de brotes in vitro a partir de
microesquejes de Catimor.
Otro aspecto importante en la micropropagacin in vitro de caf es la induccin de
embriognesis somtica. Al respecto se puede mencionar el trabajo de GARCIA y
MENENDEZ (7), en el cual se logr la formacin hasta de 75 embrioides por explante
foliar de Catimor, utilizando primero un medio para la induccin del callo embriognico
[MS/2, 8 mg/I BAP y 1 mg/1 de Acido 2,4-diclorofenexiactico (2,4D)], y
posteriormente otro medio para la diferenciacin de los embrioides (MS/2 y 10% de
agua de coca). En la misma lnea de la embriognesis, ASCANIO (1) informa sobre la
formacin indirecta de abundantes embrioides haploides, en anteras de C. arabica var.
Garnica, las cuales haban sido pretratadas con bajas temperaturas (5C, por 24 h) y
cultivadas en medio MS con 2 isopenteniladenina (2iP), Benciladenina (BA) y ANA en
diferentes concentraciones.
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
Se extrajeron microesquejes de plantas de Catimor obtenidas, tanto in vitro como in
vivo. E1 material in vitro fu obtenido por MENENDEZ (9) por embriognesis somtica,
y crecido durante un tiempo de seis a diez meses en el medio de cultivo MS-1, en una
cmara de crecimiento Forma Scientific, con iluminacin continua de 2600 lux a 27 +
1C. Las plntulas se mantuvieron en estas condiciones hasta alcanzar una altura de 2
a 5 cm, con un nmero de pares de hojas entre 3 y 12. E1 material in viva estaba
constituido por plantas de Catimor jvenes (3 a 10 mesas) y adultas (3 a 3,5 aos)
correspondientes a la F6, descendientes de progenie CIFC 960 (F5) y pertenecientes a
los grupos fisiolgicos de resistencia A y 1. Estas plantas crecieron bajo las condiciones
ambientes siguientes: en un saln con luz continua de baja intensidad (300 lux), a
temperatura ambiente (26 + 2C); regadas coda tres das y tratadas peridicamente
con fertilizante (Bayfolan 9,3%), insecticida (Nudrn 5 mg/1) y fungicidas (Benomyl, 1
a 10 g/1, Cupravit, 3,5 g/1 o Ridomil, 10 g/1).
Aislamiento de explantes a partir de plantas obtenidas in vitro. Bajo la campana de
flujo laminar, en condiciones de asepsia, se cortaron con bistur, sobre placas de Petri,
trozos de vstagos de las plntulas obtenidas in vitro. Los trozos comprendan el ltimo
por de hojas, con la yema apical.y varios pares de hojas ms desarrolladas. E1 tallo
desfoliado se dividi en microesquejes, tomndose en cuenta el nivel del vstago
correspondiente a coda uno, para asignarle el No. 1 al nudo apical, el No. 2 al
siguiente, y as sucesivamente hasta llegar al nudo ms viejo. Estos explantes fueron
sembrados inmediotamente en tubos de 2,5 x 20 cm, contentivos de cultivo, los cuales
se mantuvieron en una cmara de crecimiento Forma Scientific a 27 + 1C y con un

fotoperodo de 16 h a 2 600 lux.

Aislamiento de explantes a partir de plantas obtenidas in vivo. Las porciones aisladas y
desfoliadas de ramas ortrtopas o plagitropas, de las plantas crecidas in vivo,
formadas por el nudo apical, un entrenudo y el nudo secundario subyacente, fueron
sometidas al proceso de desinfeccin siguiente:
a) lavado en agua corriente con jabn iodado;
b) inmersin en hipoclorito de calcio al 3,5%, vaco parcial (-21 lb) y fro durante 20
minutos;
c) tres enjuagues con agua destilada estril;
d) inmersin en mezcla fra y esterilizada de Benomyl (500 mg/1) y Gentamicina (500
mg/1), durante 30 minutos, en vaco parcial (-21 Lb);
e) corte de los microesquejes en mezcla esterilizada y fra de cido ascrbico (300
mg/1) y cido ctrico (100 mg/1), en la que se dejan por 10 minutos, para controlar la
oxidacin;
f) paso por alcohol isoproplico (90%), durante cuatro segundos antes de sembrar.

