LABORATORIO DE MICOLOGIA

Dra. Teresa Lobos Miranda

Profesor Adjunto (Asociado), Departamento de Medicina Interna

Segn los tejidos comprometidos, las micosis se clasifican en:

Superficiales, que afectan piel y fanreos. .

Profundas, que comprometen tejido subcutneo, osteoarticular y visceral. Estas

ltimas pueden ser producidas por hongos patgenos (Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis, etctera) o por hongos oportunistas, que son inofensivos
en el husped inmunocompetente, pero que actan como patgenos en el
inmunocomprometido.

En los ltimos aos se ha observado un aumento importante de micosis oportunistas

debido a la expansin de la poblacin de pacientes inmunocomprometidos. Adems de
las infecciones fngicas oportunista clsicas, como candidiasis, criptococosis,
aspergilosis y mucormicosis, han emergido micosis por otros hongos que hasta hace
poco tiempo se consideraban simples contaminantes, como por ejemplo Fusarium,
Trichosporon, Malassezia, etctera. Esto ha obligado a los microbilogos a
familiarizarse con la morfologa macro y microscpica de estos agentes, ya que el
diagnstico micolgico es eminentemente morfolgico, especialmente en hongos
filamentosos.
Las tcnicas bsicas de Bacteriologa (aislamiento, identificacin morfolgica y
bioqumica) son, en general aplicables a las levaduras de importancia mdica (gneros:
Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula.Pityrosporum y Torolopsis). No
obstante, hay diferencias con respecto a las bacterias que es necesario destacar. El
perodo de generacin es ms largo, por lo tanto debe mantenerse en incubacin durante
un tiempo prolongado. Los demartofitos, por ejemplo, pueden demorar hasta 4 semanas.
Los hongos oportunistas, en cambio, son de desarrollo ms o menos rpido, como por
ejemplo Mcorales 24-48 horas, Apergillus 48-72 horas; Crytococcus 48-72 horas.
El diagnstico de laboratorio de las infecciones fngicas requiere:.

Presuncin diagnstica por parte de los clnicos.

Apropiada recoleccin de muestras.

Procedimientos especiales de Laboratorio.

El estudio micolgico consta de:

1. Observacin directa al fresco con lquidos clarificantes (KOH 10-20%,

lactofenol) para pesquisa de levaduras e hifas.
2. Cultivos de hongos en agar Sabouraud glucosado, con sin antibiticos, con y sin
ciclohexamida, en que se consideran tiempo de desarrollo, caractersticas
macroscpicas y microscpicas (hifas y esporas), estudios de fermentacin
(zimograma) y utilizacin de carbono (auxonograma).
3. Estudio histolgico:biopsias con tinciones especiales, como Gomori Grocott
(impregnacin argntica).
4. Inmunodiagnstico.
o Deteccin de antgenos capsulares, de pared fngica, etctera; son
pruebas sensibles y una buena alternativa frente a cultivos que requieren
perodos de incubacin prolongados.
o Deteccin de anticuerpos:IgG, IgM con tcnicas de inmunodifusin o
con tcnicas de anticuerpos marcados: ELISA e inmunofluorescencia.
5. Tcnicas de biologa molecular: hibridacin de ADN, PCR,, etctera.
Las micosis que se observan con mayor frecuencia en nuestro medio son, entre las
micosis superficiales, pitiriasis versicolor y dermatofitosis y, entre las profundas
oportunistas, candidiasis, criptococosis, aspergilosis y mucormicosis. A continuacin se
revisar el diagnstico micolgico de stas.

PITIRIASIS VERSICOLOR
Se caracteriza por mculas descamativas de aspecto farinceo hiper o hipocromas,
localizadas de preferencia en el tronco.
El agente etiolgico es Malassezia furfur y el diagnstico se hace mediante examen
directo, que muestra grupo de levaduras de doble pared y filamentos cortos. Los
cultivos deben efectuarse en medios con aceite vegetal para obtener la forma cultivable
de M furfur, que es una levadura lipoflica (Pytirosporum).

DERMATOFITOSIS
Son lesiones de la piel y fanreos producidas por dermatofitos (Trichophyton,
Microscoporum y Epidermophyton), que son hongos filamentosos, septados y
ramificados que tienen gran afinidad por la queratina de la capa crnea de la piel y
fnereos.
En la piel, la muestra debe ser abundante, obtenida de las zonas perifricas de la lesin
que son los sitios activos, previa limpieza de la superficie cutnea para disminuir la

contaminacin bacteriana. Es importante suspender los tratamientos antifngicos que

