UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLGICAS SEGUNDA
ESPECIALIDAD

TRABAJO 01: MONOGRAFIA DE LA TECNICA DE

RADIOINMUNOENSAYO Y TURBIDIMETRIA EN
PRUEBAS DE INMUNOLOGIA

NOMBRE: YULY CHIQUILLAN ZAMBRANO

SEDE: ANDAHUAYLAS
ABRIL-2015

RADIOINMUNOENSAYO
Antecedentes
Esta tcnica fu desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow en 1960
para determinar la concentracin de insulina en el plasma sanguneo. Por ese
motivo, R. Yalow recibi el Nobel de Medicina en 1977 (Berson muri en 1972).
Hoy en da, esta tcnica se utiliza para detectar y cuantificar sustancias que se
encuentran en cantidades muy pequeas y mezcladas con muchas otras.
Es por tanto una tcnica muy sensible y muy especfica. Utilizando anticuerpos
de gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antgeno. (1 pg = 1012 g).
Concepto
El radioinmunoensayo (RIA, del ingls Radio-Immuno Assay) es un mtodo
radioinmunomtrico y fue la primera de las tcnicas de unin competitiva de
protenas desarrollada. Desventajas del radioinmunoensayo es la necesidad de
equipos especiales. Uso de istopos radiactivos, lo que implica la sujecin a
mltiples normas para la utilizacin, conservacin y desecho de estos
productos, de acuerdo con las legislaciones de cada pas y con las normativas
internacionales.

Esta

es

la

principal

causa

de

que

otros

mtodos

inmunoenzimticos hayan desplazado el RIA.

Fundamento terico:
Este ensayo se basa en la reaccin de una protena (anticuerpo especfico) con
un antgeno marcado isotpicamente, y con un antgeno endgeno, el que se
quiere determinar.
Por la Ley de accin de masas, los sitios de unin del anticuerpo sern
ocupados por los antgenos marcado y endgeno, en forma proporcional a las
concentraciones relativas que tienen en el medio de reaccin. Para ello es
imprescindible que se cumplan dos condiciones: que el anticuerpo se

encuentre en concentracin limitada (para que haya concurrencia entre

antgeno marcado y no marcado por sus sitios de unin), y que haya similar
avidez de ambos antgenos, por los sitios de unin del anticuerpo.
Se basa en la formacin especfica de los complejos antgeno-anticuerpo (AgAc), lo que le confiere una gran especificidad unido a la sensibilidad de los
mtodos radiolgicos.
Por la ley de accin de masas, los sitios de unin del anticuerpo sern
ocupados por los antgenos marcados y endgenos, en forma proporcional a
las concentraciones relativas que tienen en el medio de reaccin.
Con estos tres componentes antgeno no marcado (Ag), antgeno marcado
(Ag*) y anticuerpo (Ac) se puede realizar el ensayo, en el cual manteniendo
constante la cantidad de Ag* y Ac se observar que a mayor cantidad de Ag
menos Ag* queda unido a la cantidad fija de Ac, y por tanto menos
radiactividad, lo que permitir relacionar la radiactividad con la concentracin
de Ag.
Para ello es imprescindible que se cumplan dos condiciones:
1.

Que el anticuerpo se encuentre en concentracin limitada (para que

haya concurrencia entre antgeno marcado y no marcado por sus sitios de

unin).
2.

Que exista similar avidez de ambos antgenos, por los sitios de unin del

anticuerpo.
Las caractersticas ms importantes de un anticuerpo para que sea utilizado en
el RIA son: alta especificidad, gran avidez por el antgeno y elevado ttulo.
El anticuerpo debe ser utilizado en una concentracin conocida y limitada, para
que la reaccin se mantenga en la llamada zona de equivalencia. Si el
anticuerpo es levantado con el mismo antgeno que se va a detectar, y el
antgeno marcado tambin, se considera un ensayo homlogo, en el caso
contrario, es un ensayo heterlogo.

La principal diferencia es que para los ensayos heterlogos se considera

necesario un determinado tiempo de ventaja para el antgeno que se va a
detectar, si es el de especie distinta. Por tanto, en lugar de un RIA de
competencia, se convertira en un ensayo de saturacin, lo que permite que el
antgeno endgeno se una preferentemente al anticuerpo y luego se aade el
antgeno marcado, que satura los sitios libres del anticuerpo.
Este tipo de ensayo de saturacin tambin se utiliza para antgenos que se
encuentran en muy pequeas concentraciones (por ejemplo, las hormonas
hipofisarias).
El desarrollo de anticuerpos monoclonales mejor de manera notable la
eficiencia de las tcnicas isotpicas y disminuy, en mucho, el efecto de
reaccin cruzada entre protenas, el cual se presentaba con los antisueros
policlonales cuando haba cadenas comunes entre el antgeno que se iba a
determinar y otros presentes en la muestra. Estos anticuerpos reconocen un
eptope especfico de la protena que se desea detectar, y pueden utilizarse en
combinacin fijando uno a la superficie, y marcando el otro, como se aprecia en
las tcnicas sndwich y en el ensayo inmunorradiomtrico.
El RIA se utiliza en la actualidad para determinar hormonas, vitaminas,
neuropptidos, monoaminas y otras sustancias que se encuentran en
pequeas concentraciones en los fluidos biolgicos y en otros muchos medios.
Ventajas principales del radioinmunoensayo:
-Excelente especificidad.
-Alta sensibilidad.
-Reproducibilidad y robustez.
-Se requieren cantidades mnimas para el ensayo.
-Lo anterior, unido a la constancia de la seal isotpica y a la duracin, hacen
de este mtodo uno de los ms robustos de la tecnologa moderna.

PROCEDIMIENTO
1. Se

mezcla

una

cantidad

constante

de

antgeno

marcado

radioactivamente y una cantidad constante de un anticuerpo para ese

antgeno
2. Se produce la reaccin entre antgeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
3. Se separa la fraccin de antgeno que se ha unido de la que permanece
libre (hay varias formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2
anticuerpo dirigido contra el primero)
4. Se determina la radioactividad
5. Si la muestra contiene adems antgeno fro (no marcado), ste
competir con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observar un
descenso en la medida de la radioactividad
6. Este descenso es proporcional a la concentracin de antgeno fro en la
muestra.
7. Medida en esta curva de calibrado.
Tipos de radioinmunoensayos
Radioinmunoensayo directo
Se basa en la competencia existente entre el antgeno no marcado y una
cantidad conocida del antgeno marcado (Ag*) para formar los complejos Ag-Ac
o Ag*Ac. Con estos tres componentes (Ag, Ag* y Ac) puede realizarse el
ensayo en el que manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac se observar
que a mayor cantidad de Ag menos Ag* queda unido a la cantidad fija de Ac (y
por tanto menos radiactividad), lo que permitir relacionar la radiactividad con
la concentracin de antgeno.
PROCEDIMIENTO
1. Se debern obtener anticuerpos especficos; para ello se inyecta a un
animal pequeas cantidades en varias dosis del antgeno purificado, con
un esquema caracterstico de inmunizacin. El animal generar
anticuerpos que podrn ser recogidos del plasma sanguneo.
2. Se marca el antgeno radiactivamente, sin que este pierda la propiedad
de ser reconocido por el anticuerpo.

3. Se aaden anticuerpos a una placa de titulacin y quedan unidos al

soporte slido, tras lo que se agrega el Ag* en cantidad conocida y el Ag
de la muestra problema.
4. Se elimina el antgeno no unido por decantacin y lavado, y se
determina la cantidad de marcaje unido.
5. Se interpola el valor obtenido en la recta de calibracin que debe
haberse realizado con anterioridad.
Radioinmunoensayo sndwich
1. Se inmoviliza una concentracin fija del Ac 1 (anticuerpo no marcado) en
un soporte slido. Tras lo que se satura el soporte.
2. Se aade la muestra problema (o de calibrado) de Ag.
3. Se aade Ac*2 (anticuerpo marcado) que se une a otro eptopo del Ag.
4. Eliminacin del Ac*2 no unido.
5. Se determina la cantidad de anticuerpo marcado unido.
6. A partir de una recta patrn se interpola el valor obtenido para saber la
concentracin de Ag presente o bien se realiza la recta de calibrado.
Radioinmunoensayo de inhibicin
Usado cuando no se puede marcar el antgeno.
1. Se inmoviliza una cantidad constante de antgeno en un soporte slido.
Se suele saturar con BSA, leche en polvo o casena para que no se
acople

otra

molcula,

de

esta

forma

evitar

indeseables

inespecificidades y altos valores de fondo.

2. Se aade una cantidad constante de anticuerpo marcado y el antgeno
fro a medir (o de calibrado). En este paso se establece una
competencia en la que el Ac se une al Ag fijo al soporte o al problema.

3. Se eliminan el anticuerpo no inmovilizado y el antgeno soluble y se

determina la cantidad de Ac* que se ha inmovilizado.
4. Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de Ac*
inmovilizado frente a la concentracin de Ag soluble aadida o bien se
interpola la radiactividad
Aplicaciones, ventajas y desventajas del radioinmunoensayo
El RIA se utiliza en la actualidad para determinar hormonas, vitaminas,
neuropptidos, monoaminas y otras sustancias que se encuentran en
pequeas concentraciones en los fluidos biolgicos y en otros muchos medios.
Las ventajas principales son su especificidad, sensibilidad y reproducibilidad
que, unidas a la constancia de la seal isotpica y a la duracin, hacen de este
mtodo uno de los ms robustos de la tecnologa moderna.
Las desventajas son la necesidad de equipos especiales y el uso de istopos
radiactivos, lo que implica la sujecin a mltiples normas para la utilizacin,
conservacin y desecho de estos productos, de acuerdo con las legislaciones
de cada pas y con las normativas internacionales.

Figura 1.23 Separacin de la fraccin libre y la unida al anticuerpo.

Los primeros mtodos de separacin usados fueron la electroforesis y la
cromatografa en papel, pero ambos se desecharon muy rpido por la lentitud,
laboriosidad y gran contaminacin que producan. En la actualidad se emplean
los siguientes:

Fsicos: fundamentalmente de adsorcin sobre partculas como el carbn

activado, micelas de carbn con dextranos, etc. Son muy laboriosos y
necesitan temperaturas muy fijas (por ejemplo 4 C, trabajar en bandejas con
hielo,

centrifugacin

refrigerada,

etc.).

Tambin se emplea la extraccin de lquido del medio para hacer que el

complejo antgeno-anticuerpo precipite con ms facilidad, con sustancias que
absorben el agua: polietilenglicol.
1. Qumicos: se basan sobre todo en desnaturalizar la protena para
precipitarla. Son muy inespecficos, pues puede precipitarse tambin
antgeno marcado. La precipitacin se hace con solventes orgnicos,
cidos y lcalis dbiles.
2. Inmunolgicos: consisten en el uso de un segundo anticuerpo contra el
primer anticuerpo que aumente el tama?o del complejo y, por tanto,
precipite ms rpido.
3. Combinados: se basan en el empleo de dos de los mtodos anteriores,
por ejemplo, un segundo anticuerpo con polietilenglicol. Es el ms usado
en la actualidad.
Caractersticas del anticuerpo. Ensayos homlogos y heterlogos
Las caractersticas ms importantes de un anticuerpo para que sea utilizado en
el RIA son: alta especificidad, gran avidez por el antgeno y elevado ttulo. El
anticuerpo debe ser utilizado en una concentracin conocida y limitada, para
que la reaccin se mantenga en la llamada zona de equivalencia.
Si el anticuerpo es levantado con el mismo antgeno que se va a detectar, y el
antgeno marcado tambin, se considera un ensayo homlogo, en el caso
contrario, es un ensayo heterlogo.
La principal diferencia es que para los ensayos heterlogos se considera
necesario un determinado tiempo de ventaja para el antgeno que se va a
detectar, si es el de especie distinta. Por tanto, en lugar de un RIA de
competencia, se convertira en un ensayo de saturacin, lo que permite que el

antgeno endgeno se una preferentemente al anticuerpo y luego se aade el

antgeno marcado, que satura los sitios libres del anticuerpo (figura 1.22).
Este tipo de ensayo de saturacin tambin se utiliza para antgenos que se
encuentran en muy pequeas concentraciones (por ejemplo, las hormonas
hipofisarias).
Uso de anticuerpos monoclonales
El desarrollo de este tipo de anticuerpos mejor de manera notable la eficiencia
de las tcnicas isotpicas y disminuy, en mucho, el efecto de reaccin
cruzada entre protenas, el cual se presentaba con los antisueros policlonales
cuando haba cadenas comunes entre el antgeno que se iba a determinar y
otros presentes en la muestra. Estos anticuerpos reconocen un eptope
especfico de la protena que se desea detectar, y pueden utilizarse en
combinacin: se fija uno a la superficie, y se marca el otro, como se aprecia en
las tcnicas sndwich y en el ensayo inmunorradiomtrico (IRMA).

Figura 1.21 Reaccin bsica del radioinmunoensayo.

Figura 1.22 Ensayo de saturacin.

