GIP # 5

EXTRACCION DE CIDOS NUCLEICOS

OBJETIVOS

Justificar la tcnica en base a las caractersticas de las estructuras

celulares
Realizar las lisis celulares y nucleares
Separar los cidos nucleicos del resto de estructuras
Observar al microscopio la estructura de los cidos nucleicos
Evidenciar el carcter cido de los cidos nucleicos
Almacenar los cidos nucleicos extrados para su posterior utilizacin

FUNDAMENTO TEORICO.La tcnica de extraccin de cidos nucleicos en eucariotas, est relacionada con
su ubicacin en el ncleo celular y las propiedades fsicas y qumicas de todas las
biomolculas celulares. Es preciso desorganizar la estructura de paredes y
membranas
para
liberar
los
cidos
nucleicos.
Por mecanismos mecnicos y posteriormente qumicos a travs de la solucin de
lisis, se acta sobre las paredes y las estructuras lipoproteicas de las membranas.
Se extraen de la mezcla de fragmentos celulares con alcoholes especficos, en los
que
los
cidos
nucleicos
no
son
solubles.
Una vez extrados los cidos nucleicos, se guardan en congelacin. La extraccin
de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los estudios de
biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este
caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a
partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de
modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms
importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy
purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar
mtodos de extraccin adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el
anlisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos
negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se
recomienda vivamente efectuar un experimento de control de la inhibicin de la

PCR, que suele hacerse mediante PCR especfica de vegetales (eucariotas o

cloroplastos) o de la especie.

Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos

existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a
los criterios siguientes:
cido nucleico diana;
Organismo fuente;
Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin);
Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de
ADN, etc.)
A continuacin se recogen los principios de algunos de los mtodos de extraccin
y purificacin de cidos nucleicos que ms se emplean en la actualidad. Mtodos
de extraccin Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso
provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos
nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir
en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el
material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para
preservar el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran
los siguientes:
Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);
Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles,
etc.);

 Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular

e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma
solucin puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y
sales caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis
celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan
fcilmente por filtracin o precipitacin.

Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares
suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:
Extraccin/precipitacin
Cromatografa
Centrifugacin
Separacin por afinidad

Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los
contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las protenas. Para
concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol
o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la
mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la precipitacin.
Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas
elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante
cambios del pH.

Cromatografa
Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin: permeacin
sobre gel, intercambio inico, adsorcin selectiva o unin por afinidad. La
permeacin sobre gel aprovecha las propiedades de las partculas porosas del gel
para tamizar molculas. Se emplea una matriz con poros de tamao definido, que
dejan pasar las molculas ms pequeas por difusin, pero no las ms grandes,

que quedan eluidas en el volumen vaco. As pues, las molculas quedan eluidas
por orden de tamao decreciente. La cromatogrfica de intercambio inico es otra
tcnica, que se basa en la interaccin electrosttica de la molcula diana con un
grupo funcional de la matriz en columna. Los cidos nucleicos (polianiones
lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio
inico con simples Tampones salinos. En la cromatografa de adsorcin, los cidos
nucleicos se fijan selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas
sales (por ejemplo, sales caotrpicas), mientras que otras molculas biolgicas no
se fijan. A continuacin, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampn
hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las
aplicaciones posteriores.

Centrifugacin
La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin eficaz. As, por
ejemplo, la ultracentrifugacin en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g
elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plsmidos. La
centrifugacin suele asociarse a otros mtodos, como la cromatografa de
columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeacin sobre gel y la
centrifugacin para separar el ADN o ARN de contaminantes ms pequeos
(sales, nucletidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar segn el tamao.
Algunos procedimientos combinan la adsorcin selectiva en matriz cromatogrfica
(vase el apartado anterior Cromatografa) y la elucin por centrifugacin para
purificar de forma selectiva un tipo de cido nucleico.

Separacin por afinidad

En los ltimos aos, cada vez son ms los mtodos de purificacin que combinan
la inmovilizacin por afinidad de cidos nucleicos y la separacin magntica. Por
ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partculas magnticas revestidas de
estreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partculas
puede eliminarse de la solucin (y de los contaminantes libres) con un imn. Esta
tcnica en fase slida simplifica la purificacin de los cidos nucleicos, pues
permite sustituir las etapas de centrifugacin, extraccin orgnica y separacin de
fases por una operacin de separacin magntica, nica y rpida.

MATERIALES

Muestra vegetal
Agua (destilada)
Cloruro de sodio
Bicarbonato sdico
LSS (lauril sulfato de sodio)
Alcohol isopropilico
Trituradora o mortero
Centrifugadora
Vaso pp 100 ml
Tubo de ensayo
Varilla de vidrio

PROCEDIMIENTO
1.-preparamos el tampn con los reactivos y lo mantuvimos en la nevera:

120 ml de agua destilada

1,5 g de NaCl preferiblemente puro
5 g de bicarbonato sdico
5 ml de detergente liquido

2.elegimos

la

muestra

que vamos a proporcionar el ADN entre los vegetales y cortamos en cuadritos

unos 20-30g

3.-trituramos la muestra con un poco de agua en el mortero as logramos romper

muchas clulas

4.-mezclamos en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del

tampn y agitamos durante 2 minutos. Separamos los restos vegetales ms
grandes del calcio molecular centrifugando a baja velocidad 5 minutos despus
pipetear el sobrenadante

isopropilico enfriando a
escurrir lentamente el
interna dl recipiente,
El alcohol quedo
tampn.