pudieran estarse efectuando: locales 4-5 das, generales 2-3 semanas.
Las tias del cuero cabelludo, requieren la extraccin de 5 o ms pelos, los cuales deben
ser cortados aproximadamente a 1-2 cm de la base. Adems es necesario raspar las
escamas de la placa mictica. Es necesario consignar en la orden antecedentes como
edad, contacto con animales, tiempo de evolucin de la lesin, ubicacin geogrfica y
tratamientos previos.
El diagnstico de laboratorio se efecta mediante examen directo con lquidos
clarificantes (KOH al 10-20% o lactofenol) que muestra filamentos septados.
Es importante la realizacin de cultivos, porque es el nico mtodo que permite llegar a
diagnstico del agente, lo que conlleva la deteccin de reservorios y duracin de terapia
antimictica. Los cultivos se efectan en medio de Sabouraud con gentamicina o
cloramfenicol , que eliminan la contaminacin bacteriana, y ciclohexamida, que inhibe
los hongos contaminantes. La incubacin debe efectuarse durante 4 semanas, ya que los
dermatofitos son de lento desarrollo.
La identificacin se basa en velocidad de crecimiento y en las caractersticas
macroscpicas de las colonia: forma, aspecto de la superficie, textura color, produccin
de pigmentos difusibles, as como por las caractersticas microscpicas de hifas y
esporas.

CANDIDIASIS
Son infecciones producidas por levaduras del gnero Candida. La especie ms
frecuentemente aislada de muestras clnicas es Candida albicans; otras especies son
Candida krusei, C. guillermondii, etctera.
La candidiasis se presenta bajo diversas formas clnicas, como digestiva, neumonas,
fungemias, endocarditis. Merece consideracin especial la llamada candidiasis invasiva,
definida como invasin de varios rganos viscerales por diseminacin hematgena, que
no tiene un cuadro clnicamente caracterstico .
Los cultivos de mucosas no son especficos, porque frecuentemente Candida albicans es
aislada de mucosa digestiva de sujetos sanos.
Los hemocultivos tienen baja sensibilidad diagnstica (20-30%) y muchas veces son
positivos tardamente, dificultando el manejo del paciente. Adems, los pacientes
inmunocompetentes con catteres pueden presentar candidemias transitorias, sin
significado patolgico,lo que hace que los hemocultivos sean poco especficos para
candidiasis invasiva en estas condiciones. No obstante, es necesario destacar que en
pacientes neutrpenicos una candidemia se relaciona en ms del 90% a candidiasis
invasiva; a su vez el 50% de pacientes neutropnicos tienen hemocultivos falsos
negativos.

Otro aspecto importante es el lento crecimiento de cndidas en los hemocultivos

convencionales, lo que determina la positividad de stos sea reconocida tardamente
durante el curso clnico. Otras tcnicas, como lisiscentrifugacin, aumentan el nmero
de aislamientos y bajan el tiempo requerido para la deteccin de hemocultivos positivos.
Actualmente se cuenta con mtodos automatizados, radiomtricos y colorimtricos. No
obstante, los hemocultivos de hongos estndar pueden ser perfeccionados por
ventilacin de los frascos, tomando precauciones para evitar su contaminacin.
Para detectar candiduria como ndice de compromiso hematgeno renal, en pacientes
sin catter urinario, necesario una recoleccin cuidadosa de una muestra de orina de
segunda miccin. Esto es especialmente importante en mujeres, en que puede
observarse contaminacin vaginal con Candia . Se considera positivo un recuento de
mayor o igual a 10 en dos muestras sucesivas de orina. Los cultivos de catteres deben
hacerse con tcnica semicuantitativa de Maki concomitantemente con cultivo de sangre
aspirada a travs de catter y cultivos de sangre perifrica, en lo posible con
cuantificacin de levaduras. Adems de los cultivos, es necesario consignar, en los
exmenes directos, si hay o no filamentacin de las levaduras.
Se han hecho grandes esfuerzos para mejorar el inmunodiagnstico de Candidiasis, en
especial la deteccin de antgenos, cuyos resultados han sido controversiales. A
continuacin se revisan los antgenos de Candida determinados en laboratorios
asistenciales.
Antgeno manana. Es el antgeno de superficie de Candida ms abundante.El mtodo
usado para su deteccin es aglutinacin por ltex, que tiene una sensibilidad entre 47 y
99%, y una especificidad de 95%, lo que significa que hay pocos pacientes que
muestran antgeno manana y estn slo colonizados o con candidiasis superficial.
La sensibilidad es variables, porque en muchos pacientes la manana circula a
concentraciones que van entre 1-10 ng/ml, lo cal est en el lmite de deteccin por
tcnica de ltex.Adems, la antigenemia puede darse intermitentemente en infecciones
graves, por lo que se requiere de mltiples muestras.
Antgeno proteico termolbil. Es un antgeno no bien caracterizado, probablemente
una glicoprotena. Existe un test comercial disponible que emplea aglutinacin de ltex
(Cand-Tec), que es fcil de realizar, pero requiere cuantificacin, ya que ttulos de 1:2
1:4 podran indicar slo colonizacin, mientras que ttulos iguales o mayores de 1:8 son
sugerentes de candidiasis invasiva, aunque no existe una correlacin absoluta entre
ttulos y candidiasis invasiva.
Antgeno proteico termoestable citoplstico, Enolasa. Es producida por todas las
especies de cndida y es un marcador de invasin tisular profunda, detectable incluso en
ausencia de candidemia. Se aconseja tomar muestras seriadas para maximizar su
deteccin. Empleando como goldstandard hemocultivos o biopsia de tejidos profundos,
la sensibilidad es de 75% y la especificidasd de 96%.
Determinacin de metabolitos: Se detecta arabinitol y manosa, en suero mediante
tcnica de cromatografa gaseosa. Es empleado slo en laboratorios de referencia.

