UNIVERSIDAD PEDAGGICA Y TECNOLGICA DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

ESCUELA DE QUMICA
QUMICA

DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS EN REACCIONES CATALIZADAS POR

ENZIMAS
1

Correa F. Juanita, 2Pulido B. Andrs

juanitacorrea_13@hotmail.com, totto4ndr3s@hotmail.com
Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia
Avenida Central del Norte 39-115, Tunja, Boyac, Colombia

Resumen:
La invertasa es una enzima que cataliza la reaccin de hidrlisis en la sacarosa. Se realiz la inmovilizacin de la
enzima a partir de levadura y se utiliz como catalizador de la reaccin de hidrlisis de una solucin de sacarosa.
Se prepar un extracto enzimtico a partir de una muestra de levadura comercial, con el fin de observar la
actividad cataltica de la enzima al refrigerarse y conservarse por quince das. El mtodo para la identificacin de
la degradacin de la sacarosa en los azucares que la conforman se realiz empleando el mtodo de Miller, para
la identificacin del azcar reductor y posteriormente por tcnicas espectrofotomtricas se observ el
comportamiento cintico de la reaccin.

Palabras clave: sacarosa, invertasa, enzima, mtodo de miller.

Abstract:
Invertase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis reaction on sucrose. The enzyme immobilization was performed from
yeast and used as catalyst for the hydrolysis reaction of a sucrose solution. An enzyme extract from a sample of commercial
yeast, in order to observe the catalytic activity of the enzyme to be refrigerated and stored for fifteen days prepared. The
method for identifying degradation of sucrose into sugars that form was performed using the method of Miller, for identifying
the reducing sugar and subsequently by spectrophotometric techniques kinetic reaction behavior was observed.

Keywords: sucrose, invertase, enzyme, method miller.

1. Introduccin
Las enzimas son protenas (RNA) que catalizan reacciones qumicas en las clulas. Cada enzima es
altamente especfica para la reaccin que cataliza, es decir son catalizadores especficos: cada
enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un
grupo muy reducido de ellos, esta especificidad est determinada por el centro activo de la enzima
(en donde se hallan los grupos qumicos responsables de la catlisis) [1]. Muchas enzimas necesitan
co-factores (co-reactivos, co-sustratos) para cumplir su funcin cataltica.
Son Protenas de alto peso molecular (macromolculas, 104 a 106 g/mol, 102 a 104 aminocidos). Su
actividad depende de la integridad de su conformacin proteica. Los metales pueden formar parte de
su centro activo, o de otra parte de la enzima (co-factor). Los reactivos de las reacciones catalizadas
por enzimas se denominan sustratos [2].
En una reaccin catalizada por un enzima (Fig.1.):
La sustancia sobre la que acta la enzima (sustrato).
El sustrato se une a una regin concreta del enzima (centro activo).
Un sitio de unin formado por los aminocidos que estn en contacto directo con el sustrato.

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Un sitio cataltico, formado por los aminocidos directamente implicados en el mecanismo de la

reaccin.
Formados los productos la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reaccin

Fig.1. Reaccin catalizada por una enzima.

La catlisis enzimtica es esencial para los organismos vivos, ya que hace posible que en
condiciones fisiolgicas tengan lugar reacciones qumicas, las que en ausencia de catalizador
requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH. La actividad cataltica depende de la
integridad de su conformacin proteica nativa. Si se desnaturaliza o disocia en subunidades pierde su
actividad [3].
La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima depende de:
1. La concentracin de molculas de sustrato [S].
2. La temperatura.
3. La presencia de inhibidores.
4. pH del medio, que afecta a la conformacin (estructura espacial) de la molcula enzimtica.
En 1890, Emil Fischer propuso un modelo de llave cerradura para explicar la especificidad de las
enzimas. Muchas enzimas poseen estereo-especificidad, catalizan reacciones de sustratos en una
configuracin, pero no en otra (Fig. 2.).

Fig.2. Especificidad de las enzimas.

Una enzima puede contener uno o ms sitios activos. El sitio activo consiste solamente de unos
cuantos residuos de aminocidos y el resto de la protena se requiere para mantener su integridad
tridimensional.

