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ARTICLE IN PRESS

Rev Lab Clin.. 2010;3(1):4048

Revista del Laboratorio Clnico

www.elsevier.es/LabClin

N
REVISIO

Importancia de las aplicaciones clnicas de la Proteo

mica
ngel San Miguel Herna
ndez, Rafael San Miguel y Francisco Javier Martn-Gil
A
Comisio
n de Investigacio
n y Servicio de Analisis Clnicos, Hospital Universitario Ro Hortega, Valladolid, Espan
a
Recibido el 30 de octubre de 2008; aceptado el 26 de junio de 2009
Disponible en Internet el 25 de septiembre de 2009

PALABRAS CLAVE
Proteo
mica;
Aplicaciones clnicas;
Bioinforma
tica

KEYWORDS
Proteomics;
Clinical applications;
Bioinformatics

Resumen
La utilidad pra
ctica de los resultados obtenidos con la Proteo
mica en relacio
n con la salud
esta
cobrando gran importancia. El descubrimiento de marcadores proteicos de
enfermedades como las cardiovasculares, las neurolo
gicas, las oncolo
gicas, las metabo
licas, entre otras, tiene una aplicacio
n clnica en un futuro pro
ximo en el diagno
stico, el
seguimiento y el tratamiento de estas enfermedades.
La HUPO (Human Proteome Organization) (disponible en: www.hupo.org) se creo
en el an
o
2001 para impulsar un mayor conocimiento de la importancia de la Proteo
mica y las
oportunidades que ofrece en el diagno
stico, el prono
stico y el tratamiento de las
enfermedades. Se han constituido posteriormente varios grupos: HPPP (Human Plasma
Proteome Project), HLPP (Human Liver Proteome Project), PSI (Proteome Standards
Initiative), HBPP (Human Brain Proteome Project) y MRPP (Mouse and Rat Proteome
Project). Uno de los principales objetivos de la Proteo
mica es la identicacio
n de
marcadores de enfermedad. Un planteamiento ha sido comparar la expresio
n proteica de
los tejidos normales y enfermos para identicar protenas que se expresen de forma
aberrante y que puedan representar nuevos marcadores. Otra estrategia es el ana
lisis de
las protenas segregadas en lneas celulares y cultivos primarios y, nalmente, la obtencio
n
de perles proteicos en suero.
Los estudios proteo
micos esta
n adquiriendo en los u
ltimos an
os una gran relevancia,
fundamentalmente en lo que hace referencia a su aplicacio
n a la enfermedad humana. Con
este n se esta
realizando un gran nu
mero de estudios en el plasma humano, los tejidos y
diversos lquidos biolo
gicos.
& 2008 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier Espan
a, S.L. Todos los derechos
reservados.
Importance of the clinical applications of proteomics
Abstract
The practical usefulness of the results of Proteomics in relation to health is very important.
The discovery of protein markers of diseases such as cardiovascular, neurological,

Autor para correspondencia.

Correo electro
nico: asanmiguel@hurh.sacyl.es (A.S. San Miguel Herna
ndez).
1888-4008/$ - see front matter & 2008 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier Espan
a, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.labcli.2009.06.004

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Importancia de las aplicaciones clnicas de la Proteo

mica

41

oncologic, metabolic, among others, has an immediate clinical application in the

diagnosis, monitoring and treatment of these diseases.
The Human Proteome Organization (HUPO, www.hupo.org) was established in 2001 to
promote greater awareness of the importance of proteomics and opportunities in the
diagnosis, prognosis and treatment of diseases. It has subsequently formed several groups:
HPPP (Human Plasma Proteome Project), HLPP (Human Liver Proteome Project), PSI
(Proteome Standards Initiative), HBPP (Human Brain Proteome Project) and MRPP (Mouse
and Rat Proteome Project). One of the main goals of proteomics is the identication of
markers of disease. One approach has been to compare the expression of proteins in
normal and diseased tissues to identify proteins that are expressed abnormally and may
represent new markers. Another strategy is the analysis of proteins in segregated cell lines
and primary cultures and nally, obtaining serum protein proles.
Proteomic studies are gaining a higher prole in recent years, mainly in its application to
human pathology. To this end a large number of studies are being conducted in human
plasma, tissues and various body uids.
& 2008 AEBM, AEFA y SEQC. Published by Elsevier Espan
a, S.L. All rights reserved.

