INFORME - FRACCIONAMIENTO

OBTENCIN Y ANLIS DE FRACCIONES CELULARES

Objetivos.1

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1. Identificarlas fracciones celulares a partir de hgado de pollo.
2. Deducir el rendimiento y pureza de cada fraccin.
3. Conocer la tcnica de fraccionamiento celular para el estudio de las organelas
celulares.
4. Usar colorantes que identifiquen organelas especficas celulares.
5. Distinguir los tipos de microscopa de campo claro y fluorescencia en las muestras
preparadas.

Fundamento terico.De qu se trata el fraccionamiento celular?

El fraccionamiento subcelular es un conjunto de
que tienen como objetivo obtener fracciones puras o
determinado componente celular, ya sea ste un
(mitocondrias, ncleos, peroxisomas, etc.) una
membrana (membrana total, plasmtica, dominio
apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto
microtbulos, poros nucleares, etc.).

mtodos y tcnicas
enriquec idas en un
orgnulo
fraccin
de
basolateral, dominio
de
actina,

Fases:

Pre-analtica: Obtencin preparacin preliminar de la muestra hasta llegar al laboratorio

Analtica: o de aplicacin de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe

Pos- analtica: Validacin tcnica del informe analtico.

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:

Rotura de las clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fraccin deseada se
encuentre en condiciones adecuadas para su purificacin.
Separacin de la fraccin deseada del resto de componentes de la clula o del tejido mediante algn criterio
como puede ser una diferencia de densidad (centrifugacin en gradientes o centrifugacin diferencial), la
presencia de algn antgeno (cromatografa de inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, etc.).

Tcnicas de rotura de clulas y tejidos

El primer paso en la purificacin de la mayora de las protenas y estructuras
subcelulares es la rotura de los tejidos o de las clulas para obtener un lisado celular en
el que la protena, el complejo multiproteico o la es tructura subcelular se
encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue
empleando procedimientos mecnicos suaves conocidos generalmente como
homogenizacin. Estos mtodos producen la rotura de las membranas
celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
2

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Los procedimientos de homogenizacin ms comunes son:
La purificacin de cada uno de los principales organelos subcelulares represent un gran logro en la Biologa
celular al hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metablicas.
La purificacin se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmtica, o de ambas. Las clulas
deben estar suspendidas en una solucin con pH y concentracin de sales apropiada. Normalmente se emplea
sacarosa isotnica (0,25%) o una combinacin de sales similar a las de la clula.
El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:

1. HOMOGENIZACION.2.

Se trata de romper las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a
las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogeneizador. Clulas anexas: primero se
deben romper conexiones con otras clulas. Clulas no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta
forma, densidad o caractersticas que puedan marcarse. Existen dispositivos de homogenizacin en los
que est calibrada la separacin entre el mbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con
un tamao de partcula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y posteriormente de las
clulas con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estn todos los componentes celulares, para
lo cual podemos recurrir a diversos mtodos fsicos.

1.2. MORTERO Y MANO.ES un mtodo convencional de rompimiento por friccin. Pueden emplearse materiales abrasivos como
cuarzo, vidrio molido, arena, o materiales silceos. La masa celular contenida en un volumen de buffer se
mezcla con un volumen de medio moledor (0.51).
La friccin sobre las clulas genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar. Actualmente se
dispone de homogeneizadores ms sofisticados que emplean el
mismo principio, pero
que permiten controlar el nivel de friccin y la temperatura del proceso,
son
conocidos
como plotters. Los principales problemas de esta tcnica son: la
eficiencia
baja
cuando se usan pequeas cantidades de medio moledor cuando es
baja la concentracin
celular; la friccin genera calor y pueden presentarse alteracin en las
protenas

1.3. SONICACION.Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular. La intensa agitacin producida destruye
las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden destruir
asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frio para
evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podra provocar la desnaturalizacin de las protenas.
Se transmite una corriente elctrica a un sistema mecnico que la convertir en vibraciones de alta intensidad
generndose ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscpicas, las cuales se expanden y
colapsan contra las clulas causando la ruptura de su membrana. Este fenmeno
llamado cavitacin puede incrementarse adicionando al medio finsimas esferas de vidrio.

FILTRADO.Se

denomina filtracin al

proceso

unitario

de

separacin

de

en suspensin en un lquido mediante un medio poroso, que retiene los slidos y permite el pasaje del lquido.

slidos

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Las aplicaciones de los procesos de filtracin son muy extensas,

encontrndose

en

muchos mbitos de la actividad humana, tanto en la vida

domstica

de

la industria general,

aquellos

procesos

de

prctico,

donde

son

particularmente

importantes

como

industriales que requieren de las tcnicas qumicas.

La filtracin se ha desarrollado tradicionalmente desde un estudio
recibiendo una mayor atencin terica desde el siglo XX. La
filtracin y los equipos es diversa y en general, las categoras de

arte

clasificacin de los procesos de

clasificacin no se excluyen

unas de otras.
La variedad de dispositivos de filtracin o filtros es tan extensa como las variedades de materiales porosos
disponibles como medios filtrantes y las condiciones particulares de cada aplicacin: desde sencillos dispositivos,
como los filtros domsticos de caf o los embudos de filtracin para separaciones de laboratorio, hasta grandes
sistemas complejos de elevada automatizacin como los empleados en las industrias petroqumicas y de refino.

CENTRIFUGADO (PURIFICACIN).La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de difer ente densidad por medio
de una fuerza giratoria. La fuerza centrfuga es provista por una mquina
llamada centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotacin que
origina una fuerza que produce la sedimentacin de los slidos o de las partculas de
mayor densidad.
Los componentes ms densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotacin de la
centrfuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan
hacia el eje de rotacin. De esta manera los qumicos y bilogos pueden aumentar la
fuerza de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitacin del
sedimento en la base del tubo de ensayo de manera ms rpida y completa.

Higado de pollo.Es la ms voluminosa de las vsceras y una de las ms importantes por su actividad metablica. Es un rgano
glandular

al

que

se

adjudica

funciones

muy

importantes,

tales

como la sntesis de protenas plasmticas, funcin

desintoxicante,

almacenaje

secrecin

de vitaminas y glucgeno,

adems

de

de bilis,

entre otras. Tambin es el responsable de eliminar de

la sangre las

sustancias

organismo,

que

pu

edan

resultar nocivas para

el

convirtindolas en inocuas; est presente en el ser

puede hallar en vertebrados y algunas otras especies del reino animal.

Materiales.4

humano y se le

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MATERIALES DEL LABORATORIO

1. Mortero
2. Gasa
3. Tubos de ependorf de 1,5ml
4. 2 beaker de 100ml
5. Verde de janus Cubetas con hielo
6. 1 BEAKER de 50ml
7. Buffer tris 10 nM pH 7,5
8. Colorante Hoechst 33258
9. Mytotracker
10. Lminas y laminillas
11. Microscopio de campo claro y fluorescencia
12. 10 gr. De hgado de pollo.
Procedimientos:
1. Se coloc el hgado en el mortero, se moli llegando a tener una pasta de forma uniforme, luego se
le adiciono 20 ml de tris, 10nM pH 7,5, y al final con una gasa filtrarlo a un beacker pequeo
2. Con ayuda de la micro-pipeta pasamos a dos tubos eppendorf 20 l, luego se agreg 500 l de la
solucin de buffer Tris 10 mM pH 7,5. En los tubos rotulados con la palabra ncleo, se lo llevo a la
mquina de centrifugado y se lo centrifugo por 3 min.
3. Se coloc el sobrenadante del proceso de los ncleos en 2 tubos eppendorf nuevos, rotulados con
la palabra mitocondria, al igual que en el procedimiento anterior se lo llevo a la mquina de
centrifugado, centrifugando este por 8 min. a 10000 rpm. Se elimin el sobrenadante quedando la
fraccin mitocondrial y resuspendi el pellet en 200 l de buffer Tris 10 mM pH 7,5.
4. PARA OBSERVAR NCLEO: Se coloc 10 l del resuspendido del tubo marcado como ncleo, en
una lmina porta objeto con ayuda de una gota de azul de metileno la cual se cubri con una lmina
cubre objeto.
En otra lmina adicion 10 l del colorante Hoechst 33258 y se cubri con una lmina cubreobjeto y
esta se dej reposar por 2 min.

5. PARA OBSERVAR MITOCONDRIAS: Se tom el tubo marcado como mitocondrias y en un

eppendorf de 0,5 ml adicion 5 l del resuspendido y 5 l del colorante mytotracker el que se dej
incubar por 10 min a 37C. En otro eppendorf de 0,5 l realizo la misma operacin y adicion 5 l del
colorante verde de Janus. Se realiz un frotis y observo en 400x

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ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.1. Al momento de la experimentacin, cuando echamos agua fra a nuestra mezcla
es necesario que este fra y Por qu? Lo que pasa en que la estructura de
hgado de pollo tiene enzimas que puede afectar la muestra y deteriorarla al
momento de echar agua fra lo que hacemos es neutralizar estas enzimas para
que no causen ningn efecto.
2. Por qu es necesario que juntar ciertos colorantes con ciertas estructuras,
ejemplo, queremos examinar los ncleos del hgado de pollo , pero no podemos
poner cualquier colorante , tiene que ser uno con carcter bsico , ya que, los
ncleos portan ADN y lo que hace que sea acido es el grupo fosfato y al echar un

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colorante bsico como el azul de metileno lo neutraliza haciendo que la muestra
sea ms visible.
3. Es necesario hacer todo el proceso de fraccionamiento celular; ya que, en este
caso el hgado tiene muchas estructuras que no queremos visualizar y
necesitamos centrarnos en lo que realmente queremos por eso tenemos que
homogenizar, filtrar y purificar nuestra muestra para separar todo lo que no nos
interesa.
4. En un microscopio de fluorescencia se pueden apreciar las estructuras mejor, ya
que, este se centra en las estructuras internas especficas.

Conclusiones. En esta prctica de laboratorio aprendimos que el procedimiento debe hacerse en temperatura fra para
mantener el buffer tris y este a su vez nos ayuda a limpiar unas encimas de la clula para que sea ms
fcil observarla.
Aprendimos que algunos colorantes como es el azul de metileno o el verde de Janus le da un color a la
clula pero por ser una solucin base esta puede ser absorbida mejor por algunas organelos para
reconocerlas de mejor manera.
Se de buscar el equilibrio del pH para que las muestras reaccionen mejor, que sean de carcter bsico o
alcalino con cido.
Las tcnicas de fraccionamiento se deben seguir al pie de la letra, pues los resultados no pueden ser
favorables para elaborar el informe.

Recomendaciones.1. Al momento del centrifugado las muestras tienen que estar una frente a la otra
para que all equilibrio y los resultados sean ms favorables.
2. Escuchar o anotar todos los pasos que propuso la profesora , porque es una
experimentacin rebuscada y los resultados podran variar

Linkografa.http://www.tiposdemicroscopio.com/
http://www.acefesa.es/filtra/filtracion.pdf
http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm
http://es.slideshare.net/kokitupakoma/informe-n-3-fraccionamiento-celular
http://www.myliverexam.com/es/el-higado.html
http://docsetools.com/articulos-para-saber-mas/article_41069.html
https://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20070401112400AAFA8Nx

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