RECOMBINACION BACTERIANA

INTRODUCCION
Los procariotas, a diferencia de muchos eucariotas, no se reproducen
sexualmente. Sin embargo, en procariotas existen mecanismos de
intercambio gentico que, aunque considerablemente diferentes de
los implicados en la reproduccin de los eucariotas, permiten tanto la
transferencia de genes como su recombinacin.
La recombinacin gentica es el proceso por el que los elementos
genticos contenidos en dos genomas separados se juntan en una
unidad. Para que tenga xito la recombinacin gentica se requiere
que el ADN donado se replique en el microorganismo recombinante.
La replicacin se puede lograr por integracin del ADN donado en el
replicn del receptor o por el establecimiento del ADN donado como
un replicn independiente.
La transferencia del ADN entre cepas de procariontes est muy
difundida y contribuye de manera importante a la notable diversidad
gentica en las bacterias.

PRINCIPIOS GENERALES DE LA RECOMBINACION BACTERIANA

Los microorganismos llevan a cabo diversos; tipos de recombinacin.
La recombinacin general, la forma ms comn, suele consistir en un
intercambio recproco entre un par de secuencias homlogas de ADN.
Puede suceder en cualquier sitio del cromosoma y se debe a la rotura
y reunin de la cadena o hebra de ADN, que conduce al
entrecruzamiento. La recombinacin general corre a cargo de los
productos de los genes rec, como la protena recA, que tanta
importancia tiene en la reparacin del DNA. En la transformacin
bacteriana se produce una forma no recproca de recombinacin
general. Una porcin de material gentico es insertada en el
cromosoma mediante la incorporacin de una cadena nica para
formar un segmento de DNA heteroduplex. Un segundo tipo de
recombinacin, de especial importancia en la integracin de los
genomas virales en los cromosomas bacterianos, es la recombinacin
especfica de sitio. El material gentico no presenta homologa con el
cromosoma al que se une, y las enzimas responsables de este
proceso suelen ser especficas de cada virus en particular y de su
husped. Un tercer tipo, la recombinacin replicadora, acompaa a la

replicacin de material gentico y no depende de la homologa de las

secuencias. La emplean los elementos genticos capaces de
desplazarse por el cromosoma. Aunque la reproduccin sexual con la
formacin de un cigoto o clula huevo y su subsiguiente meiosis no
existe en las bacterias, puede producirse una recombinacin de
diversas formas tras la transferencia horizontal de genes. En este
proceso, los genes se transfieren de un organismo maduro e
independiente a otro. La transferencia horizontal de genes difiere
bastante de la transmisin de genes desde los padres a su
descendencia (transferencia vertical de genes). En general, una
porcin del ADN dador, el exogenote, debe entrar en la clula
receptora y convertirse en una parte estable de su genoma, el
endogenote. Existen dos formas de ADN capaces de desplazarse
entre bacterias. Si un fragmento de DNA es el vehculo de
intercambio, el exogenote debe entrar en la clula receptora e
incorporarse al endogenote como porcin de sustitucin (o como
porcin extra) sin ser destruido por el husped. Durante la sustitucin
de material gentico del husped, la clula receptora se convierte
temporalmente en diploide para una porcin del genoma, y recibe el
nombre de merocigoto. En ocasiones, el ADN existe en una
conformacin tal que no puede ser degradada por las endonucleasas
de la clula receptora. En este caso, el DNA no necesita integrarse en
el genoma del husped, sino que basta con que penetre en el
receptor para transferir su informacin gentica a la clula. La
mayora de los fragmentos lineales de ADN no se mantienen de forma
estable, a menos que se integren en el genoma bacteriano. El DNA
resistente, como el de los plsmidos, suele ser circular y tiene
secuencias que le permiten mantener su independencia respecto del
cromosoma del husped. De esta manera, la recombinacin en las
bacterias es una transferencia unidireccional de dador a receptor. La
recombinacin en los eucariotas tiende a ser recproca, es decir, se
conserva todo el DNA de los gametos que se originan finalmente tras
los procesos de meiosis y recombinacin. El desplazamiento del DNA
de una bacteria donadora a la receptora puede producirse de tres
formas: transferencia directa entre dos bacterias que han establecido
contacto fsico temporal (conjugacin), transferencia de un fragmento
de DNA desnudo (transformacin) y transporte del DNA bacteriano
por bacterifagos (Transduccin). Cualquiera que sea la forma de
transferencia, el exogenote slo tiene cuatro destinos posibles en el
receptor. En primer lugar, cuando el exogenote tiene una secuencia
homologa a una secuencia del endogenote, puede producirse la
integracin, es decir, puede aparearse con el DNA receptor e
incorporarse para producir un genoma recombinante. En segundo

lugar, el DNA extrao persiste en ocasiones fuera del endogenote y se

replica para producir un clan de clulas parcialmente diploides. En
Tercer lugar, el exogenote puede sobrevivir, pero no replicarse, de
forma que slo una clula es un diploide parcial. Finalmente, las
nucleasas de la clula husped pueden degradar el exogenote, un
proceso denominado restriccin por el husped. Es importante,
pues, recordar, que la transferencia es solo el primer paso en
procariotas para obtener organismos recombinantes, por lo
tanto en este trabajo primero hablaremos de los mecanismos
de transferencia y ms adelante todo sobre recombinacin
bacteriana en s.

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENETICO ENTRE BACTERIAS

Muchas bacterias, especialmente numerosas especies patogenas,
utilizan su ADN de forma promiscua. Transferiendo su ADN con otras
celulas, permite el intercambio de genes y caracteristicas entre ellas,
lo que ocaciona la aparicion de nuevas cepas bacterianas. Este
intercambio puede resultar ventajoso para el receptor, especialmente
cuando el ADN codifica mecanismos de resistencia a los antibioticos o
la adaptacin a cambios ambientales siempre y cuando el material
genetico donado se halla replicado en la celula aceptor.
El intercambio gentico entre bacterias se caracteriza por la
transferencia de fragmentos relativamente pequeos de un genoma
donador a una clula receptora. El ADN transferido puede integrarse
en el cromosoma del receptor o bien mantenerse de manera estable
en forma de elemento extracromosomico (plasmido) o como un virus
bacteriano (bacteriofago).
El intercambio gentico entre bacterias sucede por uno de los tres
mecanismos generales: Transformacin, traduccin y conjugacin.
Estos principales tipos de intercambio gentico es los procariontes se
diferencian por la forma en que se dona el ADN. La clula receptora
completa la estructura de ADN de doble cadena y por medio de la
sntesis de la cadena que complementa aquella adquirida del
donador. En la transduccin, el ADN se transporta dentro de la
cubierta de un fago y se transfiere al receptor por el mecanismo
utilizado en la infeccin por fagos. La transformacin, la capacidad
directa del ADN por la clula receptora, puede ser natural o forzada.
Relativamente
pocas
cepas
bacterianas
son
naturalmente
competentes para la transformacin; estas cepas asimilan el ADN que
se encuentra en forma lineal. La transformacin forzada se induce en
el laboratorio, en donde, despus de tratamiento con sales

concentradas y choques trmicos muchas bacterias se vuelven

competentes para asimilar plasmidos extracelulares. La capacidad
para forzar a las bacterias mediante transformacion a que incorporen
a los plasmidos extracelulares es fundamental en la ingenieria
genetica.