Introduccio
n
La Proteo
mica es, con la Geno
mica, una de las nuevas
disciplinas que ma
s interes esta
adquiriendo en los u
ltimos
an
os. El auge de la Proteo
mica se debe a 2 razones
fundamentales: en primer lugar, a que los grandes proyectos
de secuenciacio
n de genomas han generado una enorme
cantidad de informacio
n y, en segundo lugar, a que la
necesidad de descifrar esta ingente cantidad de informacio
n
geno
mica ha estimulado considerablemente el estudio
directo y a gran escala de los productos codicados por los
genes, es decir, las protenas. Simulta
neamente, se ha
estimulado el desarrollo de nuevas herramientas bioinforma
ticas para analizar y procesar esta informacio
n1.
Las herramientas disponibles (principalmente el ana
lisis
de aminoa
cidos y la secuenciacio
n de Edman) so
lo permitan
el ana
lisis de protenas de una forma poco sensible y
excesivamente lenta y costosa. El reciente desarrollo de la
Proteo
mica ha ido parejo al de las tecnicas de ionizacio
n
suave y nuevos analizadores o mejoras, como TOF (time of
ight tiempo de vuelo), cuadrupolo (Q) y trampa io
nica
(ION TRAP), que permiten la identicacio
n y la secuenciacio
n de protenas con unos niveles de rapidez, sensibilidad y
versatilidad sin precedentes1.
El termino proteoma se utiliza para describir el conjunto
de protenas que se expresan a partir de un genoma. El
proteoma es un elemento altamente dina
mico cuyos
componentes varan en un organismo, un tejido, una celula
o un compartimento subcelular dados como consecuencia de
cambios en su entorno, situaciones de estres, administracio
n
de fa
rmacos, efectores o sen
ales bioqumicas o su estado
siolo
gico o patolo
gico. Estos factores incrementan de
forma considerable la complejidad del proteoma como
consecuencia de la activacio
n o la supresio
n de la expresio
n
de genes, las alteraciones en la intrincada pauta de
interacciones intracelulares entre las protenas o los
cambios en sus modicaciones postraduccionales1,2.
Si bien el termino proteoma se aplica indiscriminadamente a cualquier conjunto de protenas, su acepcio
n ma
s
precisa es la que se reere al conjunto de protenas que
componen una celula o un tipo celular dado en unas

condiciones determinadas. El proteoma de una celula es la

expresio
n de su fenotipo caracterstico, y las diferencias
entre un tipo celular y otro o entre un mismo tipo celular en
diferentes situaciones se pueden, con cierta propiedad,
asignar a los cambios que tienen lugar en la expresio
n y la
funcionalidad de sus protenas13.
La Proteo
mica, entendida como estudio del proteoma,
supone una aproximacio
n metodolo
gica a las biociencias,
que se perlan como una potente herramienta, tanto desde
el punto de vista cualitativo como cuantitativo, para el
estudio de aspectos siopatolo
gicos en los seres humanos.
Esto, unido al continuo y progresivo avance biotecnolo
gico,
ha contribuido a la aparicio
n de abundante bibliografa
sobre la utilizacio
n de te
cnicas proteo
micas en el abordaje
de algunas enfermedades14 y su presencia en el laboratorio
clnico5,6.
As, se pretende explicar el considerable volumen de
proyectos de investigacio
n generados en Proteo
mica y la
necesidad de caracterizar esta investigacio
n en te
rminos de
cua
les son las te
cnicas proteo
micas utilizadas, las enfermedades estudiadas y el tipo de uso que se propone. Asimismo,
se puede observar cua
l es la tendencia y si existen en la
actualidad aplicaciones de la Proteo
mica en la asistencia
sanitaria hospitalaria e identicar posibles aplicaciones a
corto o a medio plazo.
Segu
n la tendencia observada, es previsible que el interes
por la Proteo
mica en Biomedicina continu
e durante muchos
an
os y que siga siendo objeto de abundante investigacio
n. El
conocimiento aportado por esta investigacio
n puede llevar a
la identicacio
n de nuevas moleculas de naturaleza aminoproteca de interes clnico7. La validacio
n y el estudio de la
utilidad de estas moleculas como biomarcadores para el uso
asistencial8 pueden generar una futura demanda de actividad en el medio hospitalario.
Esto podra estar relacionado con la efectividad y la
relacio
n coste-efectividad del uso de tecnicas proteo
micas o
bien de te
cnicas convencionales para la determinacio
n de
protenas (como el enzimoinmunoanalisis o la cromatografa
lquida [LC]), todo ello en indicaciones concretas, como el
diagno
stico, la prediccio
n del prono
stico o las indicaciones
de fa
rmacos9.

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Proteo
mica, Geno
mica y Metabolo
mica
Mientras el genoma de un organismo es constante en la
totalidad de sus celulas, excepto mosaicismos y mutaciones
selectivas, el proteoma supone un concepto mucho ma
s
variable10. Este dinamismo no so
lo se observa en diferentes
sistemas, tejidos e incluso celulas, sino en estos mismos
cuando son receptores de distintas condiciones internas o
externas. Todo ello se traduce en un proteoma cambiante,
as como una gran cantidad de posibles interacciones entre
las protenas que lo componen. Si a esto se an
ade la
ausencia de una metodologa de amplicacio
n proteica,
puede intuirse que, a diferencia del genoma, el ana
lisis
completo de toda la realidad de proteomas es una tarea
difcil11,12.
Esta complejidad hace que el estudio del proteoma
plantee retos importantes. Para dar respuesta a estos retos,
se precisan continuos desarrollos y mejoras en las tecnicas
de ana
lisis de protenas, como se comentara
en el siguiente
apartado.
Las protenas actu
an dentro de otra red bioqumica
mucho ma
s amplia y compleja, que es el metabolismo de
las celulas. El estudio general de las redes metabo
licas se
comienza a conocer como Metabolo
mica. Genoma, proteoma y metaboloma forman un entramado, cuyo estudio
supone un salto cualitativo determinante en las ciencias
biome
dicas. La combinacio
n de Proteo
mica con Genetica,
Bioqumica o Biofsica ha supuesto el descubrimiento de
muchas protenas y de la funcio
n de estas13.
El gran nu
mero de proyectos orientados a estudiar
proteomas de forma sistema
tica ha conducido a describir
la Proteo
mica como la ciencia o el conjunto de tecnologas
que estudian el proteoma. Algunos autores preeren denir
la Proteo
mica como la parte de la Geno
mica Funcional que
centra su atencio
n en el estudio directo de las protenas.