Despus de la desinfeccin se extrajeron y sembraron los microesquejes de la misrna

forma que se hizo con el material de in vitro, y se colocaron en una cmara con
fotoperodo de 16 horas a 2 600 lux, y 27 _ 1C.
Medios de cultivos.
Todos los medios de cultivo empleados en este trabajo fueron preparados con las sales
minerales del medio basal de MURASHIGE y SKOOG (10), completas o diluidas a la
mitad (MS/2), segn se requiriera. La constitucin de la porcin orgnica de dichos
medios vari dependiendo del objetivo dcada experiencia y se ajust el pH a 5,7 con
NaOH o HC1 1 N. Se prepararon tanto medios lquidos como slidos, utilizndose para
estos ltimos Gelrite (2 g/1). Se autoclavaron a 121C y 1,2 kg/cm2 durante 15
minutos.
Medio para el crecimiento de embriones somticos (Medio MS-I).
Este medio fu preparado en estado slido, con las sales MS diluidas a la mitad, mioinositol (100 mg/1), tiamina (10 mg/1), hidrolizado de casena (100 mg/1), cistena
(35 mg/1), sacarosa (30 g/1), suplementados con AIB (5 mg/1) y 2iP (1 mg/1).
Medios para microesquejes de plantas obtenidas in vitro.
Todos los medios de cultivo preparados para este tipo de explantes contienen las sales

de MS completes, tiamina (1 mg/1), mio-inositol (100 mg/1), cido nicotnico (0,5

mg/1), piridoxina (0,5 mg/1), glicina (2 mg/1) y sacarosa (40 g/1), diferencindose
entre si en la concentracin de BAP y ANA que poseen (Cuadro 1' y en el estado fsico
del medio.
Medios para microesquejes de plantas crecidas in vivo.
Todos los medios preparados para el cultivo de explantes de plantas crecidas in viva
contienen las sales completes de MS, mio-inositol (100 mg/1), tiamina (1 mg/1), cido
nicotnico (0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1), glicina (2 mg/1) y sacarosa (40 g/1). A
los mismos se les aadi 80 100 mg/1 de Gentamicina para combatir la
contaminacin bacterial y 500 mg/1 de Benomyl para controlar la contaminacin
fungal.
Medios para el anlisis del efecto del BAP e interaccin BAP/ANA en el
crecimiento de los microesquejes.
Para estudiar el efecto de la concentracin de BAP y de la combinacin BAP/ANA, se
sembraron los microesquejes en medios en los que se ensayaron las concentraciones
de BAP siguientes: 4 mg/1, 8 mg/1, 10 mg/1, 12 mg/1 y 16 mg/1 (medios MS-14, MS16, MS-18, M~20 y M&21, respectivamente, Cuadro 1).

CUADRO 1. Medios para microesquejes de plantas crecidas in vitro.

BAP

ANA

Cist.

Gelrite

Medio

mg/l

mg/l

mg/l

mg/l

MS-12

40

0,62

MS-13

60

0,62

MS-14

60

0,62

MS-15

0,5

60

0,62

MS-16

60

0,62

MS-17

0,5

60

0,62

MS-18

10

60

0,62

MS-19

10

0,5

60

0,62

MS-20

12

60

MS-21

16

60

MS-22

40

MS-23

40

MS-24

40

MS-25

40

MS-26

40

NOTA: todos los medios contienen las sales de MS completes, tiamina (1 mg/ 1), mio-inositol (100
mg/1), cido nicotinico (0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1), glicina (2 mg/1) y sacarosa (40 g/1).