Determinacin de anticuerpos (somticos y metablicos). Se ha empleado una

amplia variedad de tcnicas. La determinacin de precipitinas anti-Candida por
contrainmunoelectroforesis tiene una especificidad 85% y una sensibilidad mayor de
80% en pacientes con respuesta inmuneintacta; en cambio, en pacientes
inmunocomprometidos los falsos negativos varan entre 27 y 70%, lo que se debe a la
incapacidad de estos pacientes para producir anticuerpos, as como a que la deteccin
suele efectuarse demasiado precozmente (menos de 10 das de iniciada la infeccin), a
lo cual se agrega el hecho de que generalmente no se conoce el inicio y duracin de la
infeccin, Los falsos positivos se deben a la limitada capacidad para discriminar entre
colonizacin e invasin tisular profunda.
Estudio histolgico. Es empleado en el diagnstico de candidiasis invasiva, pero su
utilidad es limitada, debido a que se necesitan mtodos invasivos para recolectar
muestras, que muchas veces estn contraindicados en estos pacientes debido a la
gravedad de la enfermedad de base.

CRIPTOCOCOSIS
Es una infeccin generalmente subaguda, cuyo agente causal es una levadura capsulada,
Crytococcus neoformans, que se presenta clnicamente como neumona o, ms
frecuentemente, como meningoencefalitis. El diagnstico de laboratorio se efecta
mediante estudio micolgico, que comprende examen directo al fresco con tinta china,
que permite visualizar las levaduras capsuladas. Adems, se emplean cultivos en medio
de Sabouraud sin ciclohexamida. Se observa desarrollo de levaduras a las 48-72 horas;
son mucosas brillantes, ocres y generalmente ureasa positivas. Tambin es posible
confirmar el diagnstico mediante estudios histolgicos de biopsias, con tinciones
especiales de azul de toluidina, impregnacin argntica, etctera.
Deteccin de antgenos. La cpsula polisacrida consiste en glucoraxilmanana y
galactoxylmanana , antgenos capsulares solubles que se distribuyen ampliamente en los
lquidos corporales, tales como sangre, orina y LCR.Por lo tanto, es posible establecer el
diagnstico de criptococosis por demostracin del antgeno circulante, por tcnica
aglutinacin con partculas de ltex unidas a anticuerpos especficos. El examen es muy
sensible, pues detecta el 99% en LCR y 66% en el suero de los pacientes con meningitis
criptococcica , aunque slo en el 10% en el suero de pacientes con infeccin pulmonar.
Es una de las pruebas ms confiables del inmunodiagnstico fngico.Los falsos
positivos pueden deberse a factor reumatoideo u otros factores que interfieren con la
deteccin. No obstante, hay mtodos simples que permiten eliminar estas interferencia,
como tratamiento con Pronasa (Proteasa) o por inactivacin por el calor, que aumenta la
sensibilidad por disociacin del complejo antgeno-anticuerpo.Los falsos negativos
resultan ocasionalmente por efecto prozona y puede ser corregido por dilucin de la
muestra.
Deteccin de anticuerpos. Los antgenos polisacridos son malos productores de
anticuerpos, por lo que la respuesta humoral no es detectada en la mayora de los
pacientes con criptococosis.