Tipos de estudios en Proteo

mica
La Proteo
mica se ha aplicado fundamentalmente a 3 tipos de
estudios1:
a) La caracterizacio
n sistema
tica de protenas, con el
objetivo de abordar la identicacio
n a gran escala de
los componentes de un proteoma.
La identicacio
n a gran escala de los componentes de un
proteoma permite la catalogacio
n de estos y la construccio
n de bases de datos, que suelen organizarse sobre
la base de la imagen del proteoma que resulta de su
separacio
n mediante electroforesis bidimensional. Estas
bases de datos tienen una enorme utilidad para los
proyectos de investigacio
n que necesiten un conocimiento detallado de esos proteomas.
b) La identicacio
n de los componentes del proteoma que
presentan cambios en sus niveles de expresio
n a
consecuencia de alteraciones siopatolo
gicas o inducidas
por agentes externos (Proteo
mica de Expresio
n Diferencial). Estos proyectos abordan la identicacio
n de
protenas que presentan alteraciones en sus niveles de
expresio
n a consecuencia de cambios en su entorno,
situaciones de estres, administracio
n de fa
rmacos,
efectores o sen
ales bioqumicas o su estado siolo
gico o

A.S. San Miguel Herna

ndez et al
patolo
gico, lo que permite as determinar cua
les son las
protenas que intervienen en esos procesos o identicar
protenas con cambios de expresio
n que resulten caractersticos del proceso (identicacio
n de marcadores
diagno
sticos). Este tipo de estudios puede tambien
llevarse a cabo mediante la tecnologa de los chips de
ADN, aunque, en la pra
ctica, se trata de 2 aproximaciones complementarias. Los niveles de expresio
n del ARN
mensajero no siempre reejan adecuadamente el nivel
de expresio
n real de las protenas correspondientes, por
lo que la aproximacio
n proteo
mica permite obtener
resultados ma
s concluyentes desde un punto de vista
tanto siolo
gico como farmacolo
gico. Sin embargo, la
tecnologa de los chips de ADN permite concentrar el
ana
lisis en el nivel de expresio
n de determinados genes
con una sensibilidad superior.
c) La caracterizacio
n de las interacciones subcelulares
existentes entre las protenas y la determinacio
n de los
componentes de complejos macromoleculares (Proteo
mica de Mapa Celular).
Lo que se pretende estudiar es la funcio
n de las protenas
y caracterizar las interacciones que presentan en el interior
de la celula. Estos proyectos responden a la nocio
n cada vez
ma
s extendida de que las protenas no actu
an de forma
aislada, sino a traves de grandes complejos macromoleculares, que agrupan conjuntos de factores que realizan las
diferentes etapas de un mismo proceso celular, de forma
que su proximidad aumenta la eciencia de cada etapa.
Muchas veces, la identicacio
n de los componentes de un
complejo macromolecular o de los factores que interaccionan con una protena dada resulta el camino ma
s ra
pido para
determinar su funcionalidad. Mediante este tipo de proyectos, aplicados de forma sistema
tica, los investigadores
pretenden construir un mapa fsico de las interacciones
existentes entre las protenas celulares.

Tecnologa en Proteo
mica
La Proteo
mica se basa en el uso sinergico de te
cnicas y
procedimientos quimicofsicos para el ana
lisis global y la
separacio
n de los componentes del proteoma, matrices de
protenas para el estudio de las cualidades funcionales de las
protenas y sus interacciones, y herramientas informa
ticas
para el procesado y la interpretacio
n de los datos.

Procedimientos quimicofsicos y tratamiento de

resultados
Ana
lisis preespectrome
tricos
Incluyen sistemas electroforeticos y cromatogra
cos: la
electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato
so
dico (SDS-PAGE) de 1 y 2 dimensiones, la electroforesis
capilar con acoplamiento a espectrometra de masas (EM o
MS) y los procedimientos cromatogra
cos para puricacio
n
de protenas, incluyendo la cromatografa lquida de alta
resolucio
n (HPLC) de fase normal, fase reversa, exclusio
n
molecular, intercambio io
nico y basada en bioanidad.
La metodologa ma
s empleada es la SDS-PAGE, que
permite la separacio
n de las protenas de acuerdo con su
peso molecular. Esta metodologa se suele combinar con la

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Importancia de las aplicaciones clnicas de la Proteo

mica
separacio
n previa de las protenas sobre la base de su punto
isoelectrico (isoelectroenfoque). De este modo, al separar
primero en funcio
n de sus propiedades electricas y despues
por su taman
o, es posible aislar pra
cticamente todas
las protenas de un proteoma en una matriz bidimensional
(sistema de electroforesis bidimensional o 2-DE [g. 1]).
El resultado es una serie de manchas o spots, cada una
de las cuales corresponde a una protena. Con esta
te
cnica se pueden separar varios miles de protenas en un
solo gel.
Teo
ricamente, esta tecnica servira para estimar el
nu
mero de protenas expresadas en la muestra en un
momento dado, pero realmente el nu
mero de spots
obtenidos so
lo reeja un porcentaje del total de protenas
expresadas. La extraccio
n proteica a partir del material de
partida no es total15.
A pesar de haberse introducido numerosas mejoras en la
te
cnica de 2-DE, esta au
n presenta algunas limitaciones:
solapamiento de protenas cuando sus cargas/pesos moleculares son muy pro
ximos, sensibilidad limitada, resolucio
n
deciente para protenas muy grandes o muy pequen
as y
alto consumo de tiempo. Para procedimientos automatizados, la reproducibilidad es alta. Sin embargo, para tecnicas
manuales la reproducibilidad es media y en ocasiones no
proporciona el objetivo deseado debido a las dicultades en
la preparacio
n de la muestra desde el material de partida
hasta que puede cargarse en el gel16,17.
Cuando interesa el ana
lisis cuantitativo de perles de
expresio
n de protenas, tanto el marcaje por uorescencia
(sistema DIGE [differential in gel electrophoresis]) como la

43
automatizacio
n resultan obligados: se utilizan esca
neres
para la obtencio
n de ima
genes de uorescencia de geles
2-DE, un robot para el cortado de manchas seleccionadas de
geles 2-DE y un software especializado para el ana
lisis
cuantitativo de diferencias.
Otra tecnica basada en la separacio
n de las protenas, la
LC, esta
cobrando cada vez ma
s importancia por su utilidad
cuando se quieren separar protenas pequen
as, y se utiliza
fundamentalmente para el aislamiento de peptidos. La LC es
un metodo fsico de separacio
n basado en la distribucio
n de
los componentes de una mezcla entre 2 fases inmiscibles:
una ja o estacionaria y otra mo
vil. La fase mo
vil es un
lquido que uye a traves de una columna que contiene la
fase estacionaria. La LC cla
sica se lleva a cabo en una
columna generalmente de vidrio, que esta
rellena con la
fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un so
lido
de diferentes propiedades qumicas; en funcio
n de estas,
resultan diferentes tipos de cromatografa (vease ma
s
adelante). La fase mo
vil puede ser un solvente puro o una
mezcla de solventes. Tras depositar la muestra en la parte
superior, se hace uir la fase mo
vil a traves de la columna
por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la
eciencia en las separaciones, el taman
o de las partculas de
la fase estacionaria se fue disminuyendo hasta el taman
o de
los micrones, lo que genero
la necesidad de utilizar altas
presiones para lograr que uyera la fase mo
vil. De esta
manera, nacio
la tecnica de HPLC, que, basa
ndose en
diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogra
ca, permite
separar los componentes de una mezcla14. Los tipos de
HPLC normalmente utilizados son los de fase normal, fase
reversa, de exclusio
n molecular, de intercambio io
nico y
basada en bioanidad. Las HPLC de fase normal y reversa
separan por polaridad; la de exclusio
n molecular, por
taman
o; la de intercambio io
nico, por polaridad, y la de
bioanidad, por la diferente capacidad de las sustancias
biolo
gicamente activas de formar complejos estables,
especcos y reversibles. Un desarrollo de reciente aparicio
n, altamente ventajoso, es la combinacio
n de la HPLC de
intercambio con la HPLC de fase reversa.
Otro desarrollo tambien reciente en la escala de trabajo
de la HPLC es la operatividad de sistemas de micro-HPLC y
HPLC con nanoujo (nano-HPLC), que exhiben sensibilidades
nunca observadas. La utilizacio
n de nano-HPLC permite la
separacio
n de peptidos antes de introducirlos hacia la
fuente de ionizacio
n as como la eliminacio
n de pequen
as
cantidades de contaminantes (sales, detergentes, etc.) que
intereren con el ana
lisis.
Ana
lisis espectrome
tricos
Incluyen los sistemas de EM o MS, que hacen uso de
procedimientos de ionizacio
n, como ESI (electrospray
ionization), MALDI (matrix asisted laser desorption/ionization) o SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization), y detectores/analizadores de masa tipo Q lineal, Q en
versio
n ION TRAP, TOF o hbridos.
Un sistema de MS realiza ba
sicamente 3 funciones:

Figura 1 Sistema de electroforesis bidimensional.

a) ionizacio
n de la muestra;
b) separacio
n de fragmentos o iones, y
c) deteccio
n/ana
lisis de los fragmentos o iones.

