Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioqumica

PRCTICA DE LABORATORIO N 03
INHIBICIN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) Y
DEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1)
I.

INTRODUCCIN.
En la presente experiencia de prctica investigaremos la inhibicin
de la actividad enzimtica por productos qumicos especficos, los
llamados Inhibidores. El inhibidor especfico usado ser bisulfato
de sodio y el malonato. Se conoce que el bisulfito se combina con
la ureasa inhibiendo la actividad enzimtica de modo reversible.
Una molcula inhibidora afecta la actividad enzimtica de dos
modos: por Inhibicin competitiva e inhibicin no competitiva. La
inhibicin competitiva tiene lugar cuando una molcula que es
estructuralmente similar al sustrato para una reaccin particular,
compite por una posicin en el sitio activo de la enzima. Esto hace
que la enzima no est disponible al sustrato. La inhibicin
competitiva puede invertirse si se eleva la concentracin del
sustrato a niveles suficientemente altos mientras la concentracin
del inhibidor se mantiene constante.
En la inhibicin no competitiva, el inhibidor se une a la enzima en
un sitio que no es el sitio activo. Siendo as, cambia la naturaleza
de la enzima para que pierda sus propiedades catalizadoras. Esto
sucede de dos maneras. El inhibidor no competitivo bloquea
fsicamente el acceso al sitio activo, o causa un cambio
conformacional en la protena, inactivndola. Porque las molculas
del sustrato no pueden invertir la posicin de un inhibidor no
competitivo y aumentar la concentracin del sustrato no invertir
la inhibicin.
El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto
inhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reaccin
enzimtica, utilizando para ello bisulfito de sodio y malonato,
como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa,
respectivamente.

II.

MATERIALES.
Gradillas.
Bao Mara a 37C.
Tubos de ensayo 15x 125 mm.

Ingeniera Agroindustrial

Pgina 1

Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

Bioqumica

Tubos de ensayo 13 x 100 mm.

Juego de pipetas 10, 5, 2 y 1 ml.

Espectrofotmetro.
Fotocolormetro.
Buffer
fosfato
de
sodio 0.1M pH 7.
2.6
diclorofenolindofenol
0.02%.
Succinato 0.1M.
Malonato 0.1M.

Ingeniera Agroindustrial

Pgina 2

Homogenizado
heptico
Buffer Tris 0.05M pH
7.
rea 0.1M en buffer
Tris 0.05 pH 7.
Bisulfito de Sodio
0.1M.
Ureasa 0.1%.


PROCEDIMIENTO.

III.

Prepare el siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones que

se muestra a continuacin:
A. INHIBICIN DE UREASA.
1. SISTEMA DE INCUBACIN.

COMPONE
NTES (mL)
Y PROCESO

Buffer
Tris
0.05 M PH
7.0
rea 0.1 M
en
buffer
Tris 0.05 M
pH 7.0
Bisulfito de
Sodio 0.1 M

--

--

Pre Incubar a 37C por 5 minutos.

Ureasa 0.1%

--

Incubar a 37C por 15 minutos.

Aadir dos gotas de HgCl2 a cada tubo para

detener la reaccin.
Ureasa 0.1%

---0

Mezclar, preparar y seguir con el siguiente

sistema.

2. Evaluacin del efecto inhibidor del bisulfito de sodio:

Cuantificacin del producto formado por colorimetra
(Reaccin de Nessler).

Transferir 0.1 mL de cada uno de los tubos de ensayo

de la parte 1 a sus correspondientes en la parte 2.

COM
PON
ENTE
S
TUBO
1
(Parte
1)
TUBO
2
(Parte
2)
TUBO
3
(Parte
3)
TUBO
4
(Parte
4)
Agua
destil
ada
React
ivo
de
Nessl
er

II

IV

---

--

----

--

0.

--

----

--

---

----

--

---

--

0.

3.

3.

0.

0.

II

 Dejar en reposo por 5 minutos. Leer en fotocolormetro con

filtro verde o bien en espectrofotmetro a 540 nn. Restar la
lectura del tubo 4 de las lecturas de los otros tubos. Determinar
la actividad enzimtica en cada uno de los tubos de incubacin.
Para lo cual deber multiplicar la lectura de cada tubo por un
factor:
FR= 37 mg NH3 / ml, para espectrofotmetro
y 0.006 mg NH3 / ml, para fotocolormetro.

B. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.

