CLOROPLASTO

Objetivos:
Obtencin de una fraccin subcelular enriquecida en cloroplastos.
Identificacin de cloroplastos en dicha fraccin.
Introduccin
En algas y plantas superiores, la fotosntesis ocurre en el cloroplasto. Este organelo
posee, al igual que la mitocondria, una envoltura compuesta de dos membranas, una
externa y una interna, pero adems posee un tercer sistema de membrana, la membrana
tilacoidal. Esta membrana forma pequeos sacos aplanados, denominados tilacoides,
cuyo lumen es el espacio tilacoidal. Los tilacoides se apilan, formando bloques
denominados grana (cada bloque en singular es un granum). Los grana estn
interconectados por regiones de la membrana tilacoidal alargadas, denominadas
laminillas del estroma, cuyo lumen es continuo con el espacio tilacoidal. El estroma es el
espacio interno del cloroplasto que queda por fuera de la membrana tilacoidal.
La fotosntesis es un complejo proceso en el cual la energa de la luz se usa para generar
energa qumica en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH, que se usan a su
vez para convertir el CO2 del aire en carbohidratos, liberndose paralelamente O2 a partir
de agua (en plantas, algas y algunas bacterias). La reaccin global de la fotosntesis es:
6 CO2 + 6 H2O

6 O2 + C6H12O6

En la fotosntesis se diferencian dos etapas, con dos tipos de reacciones:

-

Fase luminosa: en el tilacoide en ella se producen transferencias de electrones.

Fase oscura: en el estroma. En ella se realiza la fijacin de carbono

Las reacciones de la fotosntesis pueden agruparse en dos clases, las reacciones

fotoqumicas, que ocurren en la membrana tilacoidal y en las que se generan ATP y
NADPH, y las reacciones bioqumicas, que comienzan en el estroma del cloroplasto y
continan en el citosol, en las que el CO2 es convertido en carbohidratos.
Las reacciones fotoqumicas, mediante las que se obtiene ATP y NADPH. Constituyen un
proceso de dos fases, denominado fotofosforilacin no cclica, para distinguirlo de otro
proceso, la fotofosforilacin cclica, en el que solo se genera ATP. En la primera fase de la
fotofosforilacin no cclica, la absorcin de luz por el fotosistema II le permite remover
electrones provenientes del agua y transferirlos a una cadena de transporte, hasta llegar
al fotosistema I. All, una nueva absorcin de luz confiere suficiente energa a los
electrones para poder reducir a su aceptor final, el NADP+, formando NADPH.
Los fotosistemas son complejos formados por varios polipptidos y distintos tipos de
pigmentos, y en ellos la luz absorbida se utiliza para excitar a un electrn en una molcula
de clorofila particular. En el fotosistema II, este electrn es transferido a la plastoquinona,
una pequea molcula anloga a la coenzima Q de la fosforilacin oxidativa. Cada
electrn transferido por el fotosistema II se repone con uno proveniente del agua, en una
compleja reaccin cuyo resultado final es la liberacin de O2 a partir de agua. La
plastoquinona transfiere electrones al complejo b6-f, anlogo al complejo b-c1 de la
mitocondria, el cual bombea protones dentro del espacio tilacoidal. La plastocianina, una