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Cintica de Michaelis-Menten [3]

E = enzima
S = sustrato,
ES = complejo enzima sustrato
Para derivar una expresin de velocidad.
Michaelis and Menten inicialmente asumieron
que el paso lento es la formacin de P a partir
del complejo enzima-sustrato, ES. La
formacin de ES, se considerada como un
proceso de equilibrio rpido.

Cuando K-1 >>K2

A baja concentracin de sustrato, [S] << Ks

La velocidad depende de la [S]

Esta ley de velocidad corresponde a la porcin
final de la grfica V0 Vs. [S]
A alta concentracin de sustrato, [S] >> Ks

La constante de disociacin

Bajo estas condiciones, todas las molculas de

enzima estn en la forma del complejo ES.
Consecuentemente, la velocidad es de orden
cero en [S].

A un tiempo corto despus del comienzo de la

reaccin, la concentracin total de enzima

Cuando todas las molculas de enzima estn

complejadas con el sustrato, formando ES, la
velocidad alcanza su mximo
V0 = k2 [E]0 =Vmx

Sustituyendo en la expresin de velocidad:

Tiene la forma de la ecuacin de la hiprbola

Representa la transicin de baja a alta concentracin

Cintica del estado estacionario [3]

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En 1925 Briggs y Haldane postularon que tan

pronto como la enzima y el sustrato se
mezclaban, la concentracin del complejo ES
alcanzaba un valor constante, de tal manera
que la aproximacin del estado estacionario
poda aplicarse.

Este tratamiento define la velocidad mxima

exactamente como el modelo de Michaelis
Menten.
Vmax = k2[E]0

Cuando la velocidad inicial es la mitad del

mximo de la velocidad

Estado estacionario:

Vmx y KM pueden determinarse a partir de la

grfica de v0 vs [S]

Equilibrio:

KM Es un parmetro de afinidad con el sustrato.

Mientras mayor sea KM la unin es ms dbil.
Representa la concentracin de sustrato a la cual la mitad de los sitios activos de la enzima estn
ocupados por molculas de sustrato.

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El valor de KM vara considerablemente de una enzima a otra.

KM depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH, fuerza inica. Por lo tanto su valor
sirve para caracterizar sistema enzima-sustrato en particular.
Para la mayora de las enzimas, KM est entre 10-1 M y 10-7 M.
Vmx representa la mxima velocidad que puede alcanzarse.
De acuerdo con la ecuacin, Vmx = k2[E]0, si se conoce la concentracin de enzima, se puede
determinar tambin la constante k2.
k2 es una constante de primer orden y tiene unidades de tiempo-1.
En cintica enzimtica k2 se conoce tambin como nmero de recambio de la enzima
constante cataltica, kcat.
El nmero de recambio de una enzima se define como el nmero mximo de molculas (o
moles) de sustrato que se convierten a producto por unidad de tiempo.
La mayora de las enzimas tienen nmeros de recambio entre 1 y 10 5 s-1 en condiciones
fisiolgicas.
2. Seccin experimental.
A partir de la levadura comercial, se pesaron 14g de levadura y se adicionaron 50 ml de NaHCO 3 al
0,1 M. Se mantuvo durante 24 horas en calentamiento a 40 C. Se centrifug a 3000 rpm durante 15
minutos y se recogi el sobrenadante, que contena la enzima invertasa.
Para la curva de calibrado y el estudio cintico se prepararon 25 mL de solucin de sacarosa al 0.25
M y de igual forma la solucin de azcar invertido al 0,0025 M. Se prepararon los sets de tubos para
la curva de calibracin del azcar invertido y el estudio cintico de la reaccin de acuerdo a la tabla 1
y tabla 2, respectivamente
Tabla 1. Curva de Calibracin del azucar invertido.

Tubo
n

0
1
2
3
4
5
6

Disoluci
n
de
azucar
invertido
0,0025M
(ml)
0
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

Agua
(ml)

2
0,9
0,8
0,6
0,4
0,2
0

Sacaro
sa
0,25 M
(ml)

Ac.
3,5dinitrosalicl
ico
(ml)

0
1
1
1
1
1
1

2
2
2
2
2
2
2

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Ya que al diluir hasta 10ml y al pasar las muestras por el espectrofotmetro UV-Vis estas no dieron
lectura ya que se encontraban demasiado concentradas, se extrajeron 9 ml y con el militro restante se
diluyo hasta 30 ml.