1. SISTEMAS DE INCUBACIN Y EVALUACIN DEL EFECTO
INHIBIDOR DEL MALONATO.

COMPONENTE
S (ml)

Buffer fosfato de
Sodio 0.1 M pH 7.4

2.6
diclorofenolindofenol

Succinato 0.5 M

Malonato 0.1 M

UBO
1

.5

.0

--
--
---

T
UBO
2
1
.2
1
.0
-
---
---
.5

T
T
T
T
UBO 3 UBO 4 UBO 5
1

1
.0

.8
1

.0
-

1
.0

--

0
.3

.0

---

.7

Homogenizado
0
0
0
0
heptico
.5
.5
.5

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar

y anotar los resultados segn el color de cada un de los tubos.

IV.
CUESTIONARIO.

1. Qu se entiende por modificadores de la actividad

enzimtica?

MODIFICADORES DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Tipos:
a) Temperatura: Las enzimas son inactivadas por e calor a
temperaturas de 50C-60C inactivan rpidamente la mayor
parte de las enzimas. Esta inactivaron es irreversible, pues al
enfriar no se obtiene actividad otra vez. Esto explica que casi
todos los organismos resulten muertos a una exposicin a
temperatura elevada: Sus enzimas se inactivan y resultan
incapaces de reanudar su metabolismo.
Las Enzimas no son inactivadas por la congelacin; las
reacciones que producen tienen a lugar muy lentamente a
temperaturas bajas, o se detienen, pero la actividad cataltica
reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal
b) Acidez: Las enzimas son sensibles a los cambios de PH o sea
de acidez o alcalinidad en el medio.
La mayor parte de enzimas intracelulares tienen PH ptimos
cerca de la neutralidad, por lo que no actan en medioscidos
ni alcalinos, los cidos y bases enrgicos las inactivan
irreversiblemente.
c) Concentracin de Enzima, substrato y Cofactor: Si el PH y
la temperatura de un sistema enzimtico se mantiene
constante pero hay exceso de substrato, la intensidad de la
reaccin es directamente proporcional a la cantidad de enzima
presente.
d) Venenos Enzimticos: Algunas enzimas resultan muy
sensibles a ciertos venenos como el acido cianuro fluoruro
lewisita etc. Resultan inactivadas aun frente a concentraciones
bajas de estos venenos
Aun las enzimas pueden actuar como venenos si se
encuentran en lugar in adecuado. Varios tipos de venenos que
vienen de los animales como la de la serpiente abeja y
escorpin deben su poder letal a las enzimas que destruyen
glbulos rojos y otros tejidos.

e) PH: Los cambios de PH alteraran considerablemente la

naturaleza inica de los enzimas se sabe poco de las
variaciones del PH en las enzimas.

2.- Qu se entiende por un inhibidor? Cul es su

mecanismo general de accin?
Los Inhibidores enzimticos son molculas que se unen a
enzimas y disminuyen su actividad. Sin embargo, no todas las
molculas que se unen a las enzimas son inhibidoras; los
activadores enzimticos se unen a las enzimas e incrementan
su actividad.

El mecanismo de accin de los inhibidores enzimticos

consiste en inhibir o bloquean la enzima para y disminuyen su
actividad.

3. Qu relacin hay entre los trminos inhibicin,

inactivacin y desnaturalizacin de una enzima?
La relacin es que en la inhibicin est relacionado con la
actividad enzimtica y en la inactivacin y desnaturalizacin no
hay actividad enzimtica; ms bien se relaciona con la
velocidad de la reaccin enzimtica.

4. Qu se entiende por sitio alostrico?

Los sitios alostricos son zonas de la enzima con capacidad

de reconocer y unir determinadas molculas en la clula. Las
uniones a las que dan lugar son dbiles y no covalentes, y
generan un cambio en la conformacin estructural de la enzima
que repercute en el sitio activo, afectando as a la velocidad de
reaccin de la enzima. Las interacciones alostricas pueden
tanto inhibir como activar enzimas, y son una forma muy
comn de controlar las enzimas en las clulas.

5. Qu es un inhibidor competitivo?

El inhibidor es una molcula que presenta un cierto parecido

estructural con el sustrato, de manera que puede competir con

l por acceder al centro activo, pero que no posee ningn

enlace susceptible de ser atacado por el enzima.

6.- Qu efecto tiene el aumento de la concentracin

del

sustrato

sobre

la

inhibicin

competitiva

de

una

reaccin enzimtica?

Los principios generales de la cintica de las reacciones

qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los

enzimas, pero estos muestran tambin una rasgo caracterstico
que no se observa en las reacciones no enzimticas: la
saturacin con el sustrato.

En general, podemos decir que al aumentar la concentracin

de sustrato en el medio, la velocidad de reaccin de un enzima

aumenta; por tanto, la influencia de la concentracin de sustrato
tiene un efecto positivo en la catlisis enzimtica. Esto es
debido, simplemente, a que al aumentar el nmero de sustratos
en el medio, ser mayor la cantidad de producto producido por
la reaccin enzimtica. Sin embargo, llega un momento en que
la velocidad de la reaccin enzimtica no aumenta aunque
aumentemos la concentracin de sustrato, lo cual es debido a
que en ese momento todos los enzimas presentes estn
actuando a pleno rendimiento y ya no pueden aumentar la
produccin de producto. En ese momento se dice que el enzima
est saturado por el sustrato.

7.- Cmo se explica que la inhibicin

competitiva sea reversible?
La inhibicin reversible puede ser descrita cuantitativamente
en trminos de la unin del inhibidor a la enzima y al complejo
enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinticas de la
enzima. En el esquema clsico de Michaelis-Menten mostrado
abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el

complejo enzima-sustrato (ES). En la catlisis, este complejo se

rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor
(I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de
disociacinKi o Ki', respectivamente

8.- Existe corrientemente algn tipo de relacin entre

la estructura qumica del sustrato y del inhibidor
competitivo de una reaccin enzimtica. Es esta una
condicin necesaria para este tipo de inhibidores?
El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma
enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la
izquierda.
Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad
por el sitio activo de una enzima donde el sustrato tambin se
une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio
activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar
con concentraciones suficientemente altas del substrato, es
decir, dejando fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores
competitivos tienen comnmente Los inhibidores competitivos
son a menudo similares en estructura al substrato verdadero

9.- Cmo puede reconocerse experimentalmente que

la inhibicin de una reaccin enzimtica es competitiva?
Por ello este tipo de inhibicin se caracteriza en que puede
disminuirse considerablemente aumentando la concentracin de
sustrato.
En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que
estructuralmente son muy parecidas al sustrato y que por lo
pueden ocupar el lugar que ocupara el mismo sobre la enzima
pero que no pueden ser atacas por la misma.

 Este tipo de inhibicin es el de la inhibicin de la succinato

deshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el cido
succnico, por otras sustancias estructuralmente parecidas al
cido succnico, como el cido malnico, el cido oxlico, y el
cido glutrico

10.- De que factores depende el grado de inhibicin

logrado por un inhibidor competitivo?
El inhibidor slo se une al complejo enzima - sustrato, que ya
no formar producto, por lo que la velocidad bajar. El inhibidor
no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace
que
cambie
la
conformacin y
KI = [E]. [I]/ [ESI]
el enzima ya no es
tan efectivo.

No se puede superar la inhibicin aumentando la

concentracin de sustrato. La V con inhibidor (VI) ser ms
pequea.

El Km ser ms pequeo, como si tuviera ms afinidad:

El resultado es una recta nueva que corta en un valor ms

grande de ordenadas y con pendiente igual. Si aumentamos la
concentracin de inhibidor obtenemos una familia de rectas
con pendiente igual y corte en ordenadas ms grande.

11. En que circunstancia puede el sustrato de una

enzima actuar como inhibidor competitivo de la misma
enzima?
El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma
enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la
derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene
afinidad por el sitio activo de una enzima en el que tambin se
une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten
para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo
de inhibicin se puede superar con concentraciones
suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando
fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores
competitivos son a menudo similares en estructura
al sustrato.

12.- Qu tipo de inhibidor es el

bisulfito de sodio 0.1M?

Es un inhibidor no competitivo

13.- Qu tipo de inhibidor es el malonato 0.1M?

Es un inhibidor competitivo

14.
competitivo?

Que

se

entiende

por

inhibidor

no

Inhibicin no competitiva: Es una forma de una inhibicin

mixta donde la unin del inhibidor con la enzima reduce su
actividad pero no acepta la unin del sustrato. El grado de
inhibicin depende de su concentracin.

 Tienen afinidades idnticas por (E) y (ES) (Ki = Ki'). La

inhibicin no competitiva no cambia la Km (es decir, no afecta a
la unin del sustrato) pero disminuye la Vmax (es decir, la unin
del inhibidor obstaculiza la catlisis).

15. Qu efecto tiene el aumento de la concentracin

del sustrato sobre la inhibicin no competitiva de una
reaccin enzimtica?
No tiene ningn efecto.
Cmo puede explicar este fenmeno?
El grado de inhibicin en este caso depende solamente de la
concentracin de inhibidor y no de la concentracin del
sustrato.Este tipo de inhibicin no es reversible cuando
aumenta la concentracin del sustrato.

16.-Que podra decir respecto a la especificidad de

los inhibidores no competitivos.

Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la

superficie de la enzima, denominada sitio activo, donde tiene
lugar la catlisis. La estructura tridimensional de este sitio
activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni
siquiera sus ismeros) es lo que determina la especificidad de
las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894)
enunci: "el sustrato se adapta al centro activo o
cataltico de una enzima como una llave a una
cerradura"

17. Existe corrientemente algn tipo de similitud entre

la estructura qumica del inhibidor no competitivo y la
del sustrato natural de la enzima? sta es una
condicin necesaria para este tipo de inhibidores?