1. TRANSFORMACION
Como ya hemos notado, la transformacin gentica es un proceso
que implica la captacin de ADN libre del medio circundante que se
incorpora en una clula receptora y lleva a cabo un cambio gentico.
La transformacin fue el primer mecanismo de transferencia gentica
que se descubri en las bacterias. En 1928. Griffith observ que la
virulencia del neumococo se relacionaba con la presencia de una
cpsula de polisacrido que le rodeaba y que los extractos de
bacterias encapsuladas productoras de colonias lisas podan
transmitir este rasgo a las bacterias no encapsuladas, las cuales
presentan generalmente una morfologa rugosa. Alrededor de 15 aos
despus, los estudios de Griffith permitieron que Avery .Mc Leod y Mc
Carty identificaran el ADN como el principio clave del mecanismo de
transformacin.
Se han encontrado varios procariotas que son transformables en
condiciones naturales, incluyendo ciertas especies de Bacteria, tanto
Gram positivas como Gram negativas. Sin embargo, incluso dentro de
los gneros transformables, solo ciertas cepas o especies resultan
transformables.

EXPERIMENTO DE GRIFFITH

Competencia

Una clula fisiolgicamente capaz de tomar e incorporar una

molcula de ADN libre hacia el interior de sus genomas y ser
transformada se denomina competente. Solo ciertas cepas son
competentes; esta capacidad parece ser una propiedad determinada
genticamente.

La competencia aparece al final de la fase logartmica de crecimiento,

un cierto tiempo antes de que la poblacin bacteriana entre en la fase
estacionaria, aunque algunos organismos pueden ser competentes
todo el tiempo. Por ejemplo En Bacillos, aproximadamente el 20% de
las clulas se hacen competentes y permanecen as durante varias
horas. Sin embargo, en Streptococcus, el 100% de las clulas se
hacen competentes, pero solo durante unos minutos a lo largo del
ciclo de crecimiento.
En la mayora de las bacterias que se pueden transformar
naturalmente, la competencia est regulada y hay protenas
especiales que juegan un papel en el transporte y procesamiento de
ADN. Las protenas especficas de la competencia incluyen unas
protenas de membrana de unin de ADN, una autolisina de la pared
celular, y varias nucleasas.

Incorporacin de ADN

Las bacterias difieren en la forma en que incorporan el ADN aunque

en todos los casos solo entra en el citoplasma ADN monocatenario.
Por ejemplo, en Haemophilus, que es Gram negativa, competente
para la transformacin tiene receptores para ADN sobre la superficie
celular. La clula solo toma ADN bicatenario, a pesar de que solo se
incorporan en el genoma mediante recombinacin segmentos
monocatenarios. En bacterias Gram negativas, parece que el ADN
bicatenario es degradado a cadena sencilla. La unin con el ADN
ocurre mediante el reconocimiento de una secuencia nucletido
expresada en la superficie de 10-14 pares de bases que permite solo
al ADN de especies relacionadas unirse y entrar en la clula
competente. Luego, el ADN de doble hebra entra en la clula, pero
solo una hebra participa en los episodios de recombinacin que
incorporan el ADN transformador en el genoma del receptor. En las
clulas Gram positivas competentes (p. ej., Bacillos subtilis, S.
pneumoniae), pequeos trozos de ADN de doble hebra se unen a la
clula mediante un receptor de la superficie Celular que se expresa
durante el perodo de competencia. Conforme el ADN entra en la
clula, una hebra se hidroliza simultneamente por una nucleasa
unida a la superficie. Por lo tanto las bacterias Gram positivas, como
Streptococcus y Bacillos, solo toman ADN monocatenario. Sin
embargo, en todos los casos, el ADN bicatenario se une ms
eficientemente a las clulas.

Integracin del ADN transformante

El ADN transformante se une a la superficie celular por una protena

de unin al ADN, tras lo cual el fragmento bicatenario completo
resulta captado por la clula o bien una nucleasa degrada una cadena
y la otra es incorporada. Tras la incorporacin, el ADN se asocia con
una protena especfica de la competencia que permanece unida al
ADN, posiblemente para protegerlo de ataques por nucleasas, hasta
que alcanza el cromosoma, donde es sustituida por la protena RecA.
Una vez el ADN est en el interior de la clula, tiene que
recombinarse con un segmento homlogo del cromosoma de la clula
receptora para conseguir estabilizarse y pasar como herencia a las
clulas hijas. Durante la replicacin de este ADN heteroduplex, se
forma una molcula de ADN parental y una molcula de ADN
recombinante. Tras la segregacin por divisin celular, la ltima est
presente en la clula transformada, que esta genticamente alterada
en comparacin con el tipo parental.
Si los organismos captan un ADN que es completamente diferente,
los fragmentos de ADN no sern homlogos y, por tanto, no tendrn
lugar la recombinacin y el ADN captado ser degradado.

Competencia inducida artificialmente

La transformacin natural de alta eficiencia solo en algunas bacterias:

Acinetobacter, Azotubacter, Bacillos, Streptococcus, Haemophilus,
Neisseria y Thermus, por ejemplo, se transforma fcilmente. Muchos
procariotas se transforman muy pobremente o nada en absoluto bajo
condiciones naturales. La determinacin de como inducir
competencia en tales bacterias puede suponer un enorme esfuerzo
emprico, con variaciones en el medio de cultivo, temperatura y otros
factores. Sin embargo, para transferir ADN a las clulas en
experimentos de ingeniera gentica, fue necesario encontrar un
mtodo parta hacer competente a Escherichia coli, un organismo
Gram negativo. Se ha encontrado que cuando a E. coli se trata con
altas concentraciones de iones de calcio, cloruro de calcio (CaCl 2) y
luego se mantiene en frio, se convierte en transformable con baja
eficiencia. E. coli tratada de esta manera toma ADN bicatenario, y as
la transformacin por ADN plasmidico es relativamente eficiente. No
se sabe por qu el tratamiento con calcio funciona de esta manera,
pero este procedimiento tambin funciona con otras Bacterias Gram
negativas. Sin embargo, este tipo de mtodos de induccin artificial
est siendo suplantado por un nuevo mtodo denominado
electroformacin.

Transferencia de ADN por electroformacin

La electroporacin es una tcnica en la que las clulas se exponen a

campos elctricos pulsados para abrir pequeos poros en sus
membranas. Cuando existen molculas de ADN fuera de las clulas
durante un pulso elctrico, pueden entrar en las clulas a travs de
estos poros. La electroporacin requiere un suministro de potencia
sofisticado, ya que los pulsos deben ser controlados cuidadosamente
y duran solo milisegundos. Esta tcnica se ha usado para introducir
ADN en un gran nmero de especies diferentes, tanto de Archeae
como de Bacteria, y tambin en muchas clulas eucariticas.
Adems, la electroporacin permite al experimentador transferir un
plsmido de una clula a otra si ambos estn presentes durante la

electroporacin. Por tanto, la electroporacin permite tanto la salida

como la entrada en la clula de pequeas molculas de ADN.

2. TRANSDUCCION
La transduccin es la transferencia de genes bacterianos por medio
de virus. Se produce la incorporacin de genes bacterianos al interior
de la cpside de un fago a consecuencia de errores cometidos
durante el ciclo vital del virus. El virus que contiene estos genes los
inyecta a continuacin en otra bacteria. Completando de esta forma
la transferencia.
Los virus bacterianos o bacterifagos participan en la tercera
modalidad de transferencia gnica bacteriana. Estos virus tienen
estructuras relativamente sencillas en las que el material gentico del
virus est incluido dentro de una cubierta externa. Compuesta
principalmente o exclusivamente de protenas. La cubierta protege el
genoma y lo transmite entre clulas husped.
Despus de infectar la clula husped, un bacterifago (fago para
abreviar) a menudo toma el control y obliga al husped a fabricar
numerosas copias del virus. Finalmente la bacteria husped estalla o
se Lisa y libera los nuevos fagos. Este ciclo reproductor se denomina
ciclo ltico porque concluye con la lisis del husped. Consta de cuatro
fases. En la primera, la partcula viral se fija a un sitio receptor
especfico de la superficie bacteriana. El material gentico del virus
que con frecuencia es DNA bicatenario, penetra entonces en la clula.
Tras la adsorcin y la penetracin, el cromosoma viral obliga a la
bacteria a fabricar cidos nucleicos y protenas del virus. La tercera
fase comienza tras la sntesis de los componentes virales. Se
ensamblan fagos a partir de estos componentes. El proceso de
ensamblaje puede ser complejo, pero en todos los casos el: cido
nucleico se introduce (<<se empaqueta) en la cpside proteica viral.
Finalmente, los virus maduros son liberados al medio mediante la lisis
de la clula husped.
Los virus bacterianos que se reproducen mediante un ciclo ltico a
menudo se denominan bacterifagos virulentos porque destruyen la
clula husped. Muchos fagos DNA. Como el fago lambda. Tambin
son capaces de establecer una relacin diferente con su husped.
Tras la adsorcin y la penetracin. El genoma viral no toma el control
de su husped ni lo destruye, al tiempo que produce nuevos fagos. En
cambio, el genoma permanece en el interior de la clula husped y se
reproduce junto con el cromosoma bacteriano. Se origina un clon de

clulas infectadas que puede crecer durante un largo perodo con

apariencia totalmente normal. Cada una de estas clulas infectadas
es capaz de producir fagos y lisarse bajo las condiciones ambientales
apropiadas. Esta relacin entre el fago y el husped se denomina
lisogenia. Se dice que estas bacterias que son capaces de producir
fagos en determinadas circunstancias son Lisognicas, y se las
designa con el nombre de lisgenas, mientras que los fagos capaces
de establecer este tipo de relacin se denominan fagos atemperados.
La forma latente del genoma viral que pemanece en el interior de la
clula husped sin destruirla se denomina profago. El profago suele
estar integrado en el genoma bacteriano. En ocasiones. La produccin
de fagos se activa en un cultivo de bacterias lisgenas mediante la
exposici6n a radiacin UV y otros factores. Las clulas Lisgenas son
destruidas y se liberan nuevos fagos. Este fenmeno se denomina
induccin.
La traduccin ocurre en una variedad de especies de bacteria:
Desulfovibrio, Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter,
Salmonella, Staphylococcus y Xanthobacter, asi como en
archeaMethanothermobacterthermoautotrophiccus. No todos los
fagos pueden transducir y tampoco todas las bacterias son
transduccibles; pero elfenomerno es lo suficientemente extendiddo
para suponer que desempea un papel importante en la transferencia
gentica en la naturaleza.

Transduccin generalizada

La transduccin generalizada fue descuba en 1951por Joshua

Lederberg y Norlon Zinder mientras intentaban demostrar que la
conjugacin, descubierta aos atrs en E. coli. Poda ocurrir en otras

especies bacterianas. Lederbergy Zinder repitieron con este fin los

experimentos previos con Salmollella typhimurium. Comprobaron que
la incubacin de una mezcla de dos cepas de auxotrofismo mltiple
produca prototrofos a un nivel de aproximadamente 1 en 10. Esto les
pareci una prueba consistente de recombinacin bacteriana, y
efectivamente lo era, pero no pudo confimarse su conclusin inicial
de que la transferencia se deba a un proceso de conjugacin. Cuando
estos investigadores Llevaron a cabo el experimento del tubo en U,
con Salmolnella, siguieron recuperando prototrofos. El filtro del tubo
en U tena unos poros lo suficientemente pequeos como para
imposibilitar el paso de bacterias de un lado a otro, pero permita el
paso del fago P22. Con su experimento, Lederberg y Zinder
pretendan confirmar la existencia de conjugacin en otras especies
bacterianas; descubrieron en cambio un mecanismo totalmente
nuevo de transferencia genes bacteriano. Un proceso de investigacin
aparentemente rutinario dio lugar a resultados sorprendentes e
importantes.
La Transduccin generalizada ocurre durante el ciclo ltico de fagos
virulentos y atemperados. Y es capaz de transferir cualquier parte del
genoma bacteriano. Durante la fase de ensamblaje. Cuando los
cromosomas virales son empaquetados en el interior de cpside
proteicas pueden quedar encapsidados, por error y al azar,
fragmentos del cromosoma bacteriano parcialmente degradado.
Puesto que la cpside slo puede contener una cantidad limitada de
DNA. El DNA del virus no se incorpora a la cpside y solo queda
incluido en ella el DNA bacteriano. La cantidad de DNA bacteriano
transportada depende principalmente del tamao de la cpside. El
fago
P22
de
Salmonella
ryphimurium
suele
transportar
aproximadamente el 1% del genoma bacteriano: el fago P1 de E. coli
y de diversas bacterias Gram negativas contienen aproximadamente
el 2,0-2 .5 %. Del genoma. La partcula viral resultante a menudo
inyecta el DNA en otra clula bacteriana, pero no inicia el ciclo ltico.
Este fago se conoce como partcula o fago de transduccin
generalizada, y es simplemente un portador de informacin gentica
desde la bacteria original a otra clula. Al igual que sucede en el
proceso de transformacin, una vez que el DNA ha sido inyectado
debe ser incorporado al cromosoma de la clula para conservar los
genes transferidos, El DNA sigue siendo bicatenario durante
laTransferencia, y ambas cadenas se integran en el genoma del
endogenote. Aproximadamente, el 70-90 % del DNA transferido no se
integra. Pero en ocasiones es capaz de sobrevivir y expresarse, Los
transductantes abortivos son bacterias que contienen este DNA
transducido no integrado y son diploides parciales.

Transduccin especializada

En la transduccin especializada o restringida, la partcula

transductora transporta solo porciones especficas del genoma
bacteriano. La transduccin especializada es posible a consecuencia
de un error durante el ciclo vital lisognico. Cuando se induce a un
fago a abandonar el cromosoma de la clula husped. En ocasiones la
escisin se realiza de forma incorrecta. El genoma del fago resultan te
contiene porciones del cromosoma bacteriano (aproximadamente.
entre el 5 y el 10% del DNA bacteriano) adyacentes al sitio de
integracin. En un proceso muy similar al de los plsmidos F'. El
genoma del fago originado en la transduccin suele ser defectuoso y
carece de alguna parte de su sitio de fijacin. La partcula tranductora
inyecta los genes virales a otra bacteria aunque el fago defectuoso no

es capaz de reproducirse sin ayuda. Los genes bacterianos pueden

quedar incorporados de forma estable en las condiciones adecuadas.
El ejemplo mejor estudiado de transduccin especializada es el fago
lambda. El genoma del fago lambda se inserta en el cromosoma de la
clula husped en localizaciones especficas conocidas como sitios de
fijacin o sitios att. Los sitios att del fago y los sitios att de labacteria
son similares y pueden formar complejos entre s. Aunque no son
idnticos.
El sitio att para el fago lambda se localiza adyacente a los genes gal y
bio en el cromosoma de E. coli; por consiguiente. Los fagos lambda de
transduccin
especializada
suelen
transportar
estos
genes
bacterianos. El lisado, o producto de la lisis celular que se produce a
consecuencia de la induccin de cepas de E. coli lisogenizadas
contiene fagos normales y unas pocas partculas transductoras
defectuosas. Estas partculas reciben el nombre de lambda dgal
porque transportan los genes para la utilizacin de la galactosa.
Debido a que estos lisados contienen slo unas cuantas partculas
transductoras, a menudo reciben el nombre de lisados de baja
frecuencia de transduccin (lisados LFT). Mientras que el fago normal
tiene un sitio att completo, las partculas transductoras defectuosas
tienen un sitio de integracin hbrido no funcional cuyo origen es en
parte del fago y en parte bacteriano. La integracin del cromosoma
del fago defectuoso no se produce fcilmente. Los fago transductores
tambin pueden haber perdido algunos genes esenciales para la
reproduccin. Pueden originarse clulas transductantes estables por
recombinaci6n entre el cromosoma del fago y el bacteriano mediante
entrecruzamientos en ambos lados del sitio gal. Ciclo Lisognico del
fago lambda. Los fagos lambda defectuosos portadores del gen gal
pueden integrarse en el cromosoma bacteriano si hay un fago lambda
normal en la misma clula. Al integrarse el fago normal se formulan
dos sitios
att hbridos entre bacteria/fago en los que puede
insertarse el fago. El fago normal proporciona adems los genes que
faltan en el fago defectuoso, En este caso el fago normal recibe el
nombre de fago auxiliar, porque colabora en la integracin y
reproduccin del fago defectuoso. Estas clulas transductantes son
inestables porque puede inducirse la escision de los profago,
mediante agentes tales como la radiacin Uv. Sin embargo la escisin
produce un Iisado que contiene una mezcla relativamente equivalente
de fagos lambda defectuosos dgal y de fagos auxiliares nuramales.
Debido a que es muy eficaz en la transduccin, el lisado se denomina
lisado de alta frecuencia de transduccin (lisado HFT).La reinfeccin
de la bacteria con esta mezcla tiene como resultado la generacin de

un nmero considerablemente ms elevado de transductantes. Los

lisados LFT y los producidos mediante transduccin generalizada
contienen una partcula transductora en 105 O 106 fagos. Los lisados
HFf contienen partculas transductoras con una frecuencia de
aproximadamente 0.1 a O.5.

Conversin fagica
La conversin fagica es un fenmeno en ciertos aspectos anlogos a
la transduccin especializada. Cuando un fago temperado normal
(este es, uno no defectivo) lisogeniza una clulas y su ADN pasa al
estado de profago, la bacteria lisogenica es inmune a una nueva
infeccin por un fago del mismo tipo. Esta adquisicin de inmunidad
se puede considerar como un cambio de fenotipo. En ciertos casos, se
pueden detectar otras alteraciones en la clula lisogenica, que
parecen no estar relacionadas con el sistema de inmunidad fagica. Tal
cambio, provocado por la lisogenizacion con un fago temperado
normal se llama conversin fagica.
Hay dos casos de conversin fagica que han sido estudiados muy
especialmente. Uno implica un cambio en la estructura de un
polisacrido de la superficie celular de Salmonella anatema tras
lisogenizacion con el fago 15. El segundo implica la conversin de
cepas no productoras de toxinas de Corynebacterium diphteriae (el
agente causal de la difteria) en cepas productoras de toxina
(patgenas) por lisogenizacion con el fago . En estas situaciones, la
informacin para la produccin de estas nuevas sustancias forma,
aparentemente, parte integral del genoma del fago y se transfiere
exclusivamente por infeccin del fago y lisogenizacion.
La lisogenia tiene, probablemente, un fuerte valor selectivo para la
clula hospedadora, ya que confiere resistencia a la infeccin por
virus del mismo tipo. La conversin fagica parece tener tambin una
considerable significacin evolutiva, ya que provoca una alteracin
gentica eficiente en las clulas hospedadoras. Muchas bacterias
aisladas de la naturaleza son lisogenicas. Parece, pues, razonable
concluir que la lisogenia es el estado normal y, a menudo, puede ser
esencial para la supervivencia del hospedador en la naturaleza.

3. CONJUGACION
Antes de considerar el tercer mtodo de transferencia gentica, la
conjugacin, debemos comentar sobre los plsmidos.

3.1. Plsmidos
Los plsmidos son generalmente elementos que
independientemente del cromosoma del hospedador.

se

replican

A diferencia de los virus, los plsmidos no tienen una forma

extracelular y existen dentro de las clulas como cidos nucleicos. Sin
embargo, la distincin entre virus y plsmidos es a veces difcil. Es
posible diferenciar entre plsmidos y un cromosoma en procariotas,
porque los plsmidos no llevan genes que sean requeridos por el
hospedador en todas las condiciones. Esto puede ser difcil de probar,
y, por tanto, a veces puede ser difcil distinguir en procariotas entre
cromosomas y plsmidos muy grandes.
A pesar de estas dificultades, se conocen miles de tipos de plsmidos
diferentes. De hecho, solo en cepas de escherischia coli se han
aislados ms de 300 plsmidos naturales.

 Naturaleza fsica de los plsmidos

Casi todos los plsmidos conocidos son circulares, pero tambin se
conocen muchos plsmidos lineales. El tamao de los plsmidos que
existen en la naturaleza vara de 1 a ms de 1000 kilopares de bases.
El plsmido tpico es una molcula de ADN bicatenario y circular, cuyo
tamao es menor que la venteaba parte del tamao de un
cromosoma. La mayor parte del ADN plsmido aislado de las clulas
est en una configuracin superenrollada, que es ms compacta,
dentro de la clula.
En general, el aislamiento de ADN plasmidico puede realizarse
teniendo en cuenta las propiedades fsicas de las molculas de ADN
superenrollada.
Aunque
los
cromosomas
estn
tambin
superenrollados en la clula, el aislamiento de ADN cromosmico casi
siempre conlleva la ruptura de las cadenas y la perdida consiguiente
del superenrollamiento. La separacin puede pues hacerse por una
variedad de tcnicas, incluyendo la ultra centrifugacin y la
electroforesis en geles de agarosa.

Replicacin de los plsmidos

La mayora de las enzimas implicadas en la replicacin de los

plsmidos son enzimas celulares, de modo que los genes del
plsmido que controlan su propias replicacin se limitan
principalmente a controlar temporalmente el proceso de iniciacin y
el reparto de los plsmidos replicados entre las clulas hijas. Tambin,
los diferentes plsmidos estn presentes en las clulas en un nmero
particular de molculas plasmidicas por clula; esto se denomina de
molculas plasmidicas por clula; esto se denomina nmero de
copias. Algunos plsmidos estn presentes en la clula en 1-3 copias,
mientras otros pueden estar presentes en ms de 100 copias. El
nmero de copias est controlado por genes del plsmidos y por
interacciones entre el hospedador y el plsmido.
La mayor parte de los plsmidos de las bacterias Gram negativas se
replican de modo similar se replica de modo similar al descrito para el
cromosoma. Esto implica iniciacin y replicacin en un origen y
replicacin bidireccional alrededor del crculo, originando un
intermediario theta. Sin embargo, algunos plsmidos tienen una
replicacin unidireccional. Dado el pequeo tamao del plsmido en
comparacin con el del cromosoma, el proceso completo de
replicacin ocurre muy rpido, quiz en la dcima parte del ciclo de
divisin celular.
La mayora de los plsmidos de Bacteria Gram positivas se replican
por el mecanismo del crculo rodante similar al usado por el fago
X174. Este mecanismo origina un intermediario monocatenario, y
por ello estos plsmidos se designan a veces como plsmidos con
ADN monocatenario. La mayora de los plsmidos lineales conocidos
se replican mediante un mecanismo que incluye la unin de una
protena al extremo 5 de cada cadena que se usa para iniciar la
sntesis de ADN.
Algunas clulas bacterianas individuales tambin contienen varios
tipos diferentes de plsmidos; por ejemplo, Borrelia Burgdorferi
(agente etiolgico de la enfermedad de Lyme) contiene 17 plsmidos
diferentes circulares y lineales. La capacidad de dos tipos diferentes
de plsmidos para replicarse en la misma clula est controlada por
genes plasmidicos implicados en el control de la replicacin del ADN.
Una observacin bastante comn es que, cuando un plsmido se
transfiere a una clula que contiene otro plsmido, el segundo
plsmido no puede mantenerse y se pierde durante la replicacin
celular subsiguiente. Se dice que los dos plsmidos son
incompatibles. Se ha reconocido la existencia de un cierto nmero de
grupos de incompatibilidad (Inc.), con los plsmidos de un grupo
excluyndose entre s, pero siendo capaces de coexistir con los

plsmidos de otro grupo. Los plsmidos de un grupo de

incompatibilidad comparten un mecanismo comn para regular su
replicacin, y, por lo tanto, estn relacionados entre s. En
consecuencia, aunque una clula bacteriana puede contener
diferentes tipos de plsmidos, no estn estrechamente relacionados
porque deben ser compatibles.
Algunos plsmidos, llamados episomas, tienen la capacidad de
integrarse en el cromosoma, y bajo tales condiciones su replicacin
est bajo el control del cromosoma. Esta situacin es notablemente
semejante a la de varios virus cuyos genomas se incorporan en el
genoma del hospedador. Los plsmidos que tienen esta capacidad de
integrarse se llaman episomas. A veces, los plsmidos se pueden
eliminar de las clulas hospedadoras por diversos tratamientos. Este
proceso, denominado curacin, parece ser el resultado de inhibir la
replicacin del plsmido sin inhibir paralelamente a la replicacin del
cromosoma y, por tanto, de la dilucin del plsmido como
consecuencia de la divisin celular. La curacin puede ocurrir
espontneamente pero se incremente considerablemente con el uso
de colorantes de acridina que se insertan en el ADN, o de otros
tratamientos que parecen interferir ms con la replicacin del
plsmido que con la del cromosoma. La electroporacin puede
utilizarse tambin para curar de plsmidos una clula.
Muchas de estas caractersticas estn ejemplificadas en un plsmido
de muy bien caracterizado llamado plsmido F. El plsmido F es una
molcula de ADN circular de 99.159 pares de bases. Las clulas que
lo contienen pueden ser fcilmente curadas con naranja de acridina.
Una regin del plsmido contiene genes implicados en regular la
replicacin del ADN. Tambin contiene varios elementos transponibles
implicados en su capacidad de funcionar como un episoma. Por
ltimo, tiene una extensa regin de ADN, la regin Tra, que contiene
genes que permiten su transferencia de una clula a otra.

Transferencia de plsmidos de clula a clula

Puesto que una de las caractersticas definitorias de un plsmido es
que carece de una forma extracelular distintiva, uno podra suponer
que la transmisin de los plsmidos esta exclusivamente confinada a
las clulas hijas durante la divisin celular. Puesto que algunas clulas
procarioticas pueden tomar ADN libre del ambiente, es posible que la
lisis del hospedador, como quiera que ocurra, puede poner el
plsmido en contacto con un nuevo hospedador. Sin embargo, este
proceso ocurre de manera natural en unas pocas especies

bacterianas y no es probable que represente una transferencia de

plsmidos significativa de una clula a otra. El principal mecanismo
de transmisin de clula a clula es la conjugacin, que es una
funcin codificada por algunos plsmidos. La conjugacin es un
proceso replicativo y ambas clulas terminan con copias del plsmido.
Los plsmidos que gobiernan su propia transferencia de una clula a
otra por contacto se llaman conjugativos, pero no todos los plsmidos
son conjugativos. La transmisibilidad por conjugacin est controlada
por un conjunto de genes dentro del plsmido que constituye la
regin tra. La regin tra contiene genes que codifica protenas que
funcionan en la transferencia del ADN y en su replicacin, y otras que
funcionan en la formacin de parejas conjugativas. La presencia de
una regin tra en un plsmido puede tener otra importante
consecuencia si el plsmido puede movilizar la transferencia del ADN
cromosmico de una clula a otra. Las cepas de bacterias que
transfieren grandes cantidades de ADN cromosomal durante la
conjugacin se llaman Hfr, alta frecuencia de recombinacin.
Algunos plsmidos conjugativos de Pseudomonas tienen un amplio
rango de hospedadores, es decir, son transferibles a una amplia
variedad de otras Gram negativas del dominio Bacteria. Algunos
plsmidos conjugativos pueden transferir informacin gentica entre
organismos muy distantes filogenticamente. As, dentro de Bacteria,
se ha demostrado transferencia entre bacterias Gram negativas y
Gram positivas, entre Bacteria y clulas de plantas, y entre bacteria y
hongos. Incluso si el plsmido no puede replicarse en el nuevo
hospedador, la transferencia misma del ADN puede tener importante
consecuencias evolutivas, as como estar relacionada con procesos
patognicos, si se puede recombinar con el genoma del nuevo
hospedador.

Tipos de plsmidos y su significacin biolgica

Todos los plsmidos deben llevar genes que aseguren su propia
replicacin. Sin embargo, en el caso de muchas plsmidos conocemos
muy poco de la naturaleza de los otros genes que llevan. Estos son
los llamados plsmidos crpticos y fueron descubiertos por mtodos
fsicos. Como hemos visto, algunos plsmidos tambin llevan genes
necesarios para la conjugacin, y pueden detectarse biolgicamente
por las propias funciones de transferencia o por la sensibilidad a
ciertos virus. Aunque los plsmidos no llevan genes que sean
esenciales para el husped bajo todas las condiciones, la presencia de
plsmidos en una clula puede tener una profunda influencia en el

fenotipo celular. En algunos casos, el plsmido codifica propiedades

que pueden ser fundamentales para la bacteria en cuestin; por
ejemplo, la capacidad de Rhizobium para interactuar con plantas.
Algunos plsmidos de Pseudomonas transfieren la informacin
gentica para rutas bioqumicas que degradan compuestos orgnicos
poco comunes tales como alcanfor, octano y naftaleno.
Los plsmidos pueden llevar una amplia variedad de genes. La nica
limitacin es que los genes que transportan no interfieran con su
propia replicacin o con la supervivencia del hospedador. Como los
plsmidos pueden ser grandes y llevar muchos genes diferentes, su
clasificacin dentro de una categora fenotpica sencilla no es siempre
fcil. Como veremos un nico plsmido pueden conferir muchos
fenotipos diferentes a su clula hospedadora.

Plsmidos de resistencia
Los plsmidos de resistencia (plsmidos R) constituyen uno de los
grupos mejor estudiados de plsmidos. Confieren resistencia a los
antibiticos y a otros inhibidores del crecimiento. Fueron descubiertos
en Japn, en cepas bacterianas entricas que haban adquirido
resistencia a varios antibiticos (resistencia mltiple) y desde
entonces se han encontrado en otras partes del mundo. La aparicin
de bacterias resistentes a varios antibiticos tiene una considerable
importancia mdica y se correlaciona con el amplio uso de
antibiticos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Poco
despus de que se aislaran estas cepas resistentes, se comprob que
podan transmitir la resistencia a cepas sensitivas mediante contacto
clula a clula. La naturaleza infecciosa de los plsmidos R
conjugativos permite una rpida diseminacin de estas caractersticas
por las poblaciones bacterianas.
Los plsmidos R pueden llevar una gran variedad de genes de
resistencia a antibiticos. En general, estos genes codifican protenas
que inactivan el antibitico o afectan a su transporte hacia el interior
de la clula. El plsmido R100, por ejemplo, es un plsmido de 94,3
kilopares de bases que lleva genes de resistencia a sulfamidas,
estreptomicina y espectinomicina, cido fusidico, cloranfenicol y
tetraciclina. R100 tambin lleva genes que confieren resistencia al
mercurio. R100 puede transferirse entre bacterias entricas de los
gneros. Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella y Shigella, pero
no se transfieren a la bacteria no entrica Pseudomonas. Tambin se
conocen plsmidos R con genes de resistencia a la mayora de los
antibiticos. Muchos de los elementos de resistencia a drogas que se

encuentran en plsmidos como el R100 son elementos transponibles,

lo que unido al hecho de que estos plsmidos son conjugativos, los
convierte en una amenaza para las terapias antibiticas tradicionales.

Plsmidos de diseo
Las tcnicas de ingeniera gentica, han hecho posible la construccin
en el laboratorio de un nmero ilimitado de nuevos plsmidos
artificiales. La incorporacin de genes de una amplia variedad de
origines en plsmidos artificiales ha permitido la transferencia de
material gentico, venciendo prcticamente cualquier barrera de
especie. Resulta posible incluso sintetizar genes completamente
nuevos e introducirlos en plsmidos.
Volvamos ahora de nuevo nuestra atencin a los detalles de la
conjugacin para observar como algunos plsmidos pueden actuar
movilizando el cromosoma bacteriano, permitiendo as la
transferencia de genes desde un donador a un receptor.

3.2. Conjugacin y movilizacin del cromosoma

La conjugacin bacteriana (apareamiento) es un proceso de
transferencia gentica que requiere contacto clula a clula. Como se
coment previamente, la conjugacin es un mecanismo que esta
codificado en un plsmido. Un plsmido conjugativo usa este
mecanismo para transferir una copia de s mismo al nuevo
hospedador. Sin embargo, otros elementos genticos resultan a veces
movilizados durante la conjugacin. Estos plsmidos pueden ser otros
plsmidos o el cromosoma del hospedador. De hecho, la conjugacin
se descubri porque el plsmido F de escherischia coli puede
movilizar el cromosoma del hospedador. Los mecanismos de
transferencia por conjugacin pueden ser diferentes dependiendo del
plsmido concreto, pero la mayora de los plsmidos de Bacteria
Gram negativas parecen emplear un mecanismo similar al usado por
el plsmido F.
La conjugacin requiere una clula donadora, que contiene un tipo
particular de plsmido conjugativo, y una clula receptora que carece
de l. Dado que la conjugacin se descubri realizando cruces
genticos, las clulas donadoras se llaman machos y las receptoras
hembras. Los genes que controlan la conjugacin estn situados en la
regin tra del plsmido. Muchos genes de la regin tra estn
relacionados con la sntesis de una estructura superficial, el pelo

sexual. Solo las clulas donadoras tienen este pelo, lo que explica la
razn por la que los bacterifagos ARN que se unen a ellos se llaman
especficos de machos. Plsmidos conjugativos diferentes pueden
tener regiones tra diferentes, y, en algunos casos, los pelos pueden
ser tambin distintos. El plsmido F y otros relacionados codifican
pelos F.
Los pelos permiten el apareamiento especifico entre la clula
donadora y receptora. En Bacteria Gram negativas, se cree que toda
conjugacin depende del apareamiento ocasionado por los pelos
sexuales. Estos pelos establecen contactos especficos con un
receptor de la otra clula y luego se retraen, empujando una clula
hacia la otra. Luego, los contactos entre las clulas donadoras y
receptoras se estabilizan, probamente por fusin de las membranas
externas, y el ADN se transfiere de una clula a otra.
Entre las bacterias Gram positivas, Enterococcus fecalis tambin es
capaz de intercambiar
plsmidos mediante la conjugacin, Sin
embargo, la transferencia de genes no se produce a travs de los Pili,
sino por una coagregacin de los microorganismos en respuesta a
feromonas producidas por la bacteria donante. Cuando se exponen a
clulas libres de plsmidos; (o a filtrados de cultivos de clulas libres
de plsmidos), las clulas que contienen plsmidos producen
feromonas codificadas por el plsmalo llamadas sustancias de
agregacin. Estas sustancias son pequeos pptidos (siete a ocho
aminocidos) y se unen a los sitios que estn presentes en ambas
clulas, donante y receptora, y causan la agregacin bacteriana. La
agregacin conduce al establecimiento de conexiones intercelulares
necesarias para la transmisin del plsmido. Un dato interesante es
que los Enterococcus que contienen plsmidos y sustancias de
agregacin similares responden slo a las feromonas de las clulas
que tienen plsmidos diferentes y, por lo tanto, producen sustancias
de agregacin diferentes. Hasta hoy se describieron 18 feromonas
sexuales de plsmidos diferentes.

Mecanismo de la transferencia de ADN durante la

conjugacin

La transferencia de ADN requiere sntesis de ADN, y la evidencia

sugiere que una de las bandas deriva de la clula donadora y la otra
se sintetiza de nuevo en el receptor durante el proceso de
trasferencia. Algunos genes de la regin tra estn implicados en la
transferencia y replicacin de ADN. Todo el proceso parece ponerse en
marcha tras el contacto clula a clula, en cuyo momento se rompe

una cadena del ADN circular del plsmido y se transfiere una banda
parental. La enzima responsable del corte necesario para iniciar el
proceso. TraI, esta codificada por el opern tra del plsmido F. Esta
protena tiene tambin una actividad helicasa y, por tanto, est
implicada en el desenrrollamiento de la banda que se va a transferir.
A medida que ocurre la transferencia, la sntesis de ADN segn el
modelo del crculo rodante, reemplaza a la banda transferida en el
donador. A su vez, una banda complementaria se sintetiza tambin en
el receptor. Por tanto, al final del proceso, tanto el donador como el
receptor poseen plsmidos completamente formados.

La transferencia del ADN plasmidico es extremadamente eficiente;

bajo condiciones apropiadas prcticamente cada clula receptora que
se aparea adquiere un plsmido. Cuando los genes del plsmido se
expresan en el receptor, el propio recetor se convierte en donador y
puede transferir el plsmido a otros receptores. De este modo, los
plsmidos conjugativos se extienden rpidamente entre las
poblaciones, comportndose como agentes infecciosos. La naturaleza
infecciosa de este fenmeno tiene gran importancia ecolgica, puesto
que la introduccin de algunas clulas con plsmidos, en una
poblacin adecuada de receptores, convierte a toda la poblacin
receptora en portadora del plsmido en poco tiempo, siempre que el
plsmido contenga genes que confieran alguna ventaja selectiva. La
amplia distribucin de la resistencia a drogas debida a plsmidos
conjugativos ha ocasionado serios problemas a la quimioterapia de
las enfermedades infecciosas. Sin embargo, como se mencion antes,
los plsmidos tambin pueden perderse por un proceso llamado
curacin.
Esto
puede ocurrir en
poblaciones
naturales
donde
no existe presin
selectiva
para
mantener
el
plsmido.
Por
ejemplo,
los
plsmidos
que
confieren
resistencia
a
antibiticos
pueden perderse
sin
que
esto
afecte
a
la
viabilidad celular
si
no
hay
antibiticos en el
ambiente de la
clula.