5.- retiramos 5 ml de caldo molecular aun tubo

de ensayo y
aadimos con pipeta
5ml de alcohol
isoamilico o
0 OC. Dejamos
alcohol por la cara
tenindolo inclinado.
flotando sobre el

6.-luego se introducimos una varilla hasta debajo de la

separacin entre el alcohol y el tampn. Removimos la varilla en forma circular y
poco a poco se fue enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Paso un
minuto y retiramos la varilla atravesando la capa de alcohol en lo cual el ADN
quedo adherido a su extremo y se observ como una neblina que cae.

RESULTADOS

CONCLUSIONES
Al

realizar

adecuadamente,

el

procedimiento
resulta que las fibrillas

de ADN comenzaron a salir, de un color blanco precipitado por sobre el alcohol

(mezcla Heterognea). Con un alambre doblas y obtenemos y sacamos del tubo

de ensayo el ADN. Si quieres conservar el ADN puede dejarse secar sobre un

papel de filtro.
En caso de que el ADN de la Muestra Vegetal no se pueda apreciar muy
claramente. Tenemos que agitar el tubo un poco para poderlo apreciarlo mejor.
Si se tiene problemas con el filtro, que no est bien hecho y que no filtra bien, por
lo tanto hay que hacer otro. Tambin puede haber complicaciones con la forma de
poner el alcohol de manera que cayera por las paredes del tubo de ensayo.
CUESTIONARIO
1. A QU SE DENOMINAN CIDOS NUCLEICOS?
Se denominan cidos nucleicos a grandes polmeros formados por la
repeticin de monmeros denominados nucletidos, unidos mediante
enlaces fosfodister. Se forman, largas cadenas; algunas molculas de
cidos nucleicos llegan a alcanzar tamaos gigantescos, con millones de
nucletidos encadenados.
2.

CULES SON LOS PRINCIPALES GRUPOS FUNCIONALES QUE

CONFORMAN LOS CIDOS NUCLEICOS?
Aquellas bases formadas por dos anillos se denominan bases pricas
(derivadas de la purina). Tenemos: Adenina (A), y Guanina (G). Si poseen
un solo ciclo, se denominan bases pirimidnicas (derivadas de la pirimidina),
y tenemos: la Timina (T), Citosina (C), Uracilo (U).
Los derivados de la purina y la pirimidina son las bases que se encuentran
con mayor frecuencia en los cidos nucleicos.

3.

EXPLIQUE EN FORMA RESUMIDA LA FUNCIN DE CADA PASO

REALIZADO EN EL PROCEDIMIENTO DE LA EXTRACCIN DE CIDOS
NUCLEICOS

TRITURACIN DE VERDURA HASTA OBTENRE CALDO HOMOGNEO:

se realiza para romper las paredes de las clulas.
SE AGREGA AGUA: para disolver compuestos como carbohidratos.
10 MINUTOS DE AGITACIN: para disolver lpidos y grasas.
CENTRIFUGAR: para separar las protenas quedando las ms pesadas en
el sedimento.
AGREGAR 5ML DE SOBRENADANTE EN TUBO GRANDE Y SE AGREGA
5ML DE ALCOHOL CON TUBO INCLINADO: para formar dos fases.

 SE INTRODUCE LA VARILLA HASTA EL FONDO DEL TUBO Y SE GIRA:

se gira para que el ADN o ARN se adhiera en la varilla ya que presenta
afinidad por el vidrio silicatado.
SE SACA LA VARILLA: al sacar la varilla se observa que en el alcohol se va
quedando como una turbidez blanca, sos son los cidos nucleicos de la
verdura, en algunos se ven cristales en la varilla y sos cristales son los
cidos nucleicos de la verdura.

4. REALICE UNA FRMULA DE ADN CON 10 PARES DE BASES

NITROGENADAS ESCRITO A MANO.

5. REALICE UNA FRMULA DE ARN CON 10 BASES NITROGENADAS

ESCRITO A MANO.