Como se observa en la imagen no existe similitud entre

la estructura qumica del inhibidor no competitivo y el
sustrato de la enzima, a diferencia del inhibidor competitivo
que en relacin a l si existe una similitud entre ambos

sta si es una condicin necesaria para los inhibidores

no competitivos, ya que el sustrato se enlaza a la enzima en
un lugar diferente del centro activo.


18.- Cmo puede reconocerse experimentalmente
que la inhibicin de una reaccin enzimtica es no
competitiva?
Los inhibidores no competitivos tienen afinidades
idnticas por (E) y (ES) (Ki = Ki'). La inhibicin no competitiva
no cambia la Km (es decir, no afecta a la unin del sustrato)
pero disminuye la Vmax (es decir, la unin del inhibidor
obstaculiza la catlisis).[3]

El mecanismo de la inhibicin parcialmente

competitiva es similar al de la inhibicin no competitiva,
excepto que el complejo EIS tiene actividad cataltica, la cual
decrece o incluso aumenta (activacin parcialmente
competitiva) en comparacin al complejo enzima-sustrato
(ES). Esta inhibicin suele exhibir un valor ms bajo de Vmax,
pero un valor de Km inalterado.

19.- Anotar sus observaciones

Resultados, y explicarlos en la Discusin.

en

la

seccin

INHIBICION DE LA UREASA

COLO
R

TUB
O

Tubo
Blan
co

Amarill
o claro

EXPLICACIN

No hubo reaccin

blanco

Tubo
01

blanco

Tubo
02

Blanco

Tubo
03

Blanco

Tubo
04

Si hubo reaccin
por ausencia de
inhibidor

No hubo reaccin
por inhibidor

Si hubo reaccin
por mayor
concentracin de
sustrato

No hubo reaccin
por inhibidor

Al analizar los resultados utilizando el mtodo de colorimetra

observamos diferencia de color en las muestras 1 y 3. En el
primer caso el color indica formacin de producto debido a que
no hay presencia de inhibidor; en el otro caso tambin se
produce reaccin pues al aumentar la cantidad de sustrato no
se desplaza al inhibidor, solo se disminuye la velocidad de
reaccin.

Los tubos 2 y 4 presentan el mismo color que el tubo blanco

debido a que en el segundo tubo el inhibidor bloquea la
reaccin impidiendo as la formacin de producto; en el tubo no
hay formacin de producto debido a que no hay presencia de
enzima durante la reaccin.


INHIBICION DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

T
U
B
O
T
u
b
o

EXPLICACIN

Solo presenta el color del indicador no

hay variacin

0
1

T
u
b
o

Solo observa el color del indicador no

hay cambio.

0
2

T
u
b
o

Este tubo presenta sustrato, enzima y

el indicador y se observa cambio
de color

0
3

T
u
b
o
0

Este tubo presenta sustrato, enzima e

indicador pero el color no varia ya que
se presenta un inhibidor que bloquea y
hace que el color se mantenga igual al
indicador

T
u
b
o

Este tubo presenta sustrato enzima e

indicador pero tambin presenta el
inhibidor pero es muy bajo comprado
con el Succinato y no existe un
bloqueo por eso el color varia

0
5

Podemos observar cambio de color en las muestras 3 y 5: En el

primer caso la muestra no contiene malonato (inhibidor), por lo
tanto se ha producido reaccin; en la segunda muestra se
increment la concentracin de sustrato y se produce flujo de eque son absorbidos por el indicador, el inhibidor es desplazado
debido a que es competitivo.

En los tubos 1,2 y 4 las muestras mantienen el color azul del

indicador lo cual indica que no se produjo reaccin debido a que en
el tubo 1 no hay sustrato, el segundo tubo no contiene enzima y
en el tubo 4 la reaccin es bloqueada por la presencia del
inhibidor.

V.

ANEXOS.

A. INHIBICIN DE UREASA.

Fig. 1
Sistema
De Incubacin

Fig. 2
Se transfiri 0.1 mL de
c/u de los tubos de la
parte
1
a
sus
correspondientes en la

Fig. 2
Tubo blanco: 4 ml. de
Agua destilada y 0.5
de Reactivo de Nessler

Fig. 4
Se le aadi 3.9 ml de
Agua destilada y 0.5 ml
de Reactivo de Nessler y
se dej reposar por 5 min.

A. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.

Fig.5
Sistema de incubacin
y evaluacin del efecto
inhibidor del malonato

Fig. 6
Se
le
aade
el
Homogenizado
Heptico por eso el
tubo 3 y 5 cambian de