ASPERGILOSIS
Los hongos del gnero Aspergillus, que excepcionalmente son responsables de
patologa en el paciente inmunocompetente, son agentes patgenos importantes en
pacientes inmunocomprometidos.Los Aspergillus han emergido como la segunda causa
de infeccin oportunista por hongos, en especial en su forma invasiva.
En el aspergiloma hay una respuesta especfica humoral de tipo IgG. Las tcnicas de
inmunodifusin son las ms ampliamente usadas. La demostracin de precipitinas en
agarosa es til y emplea como antgenos extractos de micelio o filtrados de cultivos; sin
embargo este examen no da una informacin cuantitativa de la concentracin de
anticuerpos.
Otros mtodos usados son radioinmunoanlisis y ELISA.Este ltimo tiene alta
sensibilidad, confiabilidad y ha llegado a ser ampliamente usado. Sin embargo, la
sensibilidad de la tcnica de ELISA depende de muchas variables, como naturaleza y
tipo de antgenos y su capacidad para unirse a superficies slidas . La complejidad de
los antgenos aspergilares usados en estas tcnicas y las variaciones inherentes a las
preparaciones de antgenos, determinan discrepancias de los resultados en los diferentes
laboratorios.
Se ha propuesto que se podran eliminar tanto falsos positivos como falsos negativos
considerando los resultados de diferentes antgenos y mtodos serolgicos, aunque son
procedimientos que consumen tiempo y son de difcil manejo.
En la aspergilosis pulmonar invasora hay desarrollo miceliar en el parnquina pulmonar,
con o sin angioinvasin, causando bronconeumona , neumona lobar, necrotizante e
infarto hemorrgico. En la aspergilosis diseminada hay compromiso de dos o ms
rganos (microabscesos miliares). Esta enfermedad implica un riesgo importante en el
paciente inmunocomprometido, ya que tiene altsima letalidad.La confirmacin
diagnstica es frecuentemente difcil en ausencia de cultivo de muestras respiratorias, ya
que el estudio histolgico de biopsia implica un procedimiento invasivo, muchas veces
peligroso para estos enfermos.Todo esto conduce frecuentemente a tratamientos
empricos frecuentemente poco reglados en cuanto a posologa, duracin de la terapia,
reniciacin de la quimioterapia, etctera.
En los ltimos aos la neumona aspergilar invasiva ha aumentado en aproximadamente
400%.El diagnstico precoz es fundamental ya que experimentalmente se ha
demostrado que si se inicia terapia antifngica despus de una semana del comienzo de
la infeccin, los resultados son deplorables, con 100% de mortalidad. En cambio, un
diagnstico precoz puede mejorar este diagnstico.
Por estas razones, se han hecho grandes esfuerzos para mejorar el inmunodiagnstico de
aspergilosis invasora. La determinacin de anticuerpos es inoperante en el comienzo de
la infeccin y en los pacientes inmunocomprometidos, que son incapaces de producir
anticuerpos. Por esto se ha considerado que la deteccin de antgenos es el mtodo
diagnstico que podra ser ms til en estos pacientes.

La deteccin del polisacrido de pared de Aspergillus (galactomanana) ha demostrado

ser un indicador con una especificidad de aproximadamente 85%, pero poco sensible
(40%).Actualmente existe un examen comercial, por tcnica de aglutinacin por ltex.

MUCORMICOSIS
Son micosis generalmente profundas (forma rinocraneal) de evolucin aguda y alta
letalidad, producida por hongos del orden Mucorales: Mucor, Rhizopus y Absidia.
El diagnstico definitivo lo da el estudio histolgico de biopsias de mucosa sinusal,
especialmente con tincin de Gomori-Grocott, que evidencia filamentos no septados de
dimetro variable y paredes delgadas.
Los cultivos slo entregan un diagnstico presuntivo, ya que los mucorales son los ms
frecuentes contaminantes de laboratorios, por lo que tienen poca validez.El diagnstico
serolgico no est disponible para uso rutinario en laboratorios asistenciales, aunque en
laboratorios de referencia hay tcnicas con anticuerpos fluorescentes y ELISA.

MICOSIS ENDEMICAS O GEOGRAFICAS

Algunas micosis como histoplasmosis, coccidioidomicosis, blastomicosis y
paracoccidioidomiceosis, ocurren en residentes en zonas endmicas y en visitantes de
esas reas.Se caracterizan por la adquisicin rpida de sensibilidad cutnea a los
antgenos y fngicos solubles: histoplasmina, coccidiodina y blastomicetina,
sensibilidad que persiste en el tiempo.
La intradermorreacin a los antgenos fngicos tiene inters diagnstico en los pases
templados, como el nuestro en que estas micosis practicamente no existen.no obstante,
la intradermoreacciones tienen valor discutible en las formas graves, donde
frecuentemente son negativas.

REFERENCIAS ESCOGIDAS
1. Reiss E, and Morrison CJ. Nonculture methods for diagnosis of disseminated
candidiasis.Clin Microbiol Rev 1993;311-323.
2. Kaufman L. Laboratory methods for the diagnosis and confirmation of systemic
mycoses. Clin Infect Dis 1992,14:S233. Swanin RC, Meis J, Rijs A, Donnelly J. Specificity of Enzyme-linked inmunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan.J.Clin Microbiol 1997;
35:257-260.

4. Corrado J. Martino P, De Benardis F Cassone A. Assessment of detection of

Candida mannoproteinemia as a method to differentiate central venous catheterrelated candidemia from invasive disease. J Clin Microbiol 1997; 35:906-909-