Otros medios fueron suplementados con BAP y ANA en las proporciones siguientes: 4
mg/1 BAP/0,5 mg/1 ANA; 8 mg/1 BAP/0,5 mg/1 ANA y 10 mg/1 BAP/0,5 mg/1 ANA
(medios MS-15; M-17; MS-l9, respectivamente, Cuadro 1).
Medios de enraizamiento de vstagos obtenidos.
Algunos de los vstagos producidos in vitro, con un nmero de pares de hojas entre
tres y echo, y una longitud de 0,8 a 2 cm, fueron aspticamente separados del
explante original y sembrados en medios para el enraizamiento. Los medios contenan
las sales de MURASHIGE y SKOOG diluidas a la mitad y los compuestos orgnicos
correspondientes, cistena (40 mg/1), sacarosa (10 g/1) y auxinas: ANA o AIB (Cuadro
2).

Evaluacin del crecimiento de los microesquejes.

la evaluacin se realiz sernanalnente medionte la observacin del material sembrado,
con la ayuda de un microscopio estereoscpico Bausch and

CUADRO 2. Medios para el enraizamiento de los vstagos producidos in vitro.

Cist.

BAP

ANA

AIB

SAC

Gelrite

Medio

MS

mg/l

mg/l

mg/l

mg/l

g/l

mg/l

MS-27

1/1

40

30

MS-28

1/1

40

0,1

30

MS-29

1/1

40

1,5

0,5

30

MS-30

1/1

60

30

MS-31

1/1

60

~5

30

MS-32

1/2

60

30

MS-33

1/2

60

30

MS-34

1/2

60

10

10

MS-35

1/2

60

10

10

MS-36

1/2

60

10

NOTA: todos los medios contienen tiamina (0,1 mg/1), mio-inositol (100 mg/ 1), cido nicotnico
(0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1) y glicina (2 mg/1).

Lomb. Se tom en cuenta el nmero de explantes que produjeron brotes, el nmero de

brotes por explantes y l nmero de pares de hojas por brote.
A los tres meses de cultivo se estim el nmero de huevos microesquejes que se
podran obtener a partir de coda explante inicial (rendimiento), para lo cual se
consider que coda brote producido puede proporcionar tantos microesquejes como
nudos tenga.

Se tabularon los valores basndose en el promedio del total de replicas (10),

sembradas en coda condicin y se graficaron para su comparacin.
Para establecer si las diferencias que se presentaron entre los dates de un tipo de
explante determinado, a distintas concentraciones hormonales (BAP, o BAP/ANA), eran
estadsticamente significativas se realiz la prueba de KRUSKAl-WAllIS (15). Los dates
correspondientes a explantes diferentes fueron confrontados medionte la prueba de
KOlMOGOROV-SMIRNOV, para determinar su grado de significacin.
Estudios morfoanatmicos.
Para determinar la existencia de diferencias morfolgicas y/o anatmicas, entre
plntulas obtenidas in vitro a partir de microesquejes, y las plantas donantes (adultas
y jvenes) crecidas in vivo, se realizaron observaciones comparativas del tallo, hojas y
raz de ambos tipos de plantas. Las observaciones de rganos y tejidos se hicieron en
material vegetal fresco o preservado en etanol 70%.
Para los estudios anatmicos se cort el material a mano suelta y se ti con azul de
tolouidina. Con estos cort se prepararon lminas semipermanentes (glicerina 50%).
Las preparaciones se observaron en un microscopio leitz y se hicieron registros
fotogrficos con una cmara incorporada a un microscopio Wild-Heerbrugg.
Resultados
Crecimiento de microesquejes aislados de plantas obtenidas in vitro.
En general, se observ que los nudos apicales presentaron mayor porcentaje de
explantes que producan brotes (93,06%) en relacin al conjunto de los nudos no
apicales (44,01%); la misma tendencia se present con respecto al nmero de brotes
producidos por explante. Adems, los nudos correspondientes a distintos niveles del
vstago presentaron diferencias en el porcentaje de explantes con brotes, ordenndose
de la manera siguiente:

Nudo apical (93,06%)

Segundo nudo (46,15%)

Sexto nudo (83,30%)

Dcimo nudo (33,33%)

Quinto nudo (56,25%)

Tercer nudo (2C%)

Sptimo nudo (50,08%)

Octavo nudo (25%)

Cuarto nudo (48%)

Noveno nudo (25%)

E1 100% de los nudos apicales producen brotes con cualquiera de las concentraciones
de BAP ensayadas (entre 3 y 16 mg/1) (Figure 1); en los nudos subyacentes
solamente se logra la brotacin en un mximo de 62,5% y lo hacen a una alto
concentracin de BAP de 12 mg/1 (Cuadro 3). Adems, mientras los nudos apicales
alcanzan un promedio mximo de cuatro brotes por explantes con 4, 10 12 mg/1 de
BAP, al cabo de tres meses de cultivo, los nudos subyacentes solo alcanzan un
promedio mximo de 2,5 brotes por explante a concentraciones de BAP entre 10 y 16
mg/1.
En cuanto al nmero de explantes obtenidos a partir del microesqueje inicial
(rendimiento), en funcin de la concentracin de BAP, se observaron los mayores
valores en los nudos apicales, llegando a 17,2 explantes por microesqueje inicial con 4
mg/1 de BAP; mientras que los nudos no apicales alcanzaron un promedio de 10,0
expl./expl. inicial y esto con 16 mg/1 de BAP. La adicin de ANA (0,5 mg/1) a los
medios con 4, 8 y 10 mg/1 de BAP result en un incremento del porcentaje de
explantes con brotes (Cuadro 3, fig. 2)
En el conjunto general de microesquejes, nudos apicales y subyacentes, procedentes
de vstagos producidos in vitro, se observ que el porcentaje de "explantes con
desarrollo de brotes", incrementaba a medida que la concentracin de BAP en el medio
de cultivo era gradualmente aumentada de 0 a 12 mg/1, observndose una ligera
declinacin con 16 mg/1 (Cuadro 4). Una tendencia parecida se observ en el
promedio de "brotes producidos por explante" (Cuadro 4). La prueba de KUSKAl-WAllIS
(15) aplicada a estos dates indic que las diferencias en el porcentaje de "explantes
con brotes" y en el promedio de "brotes por explantes", encontrados entre las distintas
concentraciones de BAP ensayadas, son estadsticamente significativas (con = 0,05)

Fig. 1. Nudo apical procedente de

planta de in vitro desarrollndose
en medio suplementado con 4 mg/1
de BAP. Presenta siete brotes con
un mximo de cinco pares de hojas
(tres mesas de cultivo.

Fig 2. Microesquejes procedentes de

vstago obtenido in vitro en medio
suplementado con 4 mg/1 de BAO y 0,5
mg/1 de ANA, desarrollndose ahora en
medio con 10 mg/1 de BAP. Presenta
mltiples brotes (en su parte superior) y
seis races (en su parte superior) (tres
meses de cultivo).

CUADRO 3. Evaluacin del efecto de la concentracin de BAP y ANA sobre el desarrollo

de microesquejes de plantas crecidas in vitro.

BAP

ANA

mg/l

mg/l

NA

NS

NA

NS

NA

NS

NA

NS

0,78

0,06

1,6

77,8

5,6

1,2

0,1

2,1

0,18

3,3

100

10

6,9

0,18

1,4

4,3

1,4

100

36

17,2

1,9

0,5

1,5

0,97

2,6

2,5

91,7

48,6

3,9

4,2

2,7

0,62

3,3

1,5

100

30,8

8,9

0,93

0,5

3,3

1,40

2,1

100

61,5

9,9

2,94

10

2,1

100

57,1

16

4,2

10

0,5

3,2

3,6

0,91

100

68,8

11,5

0,91

12

1,9

1,8

100

62,5

16

3,42

16

X explantes por
expl.