Mtodos de separacin de la fraccin libre y la unida
Una vez desarrollada la reaccin, debe separarse el complejo antgenoanticuerpo del medio donde an queda antgeno marcado libre y antgeno
endgeno, para poder cuantificar la radiactividad unida al anticuerpo (figura
1.23).
Se han desarrollado ensayos comerciales que utilizan un anticuerpo fijado a la
pared del tubo. Esto elimina la necesidad de mtodos de separacin
complicados, pues basta con decantar el lquido sobrante.
Una vez separadas las fracciones libre y unida, se cuantifica la radiactividad y
se compara con una curva de concentraciones conocidas de antgeno fro, que
se utiliza como calibrador.
Clculo de las concentraciones
Los mtodos de clculo ms usuales incluyen la fraccin isotpica unida al
anticuerpo (fraccin unida) por comparacin al llamado 100 % de unin, unin
mxima o unin en ausencia de antgeno. Con frecuencia se utilizan los
logaritmos de los ndices de fraccin unida/fraccin libre o artificios
matemticos.
Por sus caractersticas especiales, los ensayos de ligando han requerido
sistemas de clculo diferentes, como el diseo del LOGIT (logaritmo inverso

[de la fraccin unida/la unin mxima]). Este artificio matemtico logra que la
curva del RIA sea lineal y mejora la proporcionalidad entre la seal isotpica y
la concentracin del antgeno que se va a determinar.
El

radioinmunoensayo

de

progesterona

facilita

la

evaluacin

del

comportamiento reproductivo, el manejo reproductivo de fincas y la medicin de

la respuesta reproductiva a intervenciones tcnicas en diversos tipos de
estudios y trabajos de investigacin. Adems de esto, puede convertirse en una
herramienta de valor prctico para el productor en apoyo del mejoramiento de
la eficiencia productiva y reproductiva del ganado bovino. Entre estos ltimos
se tiene, a) El diagnstico de no-gestacin en base a muestras recolectadas a
los 21-24 das post servicio, y que presenta una confiabilidad cercana al 100%;
b) La identificacin de deficiencias en las prcticas de alimentacin y manejo
animal y la evaluacin de las medidas correctivas mediante un protocolo de
trabajo que incluye determinaciones de metabolitos nutricionales sanguneos,
determinacin de progesterona y anlisis bromatolgico de los alimentos; y c)
La evaluacin de la eficiencia de los programas de inseminacin artificial
mediante muestras de leche recolectadas en el da del servicio, y a los 10-12 y
22-24 das post servicio.

Radioinmunoprecipitacin
La

tcnica

radioinmunoprecipitacin

(RIPA,

del

ingls

Radio-Immuno

Precipitation Assay), se utiliza para detectar antgenos en mezclas celulares.

Depende de la abundancia de antgenos en la muestra original y de la afinidad
del anticuerpo que se utilice para reconocerlos.
La inmuno precipitacin es un tcnica muy precisa que tiene la ventaja sobre el
inmunoblot que no desnaturaliza las protenas antes de que se produzca la
unin

del

antgeno

con

el

autoanticuerpo,

permite

autoanticuerpos dirigidos contra eptopos conformacionales

PROCEDIMIENTO
Consta de cinco pasos:

as

detectar

1. Marcaje del antgeno (opcional). Aqu el Ag es marcado incubando las

clulas en un medio rico en precursores radiactivos, como el ?H-Timidina.
2. Lisis celular. Se extrae el Ag con un buffer apropiado de lisis celular y se
centrifuga, obteniendo finalmente la sustancia marcada en el sobrenadante.
3. Formacin del complejo inmune Ag-Ac. Una vez extrado el Ag son aadidos
los Acs en el lisado con la siguiente formacin del inmunocomplejo.
4. Precipitacin del complejo inmune. Para ello se utiliza protena A o G con
agarosa, la cual se une al complejo precipitndolo.
5. Electroforesis y revelado de la protena antignica (Fig. 6.5).
Fig. 6.5. Procedimiento para radioinmunoprecipitacin

BIBLIOGRAFIA:
1.- http://www.ehu.eus/biomoleculas/isotopos/ria.htm
2.- http://www.buenastareas.com/ensayos/Radioinmunoensayo/256553.html

3.- Garca-Segura, J. M. y col. (2002). 1.17 Mtodos Radioinmunomtricos.

Tcnicas instrumentales de anlisis en Bioqumica. Madrid: Sntesis. 84-7738429-0.

4.-

http://www.monografias.com/trabajos-pdf/sindrome-diarreico-

rotavirus/sindrome-diarreico-rotavirus.pdf
5.-

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/18%20INMUNOAN

%C3%81LISIS.pdf