La formacin de cepas Hfr y movilizacin del cromosoma

El plsmido de F de Escherichia coli no solo es conjugativo sino que

tambin tiene la propiedad de movilizar el cromosoma de modo que
pueda ser transferido durante el contacto clula a clula. El plsmido

F es un episoma, es decir, un plsmido que puede integrarse en el

cromosoma del hospedador. Cuando el plsmido F se integra en el
cromosoma, la conjugacin puede ocasionar la transferencia de
grandes regiones del cromosoma del hospedador y la recombinacin
gentica entre el donador y el receptor puede ser muy extensa. El
plsmido F se puede integrar en numerosos loci en el cromosoma de
las clulas donadoras. El factor de fertilidad integrado crea donadores
Hfr, a partir de los cuales se transfiere el ADN cromosmico (desde el
sitio de insercin) en una direccin determinada por la orientacin de
la insercin
Las clulas que poseen un plsmido F no integrado se llaman F +, y las
que tienen un plsmido F integrado en el cromosoma se llaman Hfr
(alta frecuencia de recombinacin). Tanto las cepas F + como las Hfr
actan como donadores, pero la conjugacin que usa un donador Hfr
conduce a la transferencia del cromosoma del hospedador puesto que
el plsmido forma parte del cromosoma. La integracin del plsmido
es un mecanismo muy simple para movilizar otros elementos
genticos. El termino alta frecuencia de recombinacin hace alusin a
la recombinacin gentica entre el cromosoma del donador y el
receptor. Las clulas que carecen del plsmido F se llaman F - y actan
como receptores. En general, las clulas que contienen un plsmido
conjugativo son receptores muy pobres para el mismo plsmido o
plsmidos relacionados. Esto es debido a que se bloquea la entrada
del plsmido, y no a incompatibilidades en el proceso de replicacin.
Por tanto, la presencia del plsmido F origina tres alteraciones
distintas en las propiedades de una clulas: (1) capacidad para
sintetizar el pelo F, (2) movilizacin del ADN para transferencia a otra
clula, y (3) alteracin de receptores de superficie de manera que la
clula ya no es capaz de comportarse como receptora en la
conjugacin.
La integracin del plsmido F en el cromosoma del hospedador puede
tener lugar en varios sitios especficos llamados secuencias de
insercin o IS (del ingls, insertion sequences). Estos sitios son
regiones de homologa entre el cromosoma y el ADN del plsmido F.
En la 10.22 muestra como la integracin de un plsmido F, implica la
insercin en uno de estos sitios en el cromosoma. En el Hfr particular
mostrado, el sitio de integracin esta entre los genes cromosmicos
pro y lac. Una vez integrado, el plsmido ya no controla su propia
replicacin, pero la regin tra aun funciona normalmente y la cepa
sintetiza pelos. Cuando encuentra un receptor, se dispara el proceso
de conjugacin como si fuera una clula F +, y se inicia la transferencia
de ADN en oriT (origen de la transferencia). Sin embargo, puesto que

el plsmido es ahora parte del cromosoma, tras la transferencia de

parte del plsmido comienza a transferirse genes cromosmicos. Del
mismo modo que ocurra con el plsmido F, la transferencia de ADN
requiere replicacin, de manera que, una vez terminada la
transferencia, la cepa Hfr permanece Hfr ya que ha retenido una
copia del material gentico transferido.
As, decimos que se moviliza el cromosoma. Como hemos
mencionado, la integracin de un plsmido es un mecanismo simple
de movilizacin. Se conocen otros mecanismos de movilizacin, que
implica no solo al cromosoma bacteriano sino tambin a otros
plsmidos. Uno de estos mecanismos opera si el plsmido a movilizar
contiene una secuencia oriT similar a la encontrada en el plsmido F.
tal plsmido ser transferido por conjugacin si coexiste en una clula
con un plsmido conjugativo que pueda suministrar el resto de los
genes necesarios.
Puesto que existen varios sitios de insercin diferentes, son posibles
varias cepas Hfr distintas. Una determinada cepa Hfr siempre dona
los genes en el mismo orden, comenzando en la misma posicin, pero
cepas Hfr de origen independiente transfieren los genes en secuencia
diferentes.
Generalmente, debido
a la rotura de la
cadena
de
ADN
durante
la
transferencia, solo se
transfiere parte del
cromosoma donador.
A causa de ello, esa
parte
no
puede
replicarse
por
s
misma en la clula
receptora.
Por
consiguiente,
los
genes del receptor no
se detectan a menos
ocurra recombinacin
entre el fragmento
que ha entrado y el
cromosoma
del
receptor.

Aunque las cepas Hfr transmiten con elevada frecuencia genes

cromosmicos, por lo general, no convierte las clulas F - a F+, ya que
raramente se transfieren el plsmido F completo. Por otra parte, las
clulas F+ convierten con eficiencia, las clulas F - A F+ porque se
transfieren el plsmido entero.
En algunos sitios de insercin, el plsmido F se integra con el origen
en una direccin, mientras que en otros sitios el origen est en
direccin opuesta. La direccin en la que se inserta el plsmido F
determina cuales son los genes cromosmicos que se transfieren al
receptor en primer lugar. Mediante el uso de varias cepas Hfr ha sido
posible determinar el Escherichia coli la disposicin y orientacin de
un gran nmero de genes cromosmicos.

Transferencia de genes cromosmicos al plsmido F

Ocasionalmente, los plsmidos F integrados se pueden escindir del

cromosoma, y existe la posibilidad de que en el proceso se incorporen
genes cromosmicos en el plsmido F liberado. Esto puede ocurrir
porque tanto el plsmido F integrado como el cromosoma contienen
varios sitios IS idnticos donde puede ocurrir la recombinacin. Los
plsmidos F que contienen genes cromosmicos se llaman plsmidos
F (F prima). Estos plsmidos F difieren de los plsmidos F normales
en que contienen genes cromosmicos identificables y los transfieren
a receptores con una frecuencia muy alta. La transferencia mediada
por F recuerda a la transduccin especializada en el sentido de que
solo se transfiere un grupo restringido de genes cromosmicos. La
transferencia de un F conocido a un receptor permite la formacin de
diploides (merodiploides) en una regin limitada del cromosoma. Esto
es importante para llevar a cabo pruebas de complementacin.

RECOMBINACION BACTERIANA
Segn el estado actual de la investigacin se diferencian dos
mecanismos distintos de recombinacin entre el DNA extrao que
haya llegado a una clula in vivo y el cromosoma bacteriano o un
plsmido: 1. la recombinacin general u homologa, y 2, la
recombinacin en un punto o secuencia especfica.
1. Recombinacin general u homologa.
La recombinacin homloga indica un mecanismo segn el cual el
DNA que ha penetrado en una clula se recombina con el DNA celular
mediante un apareamiento, rotura e intercambia reciproco de

fragmentas de DNA. Condicin previa es que los dos DNA

recombinantes deben poseer en una amplia zona la misma secuencia
de bases, esto es, han de ser homlogos. La identidad de las
molculas de DNA que han de recombinarse puede variar
mnimamente, como sucede en el caso de mutaciones. As, es posible
una recombinacin homloga entre DNA de una cepa silvestre y otra
mutante. En el proceso cataltico de la recombinacin generalizada
participan como mnimo 6 enzimas, que tambin tienen una funcin
en la reparacin del DNA y/o en la replicacin del DNA. EI enzima ms
importante es la protena RecA.