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44
Para realizar estas funciones, el espectro
metro de masas
cuenta con las siguientes partes: una fuente de ionizacio
n,
un analizador de masa/carga y un detector18.
Producir iones en fase gaseosa es fa
cil para compuestos
vola
tiles de bajo peso molecular; sin embargo, la aplicacio
n
de la MS en el campo de las protenas es relativamente
reciente. Esto se debe a la dicultad de obtener iones de
macromoleculas en fase gaseosa, dado que los peptidos y las
protenas son compuestos de baja volatilidad y alto peso
molecular. Por esto, es necesario el uso de tecnicas
especiales de ionizacio
n. Entre las distintas variantes de
estas fuentes de ionizacio
n, destacan por su aplicabilidad a
los peptidos y a las protenas la ionizacio
n por ESI y la
desorcio
n/ionizacio
n mediante la
ser segu
n variantes MALDI
o SELDI. Cabe resen
ar que el original fue MALDI (hoy
empleado para Proteo
mica de los tejidos con el nombre de
MALDI Imaging)23,24 y SELDI es una adaptacio
n para la
Proteo
mica clnica de uidos.
Las protenas separadas por los metodos del apartado
Ana
lisis preespectrometricos pueden analizarse mediante
MS segu
n los tratamientos siguientes:
En el ma
s comu
n, se recortan las protenas del gel
bidimensional donde se han aislado, se digieren con una
proteasa para producir un conjunto de peptidos y se
analizan subsiguientemente estos peptidos mediante MS
tipo MALDI-TOF (g. 2). Esta tecnica es particularmente u
til
para obtener el espectro de masas del conjunto de peptidos,
tambien denominada huella peptdica (peptide ngerprinting).
Alternativamente, los peptidos producidos tras un proceso de eliminacio
n de contaminantes se analizan mediante
MS tipo ESI en combinacio
n con un triple Q o una ION TRAP.
Estas tecnicas permiten el ana
lisis en tiempo real de
peptidos individuales presentes en la mezcla, sin necesidad
de separarlos del resto, que consiste en la fragmentacio
n del
peptido y la generacio
n de un espectro de masas, tambien
llamado espectro de fragmentacio
n o espectrofotometra de
masas en tandem (MS/MS).
Las huellas peptdicas son caractersticas de cada una de
las protenas, y permiten identicarlas una a una en la base
de datos mediante la utilizacio
n de tecnicas bioinforma
ticas, que constituyen las herramientas de la tercera
categora. De la misma manera, los espectros MS/MS son

Figura 2 Sistema Matrix Asisted Laser Desorption Ionizationtime of ight/espectrometra de masas (MALDI-TOF/MS) de
Brukers.

A.S. San Miguel Herna

ndez et al
tambien caractersticos de cada uno de los peptidos, y
permiten su identicacio
n in silico en la base de datos.
Ninguna de las 2 te
cnicas (huella peptdica o fragmentacio
n)
es de aplicabilidad universal, y cada una de ellas tiene sus
ventajas y sus inconvenientes. Sin embargo, la disponibilidad sinergica de ambas tecnicas hace de la MS una
formidable herramienta para la identicacio
n sistema
tica
de protenas.
En la MS, se esta
n comenzando a usar nuevos aparatos,
que se basan principalmente en la combinacio
n hbrida de
tecnicas ya conocidas. Como por ejemplo, se ha indicado en
pa
rrafos anteriores, los aparatos basados en la combinacio
n
de un doble Q y un TOF (qQ-TOF) mejoran sensiblemente la
resolucio
n de los espectros de fragmentacio
n, y la combinacio
n de la ionizacio
n MALDI con el analizador qQ-TOF o la
ION TRAP permite fragmentar peptidos directamente una
vez obtenida la huella peptdica.
La MS denominada MALDI-TOF/TOF conjuga todas las
ventajas de la espectrometra MALDI-TOF convencional con
la capacidad de producir espectros de fragmentacio
n de
peptidos de forma ra
pida y consistente. Esta tecnica esta

comenzando a utilizarse para la identicacio

n a gran escala
de protenas, pero su alto coste en el mercado ha limitado su
disponibilidad a pocos laboratorios.
Otras aproximaciones de la MS se basan en el acoplamiento de un sistema de LC bidimensional con un analizador
de ION TRAP o del tipo qQ-TOF. Este procedimiento, capaz
de identicar millares de peptidos en un solo experimento,
permite analizar de forma automa
tica los componentes de
mezclas muy complejas de peptidos, tales como las
producidas por la digestio
n directa de un proteoma. Esta
tecnica (tambien denominada shotgun proteomics) se ha
aplicado a la identicacio
n directa de componentes de
complejos macromoleculares e incluso al ana
lisis de
proteomas enteros sin necesidad de separar sus componentes mediante electroforesis.
Otra variante de esta metodologa permite realizar
estudios de expresio
n diferencial de protenas en el
proteoma sin necesidad de realizar 2-DE. Esta tecnica,
conocida como ICAT (isotope-coded afnity tag marcaje
isoto
pico diferencial), se basa en el uso de reactivos de
protenas en forma de iso
topos estables, que permiten
determinar la proporcio
n relativa de los peptidos derivados
de los proteomas por comparar. Al utilizar programas
informa
ticos desarrollados para este n, este procedimiento
permite la identicacio
n automa
tica y simulta
nea de
cambios relativos en las concentraciones de protenas y de
la naturaleza de las protenas que experimentan expresio
n
diferencial.
Finalmente, estas metodologas, en combinacio
n con
procedimientos de puricacio
n selectiva por anidad, han
permitido el ana
lisis de peptidos modicados, tales como
fosfopeptidos, a partir de proteomas completos, lo que ha
dado lugar al concepto de fosfoproteoma.