2,5

X PDH

3,3

% explantes con
brotes

100

45,5

Rendimiento

9,9

10

NA: Nudo apical ND: Nudo subyacente PDH: Pares de hojas

En relacin al estado fsico del medio, se encontraron, al cabo de dos mesas de cultivo,
mayores porcentajes de oxidacin entre aquellos explantes sembrados en medio slido
(50,9%) que entre los sembrados en medio liquido (31,4%). Las plntulas una vez
enraizadas fueron pasadas a tierra y mantenidas en un ambiente hmedo, donde
continuaran desarrollndose (Figure 3).
Crecimiento de microesquejes aislados de plantas obtenidas in vitro.

Los explantes provenientes de plantas crecidas in viva bajo condiciones controladas

presentaron poco problemas de oxidacin y contaminacin. Con respecto al
tratamiento de desinfeccin y antioxidacin aplicados a estos explantes, se observ
que el mtodo seguido permita disminuir en gran porcentaje la oxidacin y la
contaminacin fungal y bacterial.

CUADRO 4. Evaluacin del efecto de h concentracin de BAP sobre el desarrollo

(nudos apicales + nudos subyacentes) procedentes de plntulas y vstagos
obtenidos in vitro.

BAP

% expl. con brotes

X brotes/expl.

mg/l

Tipo I

Tipo II

Tipo I

Tipo 11

29,6

0,3

29,4

0,6

42,9

25

1,7

0,5

43,8

60

1,6

10

65,4

62,5

2,4

1,1

12

70

70

2,3

1,5

16

57,2

40

2,6

Tipo 1: explantes procedentes de plntulas obtenidas in vitro por embriognesis somtica.

Tipo II: explantes procedentes de vstagos producidos in vitro a partir de microesquejes de
plantas de in vivo.

Fig. 3. Vstago producido y

enraizado in vitro, continuando
su desarrollo en tierra,
despus de un mes del
transplante.

Efecto del estado fsico del medio de cultivo.

Mayores porcentajes de contaminacin y oxidacin se presentaron entre los explantes
sembrados en medio slido que entre los del medio liquido. De tal forma que a la
semana de sembrados se observ un 8,3% de oxidacin y un 52% de contaminacin
bacteriana entre los explantes que se encontraban en el medio slido, mientras que
entre los sembrados en medio lquido an no se presentaba ningn explante afectado.
Evaluacin del crecimiento de los microesquejes.
Independientemente del origen del microesqueje (plantas de in vitro o de in viva), y
del suplemento hormonal empleado, el porcentaje de explantes con brotes fu siempre
superior, cuando el mismo estaba constituido por nudos apicales que cuando estaba
constituido por nudos secundarios.
los nudos apicales (adultos y jvenes) no mostraron marcadas variaciones en el
porcentaje de explantes con brotes, ni en el promedio de "brotes por explante" en
funcin de la concentracin de BAP (entre 4 y 16 mg/1). Lo mismo se observ con
respecto a los nudos secundarios (Cuadro 5).
En cuanto al rendimiento o nmero de nuevos explantes que se pueden obtener a
partir de cada explante original en tres meses de cultivo, el cual depende tanto del
nmero de brotes producidos, como del nmero de pares de hojas de dichos brotes, se
observ que aquellos procedentes de plantas adultas resultaron en general ms
productivos que los de plantas jvenes. As, mientras el mximo valor alcanzado por
nudos apicales de plantas adultas era de 13,2 explantes/explante original (con 4 mg/1
de BAP), los de plantas jvenes slo llegaron a 1,9 expl./expl. orig. (con 8 mg/1 de

BAP).

CUADRO 5. Evaluacin del efecto de la concentracin de BAP y ANA sobre el desarrollo

de microesquejes de plantas adultas y jvenes crecidas in vitro.