Etapas de la recombinacin homologo

A nivel molcula, la recombinacin ha sido estudiada principalmente

en procariotas y virus. En bacteria, la recombinacin general conlleva
a la participacin
de una protena
especfica
llamada
RecA,
codificada por el
gen
recA.
La
protena RecA es
esencial en casi
todos
los
procesos
de
recombinacin
homloga.
Se
han identificado
protenas
similares a RecA
en
todas
las
procariotas
examinados,
incluyendo
las
Archeae,
as
como
en
levaduras
y
Eukarya
superiores.
El proceso comienza con una mella (generada generalmente por una
nucleasa) en una de las molculas de ADN. Esta cadena rota debe ser
desplazada de la otra cadena por protenas con actividad helicasa. En

algunas vas, enzimas especializadas, tales como la enzima RecBCD

de E. coli, tienen tanto actividad nucleasa como helicasa. Una
protena de unin a cadena sencilla se une luego al segmento
monocatenario resultante. A continuacin, la protena RecA se une al
fragmento monocatenario, formando un complejo que facilita el
anillamiento con una secuencia complementaria en el dplex
adyacente, con desplazamiento simultaneo de la banda residente.
Este proceso se conoce frecuentemente como invasin de banda.
Como se indic, la recombinacin implica el apareamiento de
molculas de ADN a lo largo de grandes fragmentos. Tras el
apareamiento, puede ocurrir un intercambio de secuencias de ADN
homologas, lo que conduce a la formacin de intermediarios de
recombinacin que contienen extensas regiones de heteroduplex, en
las que cada cadena proviene de un cromosoma diferente. Este
proceso tambin implica ADN polimerasa y ligasa. Estas regiones
pueden ser extendidas por la protena RecA. Finalmente, las
molculas ligadas se resuelven en dos molculas recombinantes por
la accin de nucleasas y ADN ligasa.
Este mecanismo de formacin de estructuras recombinantes de ADN
es completamente natural y ocurre frecuentemente en la clula. El
que conduzca o no a la formacin de nuevos genotipos depende de si
las dos molculas que sufren recombinacin difieren genticamente
en regiones que estn fuera de la regin de recombinacin. Se acepta
que, dentro de ciertos lmites, la recombinacin entre dos genes es
proporcional a la distancia. Este hecho resulta til en el mapeo
gentico. Por anlisis de recombinacin es posible mapear la posicin
de los genes, ms probable es que sufran recombinacin.
Para que surjan nuevos genotipos como resultado de la
recombinacin general, es esencial que las dos secuencias homologas
sean genticamente distintas. Tal es el caso de una clula eucariota
diploide, que posee dos juegos de cromosomas, uno procedente de
cada padre. Las dos molculas diferentes se juntan como resultado de
la reproduccin sexual, un proceso que forma parte del ciclo de vida
regular de la mayor parte de los organismos eucariticos. En los
procariotas, existen diversos mecanismos implicados en reunir
molculas de ADN genticamente distintas pero homologas, pero el
proceso de recombinacin no es menos importante. La recombinacin
puede ser crtica tambin en el ciclo de vida de algunos virus.
En procariotas, la recombinacin gentica puede observarse porque
los fragmentos de ADN homlogo de un cromosoma donador son
transferidos a una clula receptora por uno de estos procesos
transformacin, transduccin y conjugacin. La recombinacin

homloga solo puede ocurrir tras la transferencia, es decir, cuando el

fragmento de ADN del donador est en la clula receptora. Como solo
se transfiere un fragmento del cromosoma, si no se produce
recombinacin el fragmento se perder, puesto que no puede
replicarse independientemente. Es importante, pues, recordar, que la
transferencia es solo el primer paso en procariotas para obtener
organismos recombinantes.
2. Recombinacin en un punto o secuencia especficos.
A diferencia de la recombinacin homloga, la recombinacin en un
punto o secuencia especficos requiere para el reconocimiento tan
solo fragmentos homlogos de DNA considerablemente menores. No
esta catalizada por la protena RecA, sino por enzimas que son
especficos para cada molcula de DNA que haya de recombinarse. Si
los dos DNA llevan una secuencia de reconocimiento, se habla de una
recombinaci6n de sitio especfico doble ("doubl site-specific").
Ejemplos de todo ello son la integracin del fago lambda y del
plsmido de fertilidad F en el genoma de Escherichia coli. Si
solamente una de las dos molculas de DNA que han de
recombinarse lleva la secuencia de reconocimiento, se habla de una
recombinaci6n de sitio especifico nico ("single site-speci- fic").
Ejemplos son los elementos genticos transponibles (secuencias de
insercin,
transposones,
bacterifago Mu) que se explican a
continuacin.

Etapas
de
la
recombinacin
en
un
punto
o
secuencia
especificas
Fago Lambda

Los
experimentos
genticos
realizados indican que el fago
lambda, al pasar al estado de
profago,
se
inserta
en
un
determinado lugar del cromosoma
del hospedador, y precisamente
entre el opern galactosa y la regin biotina. La inserci6n se inicia por
un anclaje.

Anteriormente se pensaba que este anclaje tena lugar como

consecuencia de una elevada homologa en las secuencias de bases
en esta regin, entre las regiones attP y attB. No obstante, la
homologa en la secuencia de bases es baja y solo implica 15 pares
de bases que son la regin de reconocimiento de una protena
codificada por el fago, que recibe el nombre de integrasa. La
integrasa corta en esta zona al DNA de doble cadena del fago y al del
hospedador de un modo semejante a una nucleasa de restriccin. Se
generan en cada DNA dos extremos cohesivos que se vuelven a unir
de forma cruzada por la DNA-ligasa. La integracin del fago es
reversible, y en su desintegracin participa otro enzima del fago, la
escisionasa. Ambos procesos, tanto el de la integracin del fago como
el de su escisin tienen lugar con la actuacin de una protena
especfica del hospedador, el factor de integracin del hospedador
(IHF, "integration host factor"). La protena IHF compuesta por dos
productos gnicos, de himA y de hip, est ganando constantemente
importancia en las reacciones entre DNA y protenas.

Transposones
Los transposones, abreviadamente Tn, pertenecen igual-mente a los
elementos genticos mviles mutagenicos y se caracterizan tambin
como "genes saltadores". A diferencia de las secuencias de insercin
codifican para caractersticas fenotpicas fcilmente reconocibles.
Como resistencias a antibiticos, p. ej. Penicilina, tetraciclina y
kanamicina, o metales pesados, p. ej. El mercurio. Los determinantes
de resistencia de los transposones estn flanqueados por dos
elementos IS, cuya ordenacin
puede visualizarse en microscopia
electrnica por la formacin de
heteroduplex (Fig. 15.13). EI

"salto" o transposicin de un transposon no va ligado por lo general a

la prdida del transposon en su punto original de integracin, sino
que es ms bien el resultado de una replicacin. Siguiendo un
modelo, el transposon se replica entrando en contacto con el DNA
diana, de forma que transitoriamente se establece una forma
cointegrada entre el vehculo inicial del transposon y del nuevo DNA
diana.
EI
cointegrada
se
disuelve
por
el
enzima
resolvasa,
de
modo
que
finalmente
quedan
dos
molculas de DNA, cada una de
las cuales lleva una copia del
transposon.

BIBLIOGRAFIA
1. BROCK, THOMAS.
Microbiologa 10ma
Edicin. Edit. Prentice
Hill.
Hispanoamericana. S. A. Mxico.
2. KONEMAN, Diagnostico Microbiolgico 2006. 6ta Edicin.
Edit. Medica Panamericana. Madrid, Espaa.
3. JAWETZ, MELNICK Y ADELBERG. 2004. Microbiologa
Medica 18ava. Edicin. Edit. Manuel Moderno S.A.
4. MINS, C; PLAYFAIR, J. ROITT, I. 1998. 2da Edicin. Edit.
Ediciones Harcourt S.A. Madrid, Espaa
5. MURRAY, P. KOBAYASHI, G; PFALLER, M. Microbiologa
Medica 2009. 6ta Edicin. Edit. Elsevier. Barcelona,
Espaa.

6. PRESCOTT, L. HARLEY, J; KLEIN, D. Microbiologa. 2004.

5ta. Edicin. Edit. Mc. Graw-Hill. Interamericana.
7. SCHLEGEL, H.G. Microbiologa. 2008. 7ma. Edicin. Edit.
Omega.