Posibilidades mu
ltiples de trabajo segu
n procedimientos
analticos combinados
Una protena puricada puede llevarse a MALDI-TOF o a ESIMS y hallar su masa molecular, se puede digerir y analizar su
huella peptdica o se puede analizar uno so
lo o varios
peptidos por fragmentacio
n hasta identicar positivamente

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Importancia de las aplicaciones clnicas de la Proteo

mica
e incluso elucidar sus modicaciones postraslacionales. A
efectos de cuanticacio
n, es de especial interes el sistema
AQUAs, con el concurso de peptidos sinteticos marcados
con iso
topos estables.
Una mezcla de protenas de cultivo, homogeneizado de
tejido o cualquier uido pueden llevarse a un gel-2D y
separar sus protenas. Ya puede actuarse sobre bases de
datos de geles para la identicacio
n o sobre los spots o las
relaciones de los uorocromos en el sistema DIGE para la
cuanticacio
n. Asimismo como se ha dicho anteriormente
se pueden recortar spots, digerirlos y llevarlos a MALDI-TOF
para la huella peptdica o a ESI-MS/MS para la secuenciacio
n,
por lo que ambas tecnicas pueden llegar a la identicacio
n
positiva.
Para procesar mezclas extraordinariamente complejas de
peptidos, se utilizan sistemas ICAT, con reactivos ligeros y
pesados, de las unidades cistena para subsiguientemente,
tras digestio
n y separacio
n por anidad, proceder a su
cuanticacio
n por MS. Tambien existe la posibilidad de que
estas muestras complejas se puedan digerir sin separar y
luego intentar resolverlas por cromatografa en una o 2
dimensiones (intercambio y fase reversa), y aislar peptidos
para secuenciarlos en micro-ESI-MS/MS y, si es posible, con
hbridos que permiten resolver peptidos mu
ltiplemente
cargados.
Tratamiento de espectros y bases de datos disponibles
De hecho, las estrategias descritas en apartados anteriores
son asistidas de softwares que enfrentan los espectros
obtenidos a bases de datos de gel, digestio
n, secuencia,
posmodicaciones, etc. con motores de bu
squeda muy
potentes. Otras combinan la informacio
n obtenida del paso
de ADN a posibles protenas con digestiones simuladas in
silico susceptibles de confrontacio
n con los espectros
obtenidos.
Entre los softwares de proteo
mica clnica ma
s utilizados se
encuentran los de ClinProt Tools para el estudio de perles y
el DeCyder para ana
lisis cuantitativo de diferencias.

45

Figura 3 Sistema de matrices de protenas. Cada celda

detectora en el array consta de 2 regiones detectoras
adyacentes para muestra y referencia.

bioqumicas particulares. En cuanto a los procesos de

amplicacio
n de la muestra, no existe una tecnica equivalente a la reaccio
n en cadena de la polimerasa en Geno
mica
que sea capaz de amplicar o multiplicar la cantidad de
protena existente en una muestra.
Por otra parte, el ADN posee una carga negativa que
puede utilizarse para inmovilizar la molecula sobre la
supercie del array mediante fuerzas electrostaticas. Por
el contrario, la carga de las protenas es muy variable y, por
este motivo, se han encontrado dicultades en la estandarizacio
n de materiales de soporte que sean adecuados para
cada tipo de microarray de protenas.
Hoy da, se cuenta con una nueva generacio
n qumica de
supercies de membrana y de vidrio, que no requieren del
empleo de agentes bloqueantes para eliminar el ruido de
fondo y que a la vez previenen el contacto directo de la
protena con la supercie. Con todo, la tecnologa de
microarrays de protenas au
n se encuentra ante dicultades
te
cnicas en cuanto a la adquisicio
n y a la unio
n estable de
protenas a supercies donde puedan interaccionar con otras
protenas o ligandos y detectarse tal interaccio
n21,22.

Matrices de protenas
Las matrices, arrays o biochips de protenas (g. 3) permiten
la deteccio
n, la caracterizacio
n y la cuanticacio
n proteica,
as como el estudio de las cualidades funcionales de las
protenas y sus interacciones, tanto entre ellas como con
moleculas de ADN o lpidos. Un ejemplo son los arrays de
anticuerpos, que permiten estudiar la expresio
n de un
elevado nu
mero de protenas en una sola matriz. Esta
te
cnica consiste en jar anticuerpos a una supercie so
lida,
de manera ordenada, y localizada a modo de puntos (spots)
distribuidos en 2 ejes. A continuacio
n se pone en contacto la
muestra objeto de estudio (p. ej., un lisado celular) con la
matriz, con lo que se consigue el reconocimiento y la unio
n
especca protena-anticuerpo. De modo ana
logo, se puede
unir al array otro tipo de moleculas19,20.
La complejidad y la diversidad estructural proteicas han
hecho que el desarrollo de los microarrays de protenas haya
sido tecnicamente complicado.
Al contrario que los a
cidos nucleicos, las protenas no
tienen una estructura homogenea ni un patro
n de unio
n
especco, sino que cada protena posee unas caractersticas

Aplicaciones de la Bioinforma
tica
Otra de las ciencias aplicadas al estudio de la Proteo
mica es
la Bioinforma
tica, que se podra denir como el conjunto de
herramientas para el procesamiento y la interpretacio
n de
los datos obtenidos con cualquiera de las tecnicas anteriormente expuestas u otras. As, las herramientas bioinforma
ticas permiten identicar una protena en una base de
datos a partir de su huella peptdica (que es especca para
cada protena) o de su espectro MS/MS (que tambien es
especco de cada uno de los peptidos que forman parte de
una protena)23.
Pese a los avances en proteo
mica, muchas propiedades de
las protenas, sobre todo sus interacciones y sus modicaciones postraduccionales, no pueden, en general, predecirse
a partir de la secuencia de ADN. En un proyecto reciente de
particular interes, se ha efectuado un estudio a gran escala
de las interacciones entre protenas en levadura, que ha
dado lugar a la construccio
n de un mapa de interacciones1.
La evidente complejidad de este mapa indica que la