Tabla 2. Efecto de la concentracin en la cintica de la reaccin.

Tubo n

Sacarosa 0,25 M
(ml)

H2O(ml)

Sln tampon
(ml)

Sln Enzimatica
(ml)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0
0,05
0,1
0,2
0,4
0,8
1,0
1,3
1,6
2,0

0
1,95
1,9
1,8
1,6
1,2
1,0
0,7
0,4
0

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Acido 3,5dinitro
salicilico (ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

A cada tubo se aadi 1ml de tampn acetato y 1ml de la dilucin enzimtica, dejando reposar
durante 15 min a temperatura ambiente. La reaccin se suspendi aadiendo 2ml de cido 3,5dinitrosaliclico. El cambio de coloracin se observ al calentar a ebullicin los tubos durante 4min.
Se enfri y diluy hasta 10ml con agua destilada. Luego se realiz las mediciones en el
espectrofotmetro midiendo la absorbancia a 540 nm.
3. Resultados y discusin
Para la determinacin de azcares reductores, se realiz una curva de calibracin de azcar invertido
segn tabla 1. Al realizar la lectura de la absorbancia para la curva de calibracin se gener la tabla
3. Al diluir hasta 10ml y al pasar las muestras por el espectrofotmetro UV-Vis estas no dieron lectura
ya que se encontraban demasiado concentradas, se extrajeron 9 ml y con el militro restante se diluyo
hasta 30 ml.
Para la determinacin de la concentracin de azcar invertido se us la ecuacin de absorbancia

C=

A
e.b

Siendo:
C = concentracin.
A = absorbancia obtenida.
e = la longitud de la celda.

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b = longitud de onda a la que se hace la lectura.

Tabla 3. Absorbancias de la curva de calibracin del azucar invertido.

Tubo n

1
2
3
4
5
6
7

Concentracin
de
azucar
invertido (ml)
0
0,00130222
0,00062
0,00144444
0,00098889
0,00148222
0,00375333

Absorbancia

0
0,586
0,279
0,65
0,445
0,667
1,689

Fig3. Curva de calibracion de azucar invertido.

Tabla 4. Absorbancias obtenidas para el estudio de la cinetica con el sobrenadante de la sln enzimatica.

Tubo n

Volumen

Absorbancia

concentracion

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1
2
3
4
5

sacarosa 0,25M
(ml)
0
0,05
0,10
0,20
0,40

0
-0,065
-0,073
0,630
0,676

-0,00014444
-0,0001622
0,0014
0,00150222

Fig4. Relacion del estudio de la cinetica con el sobrenadante de la solucin enzimatica.

En la tabla 4 se obtuvieron datos con valor negativo. Estos tipos de lecturas se obtienen
generalmente cuando la concentracin del analito es insuficiente para generar una seal aceptable y
leble por el instrumento. Teniendo en cuenta el fundamento qumico del mtodo de Miller, donde se
indica que el cido 3,5-dinitrosaliclico, es un compuesto coloreado amarillo que al estar en presencia
de un azcar reductor genera un compuesto amino cambiando su coloracin de amarillo a marrn o
rojizo. La interaccin de la enzima invertasa, que cataliza la reaccin de hidrlisis de la sacarosa
grfica 1, genera como productos de dicha reaccin azcares reductores. Teniendo en cuenta que
los dos productos obtenidos son azcares reductores, la reaccin con el cido 3,5 dinitrosaliclico
puede darse con cualquiera de los dos, teniendo en cuenta que la estequiometria de la reaccin
indica la generacin de la misma proporcin de fructosa y glucosa
4. Fuentes De Error
5. Recomendaciones

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6. Conclusiones
-

La inmovilizacin de la enzima sobre un soporte permite una facilidad de recuperacin de la

enzima invertasa y por tanto facilita el trabajo en el estudio de la cintica de reaccin.