pequea protena que contiene un tomo de cobre que vara de estado de oxidacin,
transporta electrones desde el complejo b6-f hasta el fotosistema I. All, la absorcin de un
fotn aumenta la energa de estos electrones, que pueden reducir a la ferredoxina, una
pequea protena con un grupo prosttico que contiene hierro y azufre. Esta a su vez
transfiere los electrones al NADP+, en una reaccin catalizada por la enzima NADP
reductasa.
Adems de generar NADPH, este proceso de transporte de electrones provoca la
acumulacin de protones en el espacio tilacoidal, con la consecuente generacin de un
gradiente electroqumico a travs de la membrana tilacoidal, el cual es usado para
sintetizar ATP.
En 1937, Robert Hill descubri que cuando cloroplastos aislados son iluminados en
ausencia de CO2, son capaces de reducir un aceptor artificial, liberando O2
paralelamente.
Este resultado fue una de las primeras demostraciones de que el CO2 no participa
directamente en el proceso que produce O2, y puede resumirse en la siguiente reaccin
qumica, denominada reaccin de Hill:
H2O + A AH2 + O2 luz, cloroplastos
Bioenergtica en los sistemas
La bioenergtica describe la transferencia y utilizacin de la energa en los sistemas
biolgicos. Utiliza las ideas bsicas de la termodinmica, particularmente el concepto de
energa libre. Los cambios en la energa libre (DG) proveen una cuantificacin de la
factibilidad energtica de una reaccin qumica y pueden proveer de una prediccin de si
la reaccin podr suceder o no.
La bioenergtica se interesa slo por los estados energticos inicial y final de los
componentes de una reaccin, no del mecanismo o del tiempo necesarios para que el
cambio qumico se lleve a cabo. La bioenergtica predice si un proceso es posible; la
cintica cuantifica qu tan rpido ocurre la reaccin.
Energa libre
La direccin y cantidad a la cual procede una reaccin est determinada por el grado
energa libre que dos factores cambian durante la reaccin. Estos factores son la entalpa
(DH, una medida del cambio de calor entre los reactivos y productos de la reaccin) y la
entropa (DS, una medida del cambio en el desorden de los reactivos y productos)
Capacidad de reductora de los cloroplastos
Energa y capacidad reductora, ambas necesarias para la conversin del CO 2 en hidratos
de carbono, se generan en la etapa luminosa, en la que la absorcin de luz y la escisin
del H2O dan lugar a una sustancia reductora, el NADPH, y otra que provee energa, el
ATP. Ambos compuestos son utilizados durante la etapa sinttica de la fotosntesis.
Para identificar cloroplastos en una fraccin subcelular, pondremos en evidencia la
Reaccin de Hill, usando como aceptor artificial de electrones al 2,6-diclorofenolindofenol
(DCPIP), el cual oxidado tiene un color azul y absorbe mximamente a 600 nm, mientras
que reducido es incoloro.

La fotosntesis es una funcin biolgica fundamental en las plantas, ya que, por medio de
la clorofila contenida en los cloroplastos, las plantas son capaces de absorber la energa
que la luz solar emite como fotones y la transforma en energa qumica. El colorante es un
aceptor artificial de electrones que cambia de color mientras se reduce, es azul en su
forma oxidada y descolorida en su forma reducida. El 2,6 diclorofenolindofenol es la
fotoreduccin de un aceptor del electrn por los hidrgenos del agua, con la evolucin del
oxigeno.
Una suspensin de cloroplastos aislados puede desprender O2 en presencia de luz, si se
suministra un compuesto oxidado capaz de aceptar electrones procedentes de la fotolisis
del agua. De esta forma, el proceso de desprendimiento de O2 en la fotosntesis puede
ser separado del de la fijacin de CO2. En la hoja intacta, los principales aceptores
naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, pero se inactivan durante el proceso
aislamiento de los cloroplastos. En varios de los experimentos in vitro, estos aceptores
naturales pueden sustituirse por 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Este compuesto es
azul intenso en su forma oxidada (quinona) pero se decolora lentamente cuando adquiere
su forma reducida (fenol). La reaccin que tiene lugar es la siguiente:
Luz Cloroplastos + DCPIP+(azul intenso)+ H 2O
Cloroplastos + DCPIP-H (azul plido) + O 2
La evaluacin de la actividad fotosinttica en condiciones in vitro, ha sido una tarea difcil
debido a las alteraciones estructurales y funcionales que sufren los cloroplastos y a la
presencia de fracciones celulares contaminantes durante el proceso de aislamiento.
La clave la dio un descubrimiento realizado en 1937 por Robert Hill, que demostr que
cuando se exponen a la luz extractos de hoja que contienen cloroplastos en presencia de
un aceptor de hidrgeno (A) se desprende oxgeno, al tiempo que tiene lugar la reduccin
simultnea del aceptor de hidrgeno, segn una ecuacin actualmente conocida como
reaccin de Hill.

2 H2O + 2 A

2 AH2 + O2

El aceptor de hidrgeno utilizado por Hill fue el diclorofenolindofenol, que en su forma

oxidada es azul y en su forma reducida es incolora. Cuando se iluminaba el recipiente con
la mezcla de reaccin, el colorante se decoloraba y se formaban burbujas de oxgeno. En
la oscuridad no haba reaccin. Hill tambin demostr que la presencia de CO 2 no es
necesaria para que la reaccin tenga lugar y que si est presente no es afectado en la
reaccin, concluyendo que la produccin de oxgeno poda disociarse de la reduccin del
CO2. Algunos aos ms tarde se encontr que el aceptor universal en las plantas es el
NADP+, un anlogo fosforilado del NAD+:

2 H2O + 2 NADP+

2 NADPH + 2 H+ + O2

En la fotosntesis, los electrones fluyen desde el agua hacia el NADP + , en tanto que en la
fosforilacin oxidativa que ocurre en la cadena respiratoria que tiene lugar en las
mitocondrias sucede lo contrario: los electrones pasan del NADH al O 2, con formacin de
agua. Puesto que el flujo electrnico inducido por la luz va cuesta arriba no puede
transcurrir sin aporte de energa. Esta energa proviene de la luz.
La absorcin de luz excita las molculas
La luz es una pequea parte de un gran espectro de radiacin, el espectro
electromagntico. Todas las radiaciones de dicho espectro viajan a travs de ondas. En
un extremo del espectro se encuentran los rayos gamma, cuya longitud de onda es muy
corta (menor de un nanmetro). La longitud de onda es la distancia que existe entre la
cresta de una onda y la de la siguiente. En otro extremo del espectro se encuentran las
ondas de radiacin de baja frecuencia, cuya longitud de onda es tan grande que puede
medirse en kilmetros.
Los diferentes colores de la luz (distintas regiones del espectro de luz) se identifican
mediante sus longitudes de onda. Dentro del espectro de la luz visible el color violeta
corresponde a la longitud de onda ms corta y el rojo a la longitud de onda ms larga. La
luz ultravioleta tiene una longitud de onda an ms pequea y el infrarrojo una longitud de
onda incluso mayor. La luz no slo se comporta como una onda, sino tambin como una
partcula.
Resultados esperados
La reduccin de la absorbancia de la cubeta iluminada se deber a la reduccin del
DCPIP y esto a su vez estar directamente relacionado con la tasa fotosinttica de la
suspensin de cloroplastos. El transporte de electrones y los equivalentes reductivos en
los fotosistemas de los cloroplastos, provocan que el DCPIP oxidado (azul intenso) al
aceptar electrones procedentes de la fotlisis del agua, se convierta en DCPIP reducido
(azul claro). A menudo el DCPIP, se utiliza en las mediciones de la cadena de transporte
de electrones en los cloroplastos debido a su mayor afinidad por los electrones que la
ferredoxina.
CONCLUSIONES
Por medio de la prctica logramos aislar los cloroplastos en una muestra que fue hojas de
espinaca mediante la tcnica de centrifugacin diferencial, una vez aislada procedimos a
realizar el experimento sobre la capacidad reductora de los cloroplastos usando 2, 6
diclorofenolindofenol usndolo como blanco para comparar nuestras muestras las cuales
fueron expuestas a 3 condiciones de luz distintas: Con luz natural, luz artificial y sin luz
tapndolas con papel aluminio. Pasado el tiempo de espera que fueron 20 min
comparamos los blancos con las muestra y observamos un agrupamiento de partculas en
nuestros tubos que previamente tenan agregada una capa de aceite vegetal, esto es para
dejar sin oxigeno a las muestras as que lo que observamos nos indica que aun sin la
presencia de oxigeno los cloroplastos cumplen su funcin de produccin de oxgeno

mediante la reduccin del CO2. Por lo que podemos decir que los objetivos planteados al
inicio de la practica se cumplieron al aislar nuestra muestra de cloroplastos y al poder
observar la capacidad de reduccin de estos con o sin presencia de oxigeno.

BIBLIOGRAFIA
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Kard, G.(2005) Biologa Celular y Molecular. Edit.
Mc Graw Hill, Mexico.
Lehninger, A.L. (1993) Principios de Bioqumica, Ediciones Omega, Barcelona, 2a
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Solomon, E.P (1996) Biologa 3ra. Edicin (traducido de la tercera edicin inglesa,
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Streyer, Lubert (1990) Bioqumica, Editorial Revert, Barcelona, 3ra edicion