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funcionalidad de las protenas no debe considerarse de
forma aislada, sino dentro de una red global de componentes que interactu
an mutuamente.
Se esta
n desarrollando tecnicas bioinforma
ticas capaces
de interpretar el signicado de esta compleja red de
interacciones y, por otra parte, esta metodologa no puede
todava aplicarse a celulas eucariotas, es decir, celulas de
los organismos superiores. Sin embargo, este trabajo
pionero indica que en un futuro pro
ximo la Proteo
mica nos
permitira
analizar las propiedades de sistemas complejos de
protenas desde una perspectiva global e integradora.
Resultara
n apasionantes los resultados que se deriven de
aplicar esta estrategia experimental al estudio de procesos
celulares de alta complejidad, tales como las cascadas de
transduccio
n de sen
ales, la diferenciacio
n celular, la
degeneracio
n neuronal, la apoptosis o el ca
ncer.
Una de las asignaturas pendientes de la Proteo
mica es
que, en su concepcio
n actual, no puede aplicarse de forma
efectiva al estudio de componentes de microorganismos o
especies de interes en Biotecnologa o Tecnologa de
Alimentos, cuyas protenas no esta
n sucientemente representadas en las bases de datos. El desarrollo de nuevos
algoritmos informa
ticos capaces de interpretar de forma
inteligente la informacio
n generada por la MS permitira
en
un futuro pro
ximo aplicar la Proteo
mica al estudio de estas
especies.
Estos nuevos desarrollos bioinforma
ticos podran tambien
aplicarse al estudio sistema
tico de modicaciones postraduccionales. Estas tecnicas, en combinacio
n con los metodos
de LC bidimensional, podran abrir el camino al estudio de
modicaciones postraduccionales a gran escala y de forma
dina
mica, y a la manera como estas modulan, desde una
perspectiva global, el control de la inmensa mayora de los
procesos celulares.
Existe un gran nu
mero de protenas y de nuevos genes
descubiertos, de los que no se dispone au
n de informacio
n
acerca de su funcio
n. Los metodos de prediccio
n de las
funciones proteicas constituyen un apoyo teo
rico importante en el estudio de estas macromoleculas, tanto por la
informacio
n que proporcionan como por la utilidad que
pueden tener en el disen
o de peptidos especcos y la
prospeccio
n de nuevas funciones. Estos me
todos de prediccio
n de funciones proteicas son probabilsticos, por lo que
dependen de la cantidad de datos o la informacio
n
disponible en un principio; en otras palabras, del taman
o
de la muestra por analizar. Por otra parte, el procedimiento
que suele utilizarse para realizar predicciones es la
comparacio
n con datos de naturaleza semejante. Aqu
tambien es, por tanto, importante el taman
o de la poblacio
n
de referencia, que se trata del volumen de datos con los que
se va a comparar la muestra. A este respecto, las
poblaciones de referencia son las actuales bases de datos
disponibles sobre secuencias moleculares, estructuras secundarias y terciarias, homologa total o parcial de genes y
protenas y un amplio etcetera24.
La mnima informacio
n que ha de tenerse de una protena
para poder predecir su funcio
n es un fragmento representativo de su secuencia aminoacdica. De esta forma, al menos,
se puede llevar a cabo un ana
lisis a nivel de secuencia. Si
adema
s se dispone de la informacio
n estructural, del
conocimiento de su naturaleza io
nica, de los efectos
mutacionales sobre su funcio
n, de la localizacio
n de la

A.S. San Miguel Herna

ndez et al
protena en la ce
lula o en el organismo o de las interacciones
con otras protenas (es decir, de su contexto), podra
n
abordarse tambien otros aspectos analticos que faciliten el
objetivo de la prediccio
n, que es la determinacio
n precisa
de su funcio
n25.