6. EXPLIQUE: DUPLICACIN DE ADN, TRANSSCRIPCIN DE ARN Y

TRADUCCIN DE PROTENAS

 DUPLICACIN DE ADN: Las clulas somticas se dividen por un proceso

llamado mitosis en el que una clula se divide para producir clulas hijas
cada una de las cuales contiene una copia idntica de ADN original. Antes
de la divisin celular el DNA debe replicarse en la clula, la replicacin se
produce por un proceso llamado REPLICACIN SEMICONSERVATIVA, la
replicacin se produce en una serie de etapas en las que actan diferentes
protenas. LA replicacin es iniciada por la ADN helicasa una enzima que
separa las dos cadenas de nucletidos, conforme la helicasa desenrrolla el
DNA, las protenas de unin a cadena sencilla se unen a cada hebra y
evitan que las bases se vuelvan a aparear y se forme de nuevo una doble
hlice.
TRANSCRIPCIN DE ARN: La ARN polimerasa es la enzima clave de la
transcripcin, dentro del ncleo la RNA polimerasa desenrrolla la hlice de
DNA y luego copia una cadena de DNA en ARN. A diferencia de la
replicacin del DNA donde la molcula entera de DNA se copia, la
transcripcin se produce solo en los segmentos de un cromosoma que
contiene genes. Existe un promotor que es una secuencia especfica de
nucletidos que permite a la ARN polimerasa unirse a determinados lugares
prximos a los genes, las protenas llamadas factores de transcripcin
ayudan a la ARN polimerasa a encontrar el promotor y unirse DNA y las
secuencias llamadas potenciadores tambin pueden desempear un
importante papel en la transcripcin. Despus de que la ARN polimerasa se
une al promotor, desenrrolla una regin del ADN para separar las dos
hebras. Slo una de las dos cadenas llamada cadena molde es copiada por
la ARN polimerasa, una vez orientada correctamente, la RNA polimerasa
acta en direccin 5 a 3 a lo largo de la cadena molde DNA para copiar
una cadena complementaria de RNA mediante la formacin de enlaces
fosfodister, cuando la ARN polimerasa llega al final de un gen, se
encuentra una secuencia de terminacin, la RNA polimerasa y el RNA
recin formado se liberan de la molcula de DNA.
TRADUCCIN DE PROTENAS: La sntesis proteica se desarrolla en el
citoplasma celular donde se encuentran los ribosomas, que son partculas
que en procariotas estn formadas por 3 molculas de rRNA asociados con
alrededor de 52 molculas proteicas. Estos proporcionan el sistema
enzimtico necesario para realizar la unin peptdica entre los aminocidos
que van a integrar la protena, el sitio de unin para el mRNA, y el sitio de
anclaje para los tRNA que portan los aminocidos; estos sitios se
denominan A y P. Los tRNA se asocian con las bases del mRNA mediante
la interaccin codn-anticodn. Los primeros descubrimientos sobre el
cdigo gentico mostraron que la informacin proveniente del DNA

(transcripta a un mRNA) se lee de a tripletes de bases o nucletidos. Cada

triplete de bases se corresponde con un aminocido.

7. RECORTE UN CUADRO DEL CDIGO GENTICO Y EXPLIQUE CMO

SE LO UTILIZA.

8. BUSQUE ALGN CUADRO O ESQUEMA QUE SEALE CUANTOS

GENES TIENE CADA CROMOSOMA HUMANO, INDIQUE EL TOTAL DE
GENES, QUIN TIENE MS GENES EL HOMBRE Y LA MUJER.

El genoma humano consta de una secuencia de ADN contenida en 23 pares de

cromosomas en el ncleo de cada clula humana diploide.
De los 23 pares, 22 son cromosomas autosmicos y un par determinante del sexo.
El genoma haploide (es decir, con una sola representacin de cada par) tiene una
longitud total aproximada de 3200 millones de pares de bases de ADN (3200 Mb)
que contienen unos 20 000-25 000 genes
9. INVESTIGUE COMO SE REALIZA LA EXTRACCIN DE GENES EN
INGENIERA GENTICA.

10.
INVESTIGUE EN INGENIERA GENTICA, CMO SE
INTRODUCE UN NUEVO GEN DE UNA ESPECIE A OTRA.

Se utiliza distintas tcnicas entre las cuales las ms importantes son:

a) Transferencia de genes de una especie a otra: Hay tcnicas por las que se
pueden transferir genes de una especie a otra. As, mediante un vector apropiado,
que puede ser un plsmido o un virus, se puede introducir un gen de una especie
en otra diferente. Con estas tcnicas se pueden pasar genes de eucariotas a
eucariotas, de eucariotas a procariotas y de procariotas a procariotas.
b) Tcnica de la PCR: Tambin existen mtodos para amplificar una determinada
secuencia o fragmento de ADN. La ms conocida es la tcnica de la reaccin en
cadena de la polimerasa PCR. As se consigue multiplicar un determinado
fragmento de ADN millones de veces para poder tener una cantidad suficiente
para estudiarlo. Sin esta tcnica seran imposibles los estudios de ADN para el
reconocimiento de la paternidad o en caso de delito, pues la cantidad de ADN
presente en las clulas es tan pequea, del orden de picogramos, que se
necesitara una gran cantidad de material celular para tener una cantidad
apreciable de ADN.

EXTRACCION DE CIDOS NUCLEICOS

Carrera: Bioqumica y Farmacia

Asignatura: Biotecnologa
Docente: Dr. Juan Alberto Osinaga
Grupo: B
Integrantes:
Cruz Mendoza Elvira
Garca Nina Ruth Noem
Novillo Gutirrez Nidia
Parra Orosco Daniela Mairn