X brotes por explante

BAP

ANA

X por de hojas/brote

Rendimiento

NAA

NAJ

NAA

NSJ

NAA

NAJ

NSA

NSJ

NAA

NAJ

NSA

NSJ

mg/l mg/l

12

1,3

0,9

1,1

1,8

1,7

13,2

1,0

2,3

1,5

0,5

0,7

1,5

1,7

0,7

1,7

3,0

0,9

1,3

0,3

0,5

2,4

1,5

1,3

2,2

1,9

0,6

0,7

0,5

1,3

1,3

1,3

1,3

1,3

1,7

1,3

2,6

1,3

10

1,8

0,8

1,2

1,6

2,3

2,9

0,8

2,8

10

0,5

0,5

2,5

0,5

2,5

8,0

12

1,2

1,1

0,3

3,0

0,8

0,8

3,6

0,8

2,2

0,2

16

1,5

0,9

3,2

3,0

0,9

6,4

NOTA:

NAA = Nudo apical de

plantas adultas

N31 = Nudo secundario de planta joven

NSA = Nudo secundario de

planta adulta

Rendimiento = Nmero de nuevos

expiantes que se pueden

NAJ = Nudo apical de planta obtener a partir de un explante inicial

joven

Fig. 4. Vstago producido in

vitro a partir de un nudo
secundario de planta adulto de
in viva cultivado en medio con
16 mg/l de BAP. Presenta un
tallo verde, blando, de
aproximadamente 0,15 cm de
dimetro y 2 cm de alto, con
cinco pares de hojas (cuatro
meses de cultivo)

.
Los nudos secundarios de plantas adultas produjeron hasta 6,4 expl./ expl. orig., con
16 mg/1 de BAP (Fig. 4), mientras que aquellos procedentes de plantas jvenes slo
alcanzaron el valor de 1,5 (con 4 mg/1 de BAP) (Cuadro 5). Los microesquejes de
mayor rendimiento fueron los obtenidos de plantas crecidas in vitro, con un mximo de
17,7 expl./expl. orig.
Al comparar el promedio de "brotes producidos por explante" de los microesquejes de
plantas obtenidas in vitro (Cuadro 4) con los de los microesquejes de plantas
producidas in viva (Cuadro 6), se observe que para todas las concentraciones de BAP,

los primeros resultaron ms productivos que los segundos. La prueba de

KOlMOGOROV-SMIRNOV (15), aplicadas a estos dates indica que las diferencias
encontradas entre ambos tipos de explantes son estadsticamente significativas (
0,05).

CUADRO 6. Evaluacin del efecto de la concentracin de BAP y ANA en el desarrollo de

nudos apicales + nudos secundarios de plantas adultas y jvenes de in viva.

% de exp. con brutas

X brotes/expl

BAP

ANA

Adultas

Jvenes

Adultas

Jvenes

76,5

60

1,2

0,9

0,5

75

60

0,9

0,6

37,5

55,6

0,7

0,9

0,5

50

66,7

1,3

1,2

10

64,3

18,8

1,4

0,3

10

0,5

66,7

40

1,7

0,4

12

61,5

42,2

1,2

0,4

16

76,9

38,9

1,8

0,4

Aspectos morfoanatmicos de los rganos originados in vitro.

Los vstagos enraizados in vitro no presentan una raz axonoforma, sino varias races
adventicias principales (tres o cuatro), de las que se originan otras secundarias. Estas
races, a diferencia de las obtenidas in viva, presentan poco engrosamiento en las