Proteo
mica en estudios de biomedicina
La perspectiva ofrecida por la Proteo
mica se ha utilizado en
estudios de investigacio
n de diferentes a
reas de la Medicina,
incluida la Biomedicina. Estos estudios podran clasicarse
de distintas formas: en funcio
n del tipo de muestra
empleada, de la enfermedad o el tipo de enfermedades
que abordan, de la tecnica o las te
cnicas utilizadas, del uso
o la aplicacio
n de estas, etc.
Esto se orientara
en torno al eje de clasicacio
n segu
n el
tipo de muestra empleado. Sobre la base de ella, cabe
destacar la investigacio
n con lneas celulares, con tejidos
so
lidos y la Proteo
mica de uidos.
Las lneas celulares son variantes derivadas de las celulas
cancerosas o las celulas normales inmortalizadas mediante
la inhibicio
n de los mecanismos celulares causantes de la
interrupcio
n del crecimiento. A diferencia de la mayora de
las celulas aisladas directamente de los organismos, estas
celulas son capaces de dividirse indenidamente cuando se
mantienen cultivadas en el laboratorio.
En la investigacio
n con lneas celulares, las te
cnicas
proteo
micas se han utilizado para caracterizar los perles
de expresio
n proteica en diferentes tipos de estas lneas
como base para futuros experimentos comparativos26,27.
Estos estudios han mostrado que el nu
mero de protenas
identicadas en cada proteoma vara de forma importante,
lo que probablemente sea el reejo de la existencia de
diferencias en el rango de expresio
n de las distintas
protenas en cada lnea celular28.
Las lneas celulares tumorales humanas pueden constituir
modelos va
lidos para el estudio del ca
ncer. De este modo, los
estudios que comparan los proteomas de diversas lneas
tumorales humanas (o ce
lulas obtenidas directamente de un
tumor) con sus correspondientes lneas celulares normales
(o tejido sano) comienzan a ser habituales para identicar
marcadores de enfermedad o biomarcadores que permitan la
deteccio
n precoz, la clasicacio
n y la prediccio
n del prono
stico
de los tumores as como para proponer nuevas dianas
potenciales o dianas terapeuticas para mejorar su tratamiento.
Por consiguiente, se pueden realizar estudios proteo
micos
dirigidos a evaluar el potencial maligno de un tumor
(potencial metasta
sico segu
n exprese una protena especca o no), la quimiosensibilidad o la quimiorresistencia de
este, etc29. El uso de la Proteo
mica para el disen
o, la
indicacio
n y la prediccio
n de respuesta a un fa
rmaco o a
fa
rmacos sera tambie
n extrapolable a otras enfermedades;
es lo que conocemos como farmacoproteo
mica30,31.
Por otra parte, las lneas celulares se han utilizado
cla
sicamente para conocer los mecanismos adaptativos a
distintos tipos de estres. El desarrollo de la Proteo
mica ha
encontrado una clara aplicacio
n en estos estudios, ya que
estas lneas celulares permiten la identicacio
n de nuevas
protenas no relacionadas hasta el momento con el
establecimiento de un fenotipo resistente a las condiciones
que provocan el estres celular32.

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Importancia de las aplicaciones clnicas de la Proteo

mica
Adema
s de los estudios en lneas celulares humanas
descritos, las tecnicas proteo
micas se han aplicado recientemente en el ana
lisis de tejidos so
lidos y de uidos para el
estudio de situaciones siolo
gicas (durante el desarrollo, en
distintos estados metabo
licos, frente a diversas condiciones
ambientales) o patolo
gicas (ca
ncer, autoinmunidad, infecciones, etc.)3,4. Estos estudios con tejidos o uidos se han
empleado con objetivos similares a los estudios con lneas
celulares (identicacio
n de biomarcadores, bu
squeda de
dianas terapeuticas, farmacoproteo
mica, etc.).
La utilizacio
n de tejidos so
lidos en estudios de Proteo
mica
presenta, lo
gicamente, el inconveniente de la mayor
dicultad de acceso a las muestras.
No obstante, la informacio
n obtenida en estos puede ser
determinante y, a veces, no existe mejor alternativa a la
utilizacio
n de muestras tisulares so
lidas33. Tal puede ser el
caso del estudio de mutaciones selectivas que alteren el
proteoma de un tejido a nivel local, que no son detectables
en otros compartimentos del organismo.
Adema
s, los estudios realizados con tecnicas de Proteo
mica que emplean muestras tisulares pueden completarse
con la utilizacio
n de otros metodos. Tal sera el caso del
empleo de western blot para estudiar la presencia de
autoanticuerpos en suero a partir del proteoma obtenido de
celulas tumorales. La caracterizacio
n de un conjunto
determinado de autoanticuerpos, caracterstico de cada
tumor, puede ser de gran valor, ya que podra ayudar al
diagno
stico precoz en pacientes de riesgo34,35.
En cuanto a la Proteo
mica de uidos, cabe resen
ar que ha
supuesto un hito considerable en el a
mbito de la investigacio
n clnica por la mayor facilidad de obtencio
n y procesamiento de las muestras. De entre ellas, cabe destacar el
plasma y el suero por su accesibilidad. La aplicacio
n de
te
cnicas proteo
micas a estas muestras se ha utilizado para el
estudio de enfermedades muy diversas (neopla
sicas, reuma
ticas, endocrinolo
gicas, toxicolo
gicas, etc.)3,4,3648.
Otro ejemplo de Proteo
mica de uidos, aunque la
muestra es de ma
s difcil obtencio
n, es el ana
lisis del
proteoma del lquido cefalorraqudeo. Este se ha empleado
recientemente en el estudio de las bases etiopatogenicas y
la identicacio
n de biomarcadores de enfermedades neurolo
gicas, como trastornos neuropsiquia
tricos, tumores cerebrales y sndromes dolorosos lumbares41,42.

Conclusio
n
El objetivo de la Proteo
mica en clnica es comparar, a nivel
molecular, el estado proteico celular en situaciones normales y patolo
gicas. Esta comparacio
n se concreta, en unos y
otros casos, en identicar las protenas que hay presentes,
determinar su proporcio
n, dilucidar en que
procesos
biolo
gicos participan y averiguar co
mo interactu
an entre
s. Las aplicaciones biome
dicas resultan inminentes en: el
disen
o de fa
rmacos que actu
en directa y selectivamente
sobre las protenas implicadas en una enfermedad.

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