Introduccion

Las primeras clulas eran relativamente simples y pequeas, similares a los

organismos que actualmente conocemos como procariontes. Con el pasar del
tiempo ya la evolucin de este organismo aparecieron las clulas
eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja, que hoy forman
parte de animales y plantas.
A diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un
ncleo que contiene la mayora del ADN el cual se encuentra envuelto en una
membrana. Esto deja al material gentico en un compartimento separado del
resto de los contenidos de la clula contenidos en el citoplasma, donde
ocurren las reacciones metablicas.
En el citoplasma se pueden distinguir distintos organelos: cloroplastos,
mitocondrias, retculoendoplsmico, aparato de Golgi, ribosomas,
peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales poseen diversas enzimas
que cumplen funciones especficas dentro de una clula.
Cada uno de estos organelos gracias a sus caractersticas y distintos mtodos
contribuyen con el funcionamiento de la celula como por ejemplo la
mitocondria le provee energa , el peroxisoma detoxifica a la celula,
ribosomas participa en tradunccion del RNA mensajero y citoesqueleto le da
forma, movimiento y ubica los organelos en el citosol.
Para llegar a tratar con estos organelos existen distintos mtodos pero el que
trataremos en este practico es el fraccionamiento Subcelular es una tcnica
utilizada que permite obtener los componentes celulares aislados, en grandes
cantidades y con un alto grado de pureza. Esta tcnica consiste en la
separacin de los componentes de la clula basndose en su tamao y
densidad por lo que los organelos con mayor densidad y tamao quedan en
el fondo del tubo, son llamado pellet y aquellos que poseen una menor
densidad con un menor tamao quedan suspendidos en una solucin de
nombre.
Objetivo: Comprender el fundamento de la tcnica de fraccionamiento
subcelular por medio del rompimineto de la celula y la separacin de los
organelos mediante un campo gravitacional e identificar los componente
celulares.

Materiales y Mtodos
Actividad 1 : Fraccionamiento subcelular

A)Fraccionamiento subcelular de Higado

-En este experimento el profesor tomo hgado, el cual lo puso en un vaso de
precipitado en donde corto el hgado con tijeras y lo puso en hielo para que
asi no ocurrieran reacciones en el hgado despus de esto procedi a moler el
hgado en la maquina de moler a (
)RPM y obtuvo el homogenizado total el
cual nos entrego 5 ml de este vertido en un tubo de Falcon, el cual pusimos
en hielo por unos 5 minutos y luego y asi obtuvimos el homogenizado crudo.
Despus llevamos el homogenizado a la centrifuga y la profesora lo puso a (
) por 10 minutos. Luego al retirarlo obtuvimos un sobredenante en la
superficie y un pellet al fondo del tubo, asi llevamos el sobredenante a otro
tubo falcon para separarlo del pellet. Luego al pellet le agregamos 1 ml de
buffer y lo resuspendimos con la pipeta entregada y lo llevamos al hielo
nuevamente. posteriormente llevamos el sobredenante a la centrifuga
nuevamente pero ahora a la mayor velocidad por ( ) minutos , y
nuevamente separamos el sobredenante del pellet en otro tubo falcon ,
despus el pellet obtuvido se le agrego Buffer, fue resuspendido y se puso en
Hielo.
B)Evaluacion del fraccionamiento subcelular mediante marcadores
moleculares.
-En este experimento la profesora nos facilito succinato azul metileno y
vertimos 1ml en 4 cuatro tubos de ensayo distintos enumerndolos
respectivamente , luego de esto al tubo numero 1 le echamos 1ml de agua al
numero 2 con ayuda de la profesora le echamos un poco de el primer pellet
obtenido y luego vaselina liquida para evitar la oxidacin de la muestra. Al
nmero 3 le echamos el pellet obtenido despus y la vaselina, y finalmente al
tubo numero 4 le echamos el sobredenante obtenido en la segunda
centrifugacin con vaselina, luego llevamos los tubos a un bao de
termoregulacion a 37C por unos 5 minutos aprox.
B.2)Observacion micrscopica de las fracciones
-En este experimento en un portaobjeto colocamos una gota de la suspensin
de nucleos con la ayuda de una pipeta y la observamos al microscopio.
Despues realizamos lo mismo pero ahora le agregamos una gota de azul de
tripan, y asi mismo lo realizamos con la suspensin de mitocondrias.