paredes del xilema, el cual forma solo cuatro rayos en lugar de seis. En los cortes
realizados en la base de los vstagos enraizados se observ que las races adventicias
se originaban del cilindro vascular del tallo, y no del callo formado en dicha zona.
Los vstagos obtenidos in vitro, al cabo de tres meses de formados, presentan tallos
verdes, blandos y de pocos milimetros de dimetro (1-2 mm). Anatmicamente se
pudo observar que carecen de anillo esclerenquimtico alrededor del cilindro vascular,
as como de crecimiento secundario: corcho, xilema y floema secundarios. |
las hojas de los vstagos producidos in vitro conservan la misma filotaxis decusada y
generalmente la misma forma y caractersticas de las hojas de plantas crecidas in viva.
Sin embargo, ocasionalmente se pudo observar la aparicin de hojas aciculadas,
irregulares, amarillentas y/o con la lamina foliar anmala (Fig. 5). Las diferencias
presentadas desde el punto de vista anatmico son las siguientes: cutcula ms
delgada, clulas del parnquima de empalizada ms corta; parnquima esponjoso con
slo cuatro o cinco capes, sin llegar nunca a seis capes como en las plantas de in vivo;
cilindro vascular del nervio central abierto, xilema y floema ms escasos, poco
engrosamiento en las paredes del xilema, ausencia del anillo esclerenquimtico
alrededor del cilindro vascular del nervio central, carencia de cilindros accesorios.
Adems, en vista superficial, las clulas de la epidermis inferior presentaban paredes
rectas, en contraste con las paredes onduladas de las hojas de in viva y son frecuentes
los estomas en distintos estados de desarrollo y con formas anmalas: ausencia de una
o ambas clulas oclusivas o acompaantes, as como desigualdad de forma y tamao
entre stas (Fig. 6).

Fig. 5. Vstago producido in vitro a partir

de nudo apical de planta adulta,
mostrando forma anmala de las hojas.

Fig. 6. Vista superficial de la epidermis

abaxial de una hoja de vstago producido
in vitro, mostrando las paredes celulares
rectas y la forma anmala de los estomas
(aumento 400X).

DISCUSION
Anlisis del efecto del nivel del nudo, origen y edad de la planta donante, y balance
hormonal del medio de cultivo, sobre el desarrollo del explante in vitro.
El hecho de que el mayor porcentaje de explantes que logran producir brutas in vitro
se presenta entre los nudos apicales, independientemente del origen del material
donante, es posible explicarlo como una consecuencia del fenmeno de la dominancia
apical, la cual se ha observado en gran nmero de especies vegetales.
Diversas investigaciones han revelado el papal primordial que juega el balance
endgeno auxina/citocinina en la regulacin de la brotacin de las yemas laterales. Es
generalmente aceptado que las auxinas sintetizadas en las hojas jvenes de la yema
apical son transportadas basiptalamente hacia las yemas laterales, y constituyen la
principal seal correlativa que regula la sntesis de citocininas, su distribucin o su
utilizacin en estas yemas. De esta manera, la inhibicin del crecimiento de las yemas
laterales es una consecuencia del dficit de citoquininas, lo que impide alcanzar el
balance adecuado auxina/citocinina para la induccin del crecimiento del brote (3, 8,
12).
En el caso de los explantes procedentes de plntulas crecidas in vitro a partir de
embriones somticos, se observ que el efecto regulador del pice se manifiesta con
mayor intensidad en los nudos que ocupan el segundo y tercer nivel, disminuyendo
esta inhibicin a partir del quinto nudo, lo que hace pensar que de nuevo el balance
endgeno auxina/citocinina es adecuado, hasta el punto de permitir un alto
porcentajes (83,3%) de brotacin en los nudos del sexto nivel. En este sentido y con el
propsito de eliminar los efectos de la dominancia apical, que como se ve, se mantiene
an en el material cultivado in vitro, se podra recurrir a separar la yema apical cierto
tiempo antes de la extraccin de los dems nudos, segn lo sugieren BRESSAN et al.