7. Bibliografa
[1] S. KUMAR, A. GHALY, M. BROOKS, S. BUDGE, D. DAVE, Effectiveness of enzymatic
transesterification of beef tallow using experimental enzyme Ns88001 with methanol and hexane, Enz.
Eng. 2 (2013) 2.
[2] K. DRAUZ, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis: A Comprehensive Handbook, John Wiley &
Sons, 2012.
[3] M.A. BIASUTTI, E.B. ABUIN, J.J. SILBER, N.M. CORREA, E.A. LISSI, Kinetics of reactions
catalyzed by enzymes in solutions of surfactants, Adv. Colloid Interface Sci.136 (2008) 124.
[4] I.H. SEGEL, Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State
Enzyme Systems, Wiley-Interscience, 1993 (New Ed edition, ISBN 0-471-30309-7).

Anexos
PRE INFORME PRCTICA N3
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Conceptos previos
Consulte el fundamento de las reacciones catalizadas por al menos tres grupos de enzimas.

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En funcin de su accin cataltica especfica, las enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases:
Clase 1: OXIDORREDUCTASAS
Clase 4: LIASAS
Clase 2: TRANSFERASAS
Clase 5: ISOMERASAS
Clase 3: HIDROLASAS
Clase 6: LIGASAS

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Transferasas, catalizan la transferencia de un grupo qumico (distinto del hidrgeno) de un

sustrato a otro, segn la reaccin:
A-B + C A + C-B
Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la reaccin:
glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato
Se clasifican en: Grupos Monocarbonados, Grupos
Aldehdo o Ceto, Acil Transferasas, Glicosiltransferasas,
Alquil o Ariltranferasas, Grupos Nitrogenados, Grupos Fosfato, Grupos Sulfato.
Hidrolasas, estas enzimas son capaces de hidrolizar es decir descomponer enlaces
qumicos por su reaccin con el agua. Las enzimas Hidrolasas reaccionan de la siguiente
manera:
AB + H2O AH + BOH
Un ejemplo es la lactasa, que cataliza la reaccin:
lactosa + agua glucosa + galactosa
Se clasifican en: Esterasas, Glucosidasas, Eter Hidrolasa, Peptidasas, Acil anhidro Hidrolasas,
Helicasas.
Liasas, estas enzimas son las encargadas de catalizar la ruptura de enlaces qumicos en
compuestos orgnicos por un mecanismo distinto a la hidrlisis y a la oxidacin. Como
resultado del proceso de la ruptura de los enlaces se forman frecuentemente nuevos dobles
enlaces o nuevas estructuras en anillos. Las enzimas Liasas reaccionan de la siguiente
manera:
AB A + B
Un ejemplo es la acetoacetato descarboxilasa, que cataliza la reaccin:
cido actico CO2 + acetona

Se clasifican en: actan sobre enlaces C-C, C-O, C-N, C-S, C- Haluro, P-O.

Indique cules son las longitudes de onda de absorcin para la sacarosa, glucosa, fructosa y para
el azcar invertido.

Para la determinacin de la glucosa es muy conocida la tcnica de Trinder: la enzima que

acta sobre la glucosa es la glucosa oxidasa (GOD), transformndola en agua oxigenada y
cido glucnico.

GOD

Glucosa
+ O2 + H2O H2O2
+ cido glucnico

(No coloreada)
(No coloreada)
(No coloreado)

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El agua oxigenada formada se hace reaccionar con fenol y 4-aminofenazona para formar un
complejo que en presencia de una segunda enzima, la peroxidasa (POD) se transforma este
complejo en quinona, un producto rojo que ahora s puede ser ledo al espectrofotmetro.
POD
2 H2O + Fenol + 4-AF Quinona + 4 H2O
(No coloreada)
(Roja)
La absorbancia leda correspondiente a la quinona es directamente proporcional a la cantidad
de glucosa en la muestra. La quinona que tiene un sistema conjugado ms largo, absorbe en
el UV-visible.
Fructosa (glucosa)
340 nm
Glucosa
570 nm

Azcar invertido
540 nm
Sacarosa
540 nm

Describa el procedimiento para la preparacin de soluciones tampn, especficamente para

preparar un tampn acetato sdico 0,025M, pH: 4,5.

Algunos sistemas amortiguadores tpicos se resumen en la tabla siguiente: