La adsorcin de alfa-lactoalbmina del suero de la leche hidroxiapatita: Efecto

del pH y de la temperatura y el anlisis termodinmico

de adsorcin de alfa-lactoalbmina de la leche de suero de leche en hidroxiapatita:
Efecto del pH y de la temperatura y el anlisis termodinmico
Rita Superbi de Sousa I, *; Jane Selia dos Reis Coimbra II; Liliana de Luca Augusto
Xavier I; Leomir Samuel Tormen Reyes I
I
Departamento de Qumica de la Universidad Federal de Viosa, 36570-000 Viosa MG, Brasil II Departamento de Tecnologa de los Alimentos de la Universidad Federal
de Viosa, 36570-000 Viosa - MG, Brasil
Recibido
el
07/25/2013
Aceptado
el
02/21/2014
Publicado en la web en 05/06/2014
Direccin postal
*
E-mail: rita.sousa@ufv.br
RESUMEN
Los beneficios nutricionales y funcionales ofrecidas por protena de suero lactoalbmina justifican el gran inters en su fabricacin en grandes cantidades en un
nivel de alta pureza. La hidroxiapatita es un material de fosfato de calcio capaz de
adsorber las protenas y puede ser sintetizado a bajo costo de produccin. Por lo
tanto, este trabajo evalu la adsorcin de -lactoalbmina de hidroxiapatita usando
datos de equilibrio fase slido-lquido reportados la adsorcin isotermas. Anlisis de la
termodinmica de Van't Hoff Mostr Que el proceso de adsorcin es impulsado
entrpicamente.
Palabras clave: Bioseparation; Energa libre de Gibbs; Modelo de Langmuir.
INTRODUCCIN
El suero de leche es la ms abundante subproducto de la industria lctea. Es rico en
protenas que tienen diferentes propiedades de inters acadmico e industrial, tanto en
trminos de funcionalidad tcnica o funcionalidad biolgica. De hecho, una de las
protenas de suero presentes en, la -lactalbmina (-LA) se puede manipular tanto
como aditivo alimentario o como un nutracutico.
La alfa es un polipptido de cadena nica con residuos de cido 123 aminocidos, 67
de los cuales son aminocidos esenciales.Dispone de una secuencia de aminocidos
homloga a la lisozima. El alpha se estabiliza por cuatro puentes disulfuro. Cuenta con
un grupo tiol libre (que podra servir como punto de partida para una reaccin de
agregacin covalente) y por lo tanto no forman geles siguientes desnaturalizacin y la
acidificacin. Muestra la capacidad de unirse a los iones de calcio y otros metales
como el zinc. La molcula nativa tiene dominios a-helicoidales y las hojas beta. 1.2
Segn Eigel et al., 3 a alpha que existe en dos formas de genes (A y B) que difieren de
residuo en la dcima posicin en la que la forma de realizacin tiene una glutamina
(Gln) est sustituido por arginina (Arg ) en la variante B. Y, segn Fox, 4 hay un medio
adicional (C). La a es un pequeo peso molecular de protena globular de 14.178 Da.
El punto de entre 4,2 y 4,5 isoelctrico. La -La es de aproximadamente 20% de la
protena total de suero de leche y aproximadamente 3,5% de la protena total de la
leche.
Debido a su contenido en aminocidos esenciales, los fabricantes de alimentos,
suplementos alimenticios y de nutricin deportiva tratar de incorporarlo en productos

con diferentes caractersticas. El uso de a como un aditivo alimentario se debe a su

capacidad de comprobar o cambiar las propiedades tcnicas y funcionales en
alimentos, sobre la solubilidad y la capacidad para formar emulsiones y espumas. En
el campo biolgico el uso de alfa que est relacionado con el desarrollo de
formulaciones, tanto para la nutricin clnica, debido a su alto contenido de triptfano, y
para la prevencin de la enfermedad debido a la presencia de pptidos bioactivos en
su estructura. La literatura indica que los pptidos de alfa puede exhibir actividad
bactericida, antitumoral y. Antihipertensivo 5-7 Adems, bovino que tiene una alta
similitud con el humano que 5 por lo que es un componente clave para la preparacin
formulaciones para los recin nacidos en el perodo neonatal, terapia prematuro y
nutricional en lactantes.Eugene y Berliner 7 indican que la humana -la, bajo
condiciones especficas de pH y en presencia de cido oleico, polimeriza y adquiere
propiedad apoptosis (capaz de destruir las clulas cancerosas de diversos linajes y no
diferenciado clulas jvenes), no es no tomar ninguna accin sobre clulas adultas
normales. Sin embargo, para la produccin a gran escala de es necesario buscar
tcnicas de bajo costo para separar y purificar las fracciones de suero rico en a ella y
proporcionar sus datos cientficos. 8
En este contexto, el empleo se hizo hincapi en las operaciones de adsorcin en
diversos procesos industriales, incluyendo el fraccionamiento de mezclas complejas de
protenas. Para soluciones diluidas de protenas, tales como suero bovino, grandes
volmenes de lquido que debe ser procesado para recuperar una masa fija de
protena. Adsorcin selectiva de operaciones son los ms afectados por la cantidad y
la concentracin de protena adsorbida que el volumen del lquido procesado porque la
capacidad adsorbente es la ms afectada por la masa adsorbida que el volumen
procesado. Adsorcin selectiva o procesos selectivos incluyen cromatografa de
intercambio inico, la cromatografa de afinidad y una clase ms general referido
simplemente como cromatografa de adsorcin, para el mecanismo de adsorcin an
no est totalmente entendido. 9 Ejemplos de esta ltima clase incluyen el uso de
hidroxiapatita, cuya adsorcin debido a las interacciones hidrfilas. Por lo tanto, se
puede considerar que el fosfato clcico en forma de hidroxiapatita (Ca 5 (PO 4) 3 OH)
es un material que tiene las caractersticas fsicas de un adsorbente. 10 Hidroxiapatita
es un constituyente mineral usado en el rea biomdica hueso reparar el y en la
fabricacin de los implantes dentales debido a su excelente biocompatibilidad, la
biodegradacin lenta, osteoconductividad y propiedades mecnicas. 11Adems, debido
a su afinidad por las protenas, la hidroxiapatita se ha utilizado como un adsorbente
selectivo para la separacin y purificacin de estos biomolculas.
Por lo tanto, en vista de los datos experimentales necesidad de analizar la viabilidad
de la utilizacin de la hidroxiapatita para la eliminacin de suero de leche -la, en este
trabajo se obtuvieron informacin sobre el comportamiento de adsorcin del sistema
por medio de los datos de equilibrio de slido neta reportada en forma de adsorcin y
la evaluacin de las isotermas de parmetros termodinmicos de la operacin de la
unidad de adsorcin.
Modelado de las isotermas de adsorcin
La distribucin de soluto entre la fase fluida y la fase adsorbida implica un equilibrio de
fase, que se rige por los principios de la termodinmica. Datos de equilibrio son
reportados generalmente en la forma de las isotermas de 12 son diagramas que
muestran la variacin de la concentracin de equilibrio del adsorbente slido con la

concentracin de la fase fluida, a una temperatura especfica. La determinacin

experimental de las isotermas es el primer paso en el estudio de un nuevo sistema de
soluto / sorbente. La informacin as retirada es importante en la estimacin de la
cantidad total de adsorbente necesaria para un determinado proceso y por lo tanto el
dimensionamiento del equipo para ser utilizado en un proceso de este tipo de
adsorcin. 13Los estudios de equilibrio proporcionan informacin fundamental para
determinar la cantidad mxima de soluto adsorbido por masa adsorbente, as como el
adsorbente afinidad por el soluto. 14
El modelo de la isoterma de Langmuir (Ecuacin 1) ha sido ampliamente utilizado para
describir las isotermas de adsorcin de protenas en intercambiadores de iones. 9,15,16

en donde q es la concentracin de protena adsorbida sobre la fase slida (mg g 1), k d es la constante de disociacin (kg ml -1) y Q m es la capacidad mxima de
adsorcin (mg g -1) y C ( mg ml -1) es la concentracin de protenas en la fase lquida
despus de que se alcance el equilibrio.
El modelo de isoterma de Langmuir tiene algunas simplificaciones, tal como la
superficie slida contiene un nmero definido de sitios para la adsorcin; cada sitio
slo puede adsorber una molcula; todos los sitios son energticamente
equivalente; las molculas adsorbidas no interfieren con la adsorcin de los sitios
vecinos; en equilibrio, la tasa de adsorcin es igual a la tasa de desorcin; la superficie
es completamente uniforme desde el punto de vista energtico; corresponde a la
monocapa de saturacin mxima adsorcin de molculas de adsorbato en la superficie
de la adsorbente. Sin embargo, a pesar de las simplificaciones, el modelo de Langmuir
ha sido utilizado con xito para describir la adsorcin de diversas protenas en
diversos adsorbentes, debido a su simplicidad. 13.17
Proceso de adsorcin Termodinmica
Una revisin de los parmetros termodinmicos, tales como el cambio de entalpa
estndar de adsorcin, entropa estndar de adsorcin y Gibbs patrn de energa libre
de adsorcin puede llevarse a cabo utilizando una relacin entre la temperatura y el
factor de capacidad, k ', por el modelo conocido como ecuacin de Van't Hoff. 18

donde la capacidad del factor k ', DH

anuncio

y Ds 0 anuncio, respectivamente, los cambios de entalpa y entropa

de adsorcin norma, R es la constante universal de los gases, T la temperatura y constante de sistema depende de la relacin entre fases y es
19
constante con la temperatura.

Los valores de k 'se calculan a partir de la siguiente relacin:

en la que q m k d son parmetros del modelo de Langmuir.

La curva de LNK 'frente a 1 / T proporciona entonces una relacin lineal que la
inclinacin se puede utilizar para determinar el valor DH 0 d. Aunque simple uso, sin
embargo, este mtodo ha limitado, ya que los valores son el promedio de los valores
reales en el estudio de las temperaturas, que genera una pequea cantidad de
informacin sobre DH 0 ad a temperaturas especficas. 18Sin embargo, Boysen et
al . 20 muestran que cuando la entalpa y la entropa son dependientes de la
temperatura, la curva LNK'frente a 1 / T proporciona una relacin no lineal puede
aproximarse por un polinomio de segundo grado, segn la expresin:

donde a, byc son parmetros empricos.

Por lo tanto, la ecuacin derivada 2 compar a 1 / T, se obtiene:

y derivar la ecuacin 4, en relacin a 1 / T, que tiene:

As, se puede equiparar las expresiones (5) y (6) para dar la ecuacin 7:

Por lo tanto, de la ecuacin 7 puede determinar la entalpa estndar de adsorcin,

como una funcin de la temperatura.
Segn Levine 21 la variacin de la energa libre de Gibbs estndar (? G 0) puede ser
determinada por la Ecuacin 8:

donde K es la constante de equilibrio para una reaccin. En el proceso de adsorcin

de acuerdo Boysen et al., 20 K puede ser reemplazado por k '/ para obtener Delta
G 0 d utilizando la ecuacin 7.
Entonces, la entropa estndar de adsorcin, Ds 0 Ad, puede calcularse a partir de la relacin de Gibbs-Helmholtz:

Material y mtodos
La hidroxiapatita, tipo I, se adquiri de Sigma Aldrich. La -lactoalbmina era cortesa
de Ingredientes Davisco Comida Internacional (Eden Praire, USA).
Experimentos de adsorcin en tanque agitado
La adsorcin -it en experimentos de hidroxiapatita se llevaron a cabo en tanques
agitados a diferentes valores de temperatura (5, 15, 25 y 35 C) y pH (4.0, 6.0 y
8.0). Los tampones utilizados fueron: i) fosfato de sodio monobsico + fosfato sdico
dibsico, en proporciones apropiadas para el pH 6,0 y 8,0 ajustes; y ii) el cido ctrico
+ fosfato de sodio dibsico para ajustar el pH 4,0.Cada lote se llev a cabo como se
describe por Souza, 22 en un tubo Eppendorf de 2 ml contiene 50 mg de
hidroxiapatita. Para todos los tubos se aadi 500 uL trabajo pH. La misma se dej en
agitacin durante 12 h, debe garantizarse para alcanzar el equilibrio con el tapn de
resina. El ensayo de la cintica de adsorcin por lotes se realiz previamente de una
manera similar a la determinacin de las isotermas se diferencian slo en la
concentracin inicial de la muestra (10 mg l -1) y el tiempo de coleccin, que vari de 1 min a 12 h. La prueba
revel que se alcanz el equilibrio dinmico en 120 min. Sin embargo, la orientacin
una comparacin con los datos de la literatura para el comportamiento de adsorcin de
protenas de suero en resinas comerciales adopt el intervalo de 12 horas con el fin de
garantizar el tiempo suficiente para que el sistema alcance el equilibrio. 23-25 de
Despus de este tiempo, se aadi a los tubos de varios volmenes de solucin de
protena, preparado en tampn de solucin de trabajo, de modo que cada tubo tena
una concentracin inicial de diferente protena resultante en un gradiente de
concentracin de protena a lo largo de los tubos, un volumen total finales de 1800

uL. A continuacin, los tubos que contenan solucin de hidroxiapatita y la protena se

dej bajo agitacin suave durante aproximadamente 12 h.
Despus de este perodo, la fase slida se separ de la fase fluida por centrifugacin a
7000 g durante 15 minutos. Una alcuota del sobrenadante (que contiene la protena
no adsorbida) fue tomada de cada tubo para la cuantificacin de protena en la fase
fluida utilizando el mtodo espectrofotomtrico de la absorbancia a 280 nm de lectura
directa (espectrofotmetro Hitachi U-2000, American Laboratory Trading EE.UU.). La
concentracin de protena adsorbida por masa de adsorbente (q) se ha calculado
utilizando la ecuacin 10:

y c 0 la concentracin inicial de protena (mg ml -1), c la concentracin de protena en

la fase fluida (mg ml -1), V el volumen de la solucin de (U) y m la masa de adsorbente
(g). El modelo matemtico Langmuir se ajust a partir de datos obtenidos
experimentalmente de equilibrio (SigmaPlot 11, SystatSoftware Inc., 2008).
Anlisis termodinmico
Con base en los datos de equilibrio de adsorcin obtenidos por el modelo de Langmuir,
se utiliz el mtodo de van't Hoff no lineal para describir el comportamiento adsorbente
de la hidroxiapatita -LA. Por lo tanto, los parmetros termodinmicos DH 0 anuncio,
0
0
18
utilizando las ecuaciones 7-9.
Ds anuncio y? G anuncio se determinaron
RESULTADOS Y DISCUSIN
Las isotermas de adsorcin de a en HA
La Figura 1 muestra las isotermas de adsorcin de -la en pH 4.0 (a) 6,0 (b) y 8.0 (c).

Figura 1. isotermas para la adsorcin de HA- la: a) pH 4,0 b) pH 6,0 c) pH 8,0

Y en la Tabla 1 tiene equilibrios de adsorcin de -la hidroxiapatita analizadas las
condiciones de temperatura: 5, 15, 25 y 35 C.El modelo de Langmuir cuyos
parmetros se muestra en la Tabla 1, se ajust a los datos experimentales. Los
coeficientes de correlacin fueron superiores a 0,90 en todos los casos.

La dependencia de los parmetros Q m k d en funcin del pH y la temperatura se

determin mediante el anlisis de regresin (Ecuacin 11 y la ecuacin 12,
respectivamente). Los resultados mostraron un buen ajuste y todos los parmetros de
la ecuacin fueron significativas al 5% de probabilidad. Los superficies de respuesta
para los parmetros q m k d, el modelo de Langmuir se puede observar en las figuras 2 y 3.

Figura 2. Variacin q m como una funcin del pH y de la temperatura

Figura 3. Variacin k d en funcin del pH y de la temperatura

De acuerdo con las figuras 2 y 3 se observa que hay una mayor adsorcin de -la HA
alrededor de pH 6,0 y 25 C.
Varios parmetros experimentales pueden cambiar el comportamiento de la adsorcin
de protenas en los intercambiadores de iones. Entre ellos, es el tipo de tampn usado,

la naturaleza de la co- y contra-iones en solucin, temperatura, pH, fuerza inica y la

velocidad de flujo del eluyente. 13
Fontan, 18 estudiar el equilibrio de adsorcin en un intercambiador de iones,
Streamline Q XL, encontrado valores de q m que van desde 426 hasta 355 mg g 1
para el rango de temperatura de 10 a 40 C. Segn l, el proceso de adsorcin de
que esta resina de intercambio de aniones es exotrmica.
Conrad et al. 15 estudi la adsorcin de columna de lecho- LA expandido de la resina
con Streamline Fenil a temperatura ambiente y obtiene un valor de q m 19,28 mg g 1. Tercinier et al. 26 reportaron un valor de q m de aproximadamente 81 mg g -1a 25 C
para la adsorcin de protena de suero (WPI) en hidroxiapatita.
Segn Tercinier et al. 26 protenas de la leche de adsorcin en partculas de
hidroxiapatita no ha sido reportado en la literatura.Hay algunos estudios sobre las
interacciones entre las protenas de la leche y de HA para biomateriales como el hueso
o compuestos para la odontologa. 27 Ritzoulis et al. 28 utilizaron la unin caracterstica
en hidroxiapatita a una cermica porosa compuesta de protena de la casena
caseinato de sodio y de hidroxiapatita. Devold et al., 29 de estudiar la adsorcin in vitro
de protenas en el esmalte de los dientes de leche, mostraron que a pH neutro,
preferiblemente casenas se han relacionado con el esmalte dental, de formacin de
pelcula protenas.
Anlisis termodinmico
Los parmetros termodinmicos DH 0 anuncio,? G 0 ad y Ds 0 anuncio se determinaron
como una funcin de la temperatura para la adsorcin de operacin en hidroxiapatita
mediante anlisis no lineal van't Hoff trama. El pH de 6.0 fue elegido para el anlisis
termodinmico de los ms altos valores de q m se observaron en este pH. El segundo
ajuste polinmico orden del lnk de datos'frente a 1 / T se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Van't Hoff Grfico - lnk "frente a 1 / T

La ecuacin de la polinomio de segundo grado ajustado a los datos experimentales

mostrados en la Figura 4 es:

Por lo tanto, los valores de DH 0 d,? G 0 ad y Ds 0 d se calcularon usando las ecuaciones

7 a 9. Las figuras 5 a 7 muestran el comportamiento de cada uno de estos parmetros
termodinmicos dependiendo de la temperatura, con sus valores en cada temperatura
de trabajo se muestran en la Tabla 2.

Figura 5. Variacin de DH 0 anuncio con la temperatura

Figura 6. La variacin de Ds 0 anuncio con la temperatura

Figura 7. Variacin de? G 0 anuncio con la temperatura

Se ha encontrado que al aumentar la temperatura, hubo una disminucin en la

entalpa de adsorcin, la entropa de la adsorcin y la energa libre de Gibbs de la
adsorcin, y esta relacin es lineal.
As se puede decir que las condiciones estudiadas, el proceso de -it adsorcin sobre
hidroxiapatita es endotrmica, ya que todos los valores de DH 0 anuncio fue positivo y la
dependencia del valor DH 0 anuncio con la temperatura es pequea, si bien se observa
una disminucin de la entalpa de adsorcin con el aumento en la
temperatura. Fontan 18 seal tambin el mismo comportamiento tendencia para
DH 0 anuncio en la evaluacin de los termodinmica de la adsorcin de a en resina de
intercambio de aniones (Streamline Q XL). Los valores observados fueron similares a
los obtenidos para la hidroxiapatita.
Adems, se encontr que el proceso es conducido entrpicamente, debido al hecho de
que el trmino T Ds 0 anuncio en un valor ms alto que el DH 0 ad para todas las
temperaturas estudiadas, que asegura una contribucin entropa ms alta de
adsorcin que la entalpa de adsorcin, incluso si la diferencia entre estos valores es
relativamente pequeo.
Fontan, 18 estudiar el equilibrio de adsorcin en un intercambiador de iones,
Streamline Q XL, encontr valores de DH 0anuncio que van desde 25 hasta 0,5 kJ mol 1
en el rango de temperatura de 10-40 C. Los valores Ds 0 d vari de 70 a 150 J mol1
K -1 y Delta G valora 0 d vari de -20 a -16.5 kJ mol -1. Como se observa en el
presente
artculo,
los
parmetros
termodinmicos
analizados
por
Fontan 18 disminuyeron al aumentar la temperatura y ambos procesos eran
endotrmica, dirigida entrpicamente y ocurrieron espontneamente.
El alpha se considera una protena suave 30 que puede explicar la facilidad con la que
sus cambios de conformacin, sin soltar o absorber grandes cantidades de energa, es
decir sin variar significativamente la entalpa del sistema. Por el mismo motivo, los
cambios de conformacin con o sin grupos de liberacin, tales como molculas de
agua, tambin no alter significativamente la entropa del sistema. Sin embargo, la
contribucin de estos cambios conformacionales en la entropa es ligeramente mayor
que la contribucin entlpico, haciendo el proceso entrpicamente conducido, ya que
pueden haber cambios en la conformacin de la -la cuando se adsorbe en la
superficie de la hidroxiapatita.
Figura 7 permite afirmar que la energa libre de Gibbs de adsorcin,? G 0 d es negativo
y disminuye al aumentar la temperatura, lo que indica que el proceso de adsorcin es
espontnea en las condiciones estudiadas y tiende espontneamente a ser ms
pronunciada a temperaturas ms alto.

CONCLUSIN
En este trabajo el comportamiento de adsorcin de -lactoalbmina en hidroxiapatita
mediante la obtencin de las isotermas de adsorcin con posterior anlisis de los
parmetros termodinmicos del proceso de adsorcin. Se observ una tendencia de
aumento de los valores q m al aumentar la temperatura. La adsorcin se produjo con
mayor intensidad a pH 6,0 y 25 C. El anlisis termodinmico permiti la
determinacin de los datos de los cambios en la entalpa (DH 0 ad), entropa (Ds 0 anuncio) y
0
energa libre de Gibbs(? G
d) la adsorcin, la observacin de una reduccin de la misma al aumentar la temperatura. El estudiado la
adsorcin de a que en HA es un proceso impulsado endotrmica y la entropa. La
variacin de la energa libre de Gibbs adsorcin fue negativo, lo que indica que el
fenmeno de adsorcin es espontnea en las condiciones estudiadas.

Agradecimientos
En la Fundacin del Estado de Minas Gerais Investigacin (FAPEMIG) y el Consejo
Nacional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico (CNPq) de apoyo financiero.

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