(3).
La tendencia a una mayor produccin de brotes por explantes en aquellos procedentes
de plantas in vitro (Cuadro 4), que en los procedentes de plantas crecidas in viva
(Cuadro 6), refleja la existencia de diferencias en el contenido hormonal endgeno de
ambos tipos de explantes, y consecuentemente de la capacidad morfogentica del
tejido, determinadas por el grado de madurez del material donante. Se sabe, y los
estudios anatmicos realizados en este trabajo as lo demuestran, que las plantas
mantenidas in vitro conservan caractersticas juveniles que in viva se pierden a medida
que la planta alcanza su madurez.
Los clculos realizados basados en los resultados obtenidos en este trabajo, indican
que el nmero mximo de vstagos que con la metodologa descrita es posible obtener
en un ao, a partir del nudo apical y un nudo secundario de una plntula obtenida in
vitro, por embriognesis somtica, es casi el doble (10 985 vstagos) del que podra
obtenerse partiendo de los mismos explantes extrados de una planta de in viva (5 739
vstagos).
Sin embargo, hay que tomar en cuenta lo que seala DUBlIN (4) acerca del mayor
riesgo de alteraciones genmicas que presentan las plantas obtenidas por
embriognesis somtica, por observarse durante este proceso una fase de callo
indiferenciado. De esta manera, se puede considerar que los explantes obtenidos
directamente de las plantas in viva ofrecen mayores garantas de conformdad
gentica, lo cual es muy importante sobre todo cuando se de sea propagar plantas que
han sido seleccionadas por poseer un genotipo o de particular inters, como es el case
del cultivar Catimor.
Rendimiento del cultivo de microesquejes de Catimor.
Las ventajas del cultivo de microesquejes se evidencian al comparar el potencial
reproductivo de este mtodo (de 5 793 a 10 985 vstagos en un ao), con el obtenido
en condiciones hortcolas convencionales (100 a 200 vstagos en dos aos) (5, 6).
Aunque an queda macho que investigar para superar los problemas que acarrea el
cultivo in vitro del caf, y lograr establecer una metodologa que permita el mximo
rendimiento, se puede decir que la propagacin vegetativa in vitro a partir de expalntes
caulinares es una alternativa prometedora.
En general, es posible obtener plantas completes a partir de los vstagos producidos in
vitro, enraizando stos en un medio con las sales MS diluidas a la mitad, una baja
concentracin de sacarosa (10 g/1) y AIB (10 mg/1).
la tcnica de cultivo in vitro de explantes caulinares es un mtodo que debe
incorporarse a los programas de propagacin masiva de cultivares de caf
seleccionados, como el Catimor, debido al alto coeficiente de multiplicacin que posee
dicha tcnica, en comparacin con los mtodos hortcolas convencionales.
SUMMARY

Cofeea arabica cv. 'Catimor' is resistant to a wide range of races of the rust fungus, it
also has desirable agronomic characteristics and produces good quality coffee. Base on
these prominent features, the massive vegetative propagation of this cultivar sesms to
be promising in countries with rust problems to produce rust free coffee. In this paper
we analyzed the nutritional and environmental requirements to micropropagate Coffea
arabica cv. Catirnor. Propagation wes achieved by culturing microcutting of orthotropic
and plagyotropic shoots, obtained from the field and from plantlets grew in the
laboratory by in vitro culture. Also it was studied the influence of growth conditions of
the donor plants, and the effect of the original position of the cutting in the donor
shoot, on the growth of the microcutting. In the explants (microcutting isolated from
shoots obtained from the field, serious oxidation was observed, which was controled:
a) by placing the donor plants under low light intensity, b) by treating the explants with
ascorbic acid (300 mg/1) and c) by growing these explants in liquid medio with cistein
(60 mg/1). We found that microcutting with apical node, isolated from plantlets grown
in vitro had better capacity to develop buds than the microcutting with secondary
nodes. High BAP concentrations (12 to 16 mg/1) are necessary to induce the bud
growth. The microcuttings with buds increases from 5.6% in medio without BAP, to
62% in medio with high BAP concentration. Morphoanatomic analysis of three months
old plants, showed that they preserve characteristics of juvenility in comparison with
plants of same age obtained from seeds. Potentialy with this method we can produce
bet~veen 5,793 to 10,985 shoots in one year, in comparison with 100 to 20 shoots
that can be obtained by horticultural methods.
K W.: Coffaa arabica, tissue culture, microcutting.
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