EXPRESIN DE PROTENAS EN

LEVADURAS
Dr. Vctor Blancato

Produccin de protenas
recombinantes en clulas eucariotas

Problemas que suelen a parecer cuando

protenas eucariticas son expresadas en clulas
procariotas

inestables

sin actividad biolgica

contaminantes procarioticos

Sistemas de expresin eucariotas

Para eliminar estos problemas se han desarrollado

sistemas de expresin eucariotas

Necesidad de que tengan idnticas propiedades

a la protena natural: bioqumicas, biofsicas y
funcionales

Especialmente importantes para protenas

teraputicas

Ventajas de produccin de protenas

recombinantes a gran escala en levaduras

utilizacin de cepas modificadas en su pared

celular que permiten una fcil y eficiente
liberacin del producto intracelular

se puede acoplar a procedimientos de

purificacin en un solo paso

las levaduras son sistemas idneos para mimetizar

funcionalmente a las clulas humanas

Sistemas de expresin eucariotas

Cual es la diferencia?

Modificaciones post-traduccionales de la mayora

de las protenas eucariotas no pueden ser llevadas
a cabo en clulas procariotas

Modificaciones post-traduccionales

Formacin de uniones disulfuro correctas

Clivaje proteoltico del precursor inactivo

Glicosilacin, agregado de residuos de azcar

Modificacin de aminocidos:

fosforilacin

acetilacin

agregado de grupos sulfato

agregado de cidos grasos

Sistemas de expresin en levaduras:

Ventajas

Organismo unicelular

Bien caracterizadas gentica y fisiolgicamente

Promotores fuertes disponibles

Eucariotas, ocurren modificaciones posttraduccionales

Segregan algunas protenas

No patgeno

Otras ventajas de la expresin en levaduras

Expresin de protenas que solo expresan como

cuerpos de inclusin insolubles en bacterias

Plegamiento correcto

La falta de contaminacin por endotoxinas

(produccin de vacunas o drogas teraputicas)

Desventajas ----- hiperglicosilacin

Saccharomyces cerevisiae S288c

Primer genoma eucariota secuenciado (600

laboratorios) en 1997

Schizosaccharomyces pombe, 2002

Posee 16 cromosomas

12.01 millones de pb, 6275 genes

de los ORFs identificados

DNA nuclear haploide solo 3,5 veces el de E. coli

Ventajas del uso de levaduras

Conservacin de procesos celulares respecto

a otros eucariotas (Transcripcin, traduccin
splicing, modif PT, etc.)

Organismo GRAS

Cultivo simple, econmico y rpido (90 min td)

Contiene organelas como otros eucariotas

Modifica mRNA similar a otros eucariotas

Medios para levaduras

Pueden ser crecidas en medios lquidos o slidos

Crecen en medio mnimo con glucosa, nitrgeno,

fosforo y trazas de metales

Fuentes alternativas de carbono: rafinosa,

maltosa, fructosa, galactosa

Galactosa se utiliza para inducir la transcripcin

de secuencias fusionadas al promotor Gal
2ADP

2ATP

Glucose
Fermentation
2 Ethanol

2 Pyr
2NAD+

2 NADH

2 CO2
2 Acetaldehyde

Clonado en Levaduras

La era de la genetica molecular en levaduras comenz en 1978,

cuando S. cerevisiae fue transformada con DNA heterlogo.

Hay muchos protocolos de transformacin pero son como mnimo

tres rdenes de magnitud menos eficientes que los de E. coli.

Apa LI (178)

P(BLA)

El clonado y preparacin de plsmidos de levaduras es muy

ineficiente

Apa LI (2367)

Entonces para el clonado en levadura se utiliza E. coli como

sistema de produccion:

ALPHA

Los plsmidos se construyen in vitro

Hin d III (400)

Pst I (416)
Bam H I (430)
Ava I (435)

APr

pUC1 8

2686 bp

Xma I (435)
Sma I (437)
Eco R I (451)

P(LAC)
ORI

Los plsmidos son transformados en E. coli y se confirma la

construccin

Se producen los plasmidos en bacteria....

....y luego se transforman en levadura

Se trabaja con vectores shuttle levadura - E. coli

Por otro lado, las levaduras tienen un sistema muy eficiente de

recombinacion que se utiliza para el clonado

Apa LI (1121)

Vectores de levaduras

Replicacin en E. coli y levaduras

Dos tipos de genes de seleccin

E. coli

antibioticos

Levaduras

genes involucrados en vas no biosintticas

Marcadores de seleccin en
levadura
TRPl

codifica la N-(5 'fosforri bosil) a ntranilato

isomerasa (sntesis de triptofano y
metabolismo de la glutamina)

URA3

codifica Orotidine - 5 '- fosfato descarboxilasa

(protena de 267 aminocidos que participa
en la biosntesis de uracilo)

LEU2

codifica la beta isopropil malato

deshidrogenasa (cataliza la tercera etapa en
la biosntesis de leucina)

LVS2

codifica para una alfa-ami noadipato

reductasa (paso esencial en la biosntesis de
lisina)

HIS3

codifica la imidazol glicerolfosfato

deshidratasa (involucrada en la sntesis de
histidina)

Vectores shuttle Levadura-E. coli

EcoR I (2)

Plasmidos integrativos
(YIp) consisten de:

Cla I (28)
Apa LI (5217)

Amp-resistance

Pero carecen de origen de replicacion

para levaduras
Por lo tanto, se propagan solo por
integracin en el genoma

BamH I (379)

Pst I (4795)

Tet-resistance

La estrructura de plasmidos de E. coli

vector como pBR322, pUC19,
pBLUESCRIPT
Marcadores de seleccin de
levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2

Hind III (33)

YIp5
Apa LI (3971)

5541bp
Pst I (1644)

PMB1
Nco I (1867)

URA3

Apa LI (3473)

Ava I (2541)
Xma I (2541)
Sma I (2543)

YIp5: pBR322 plus the URA3 gene

Vector shuttle E. coli - levadura

Los plsmidos replicativos

episomales (YEp) consisten
de:

La estrructura de plasmidos de E. coli vector

como pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

ApaLI (7445)
Amp-resistance

Y poseen el origen de replicacin del plsmido

2micron de levaduras

Entonces, se propagan relativamente estables a

un alto nmero de copias, gralmente 20-50 por
clula

Hind III (106)

PstI (7023)
2micron ORI
Ava I (1391)
PMB1

YEp24

Marcadores de seleccin de levaduras:

URA3, HIS3, TRP1, LEU2

EcoR I (2)

PstI (2001)
EcoR I (2242)
ClaI (2268)
Hind III (2273)
PstI (2482)
NcoI (2705)
URA3
XmaI (3379)
Ava I (3379)
SmaI (3381)
Hind III (3439)
BamH I (3785)

7769bp

Ava I (4835)
Tet-resistance

YEp24: pBR322 plus the URA3 gene, plus 2micron origin

Vector shuttle E. coli - levadura

EcoR I (2)
ClaI (28)

ApaLI (7626)

Los plasmidos replicativos

centromricos (YCp) consisten de:

Hind III (33)

BamH I (379)

Amp-resistance

La estrructura de plasmidos de E. coli vector como

pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT
Marcadores de seleccin de levaduras: URA3, HIS3, TRP1,
LEU2

Y poseen un origen de replicacin

cromosomal para levaduras (ARS, for
autonomously replicating sequence)

Poseen un centrmero CEN de un

cromosoma de levadura

Se propagan de forma estable a un

bajo nmero de copias, por lo general
uno por clula.

PstI (7204)

Tet-resistanc
PMB1

YCp50

7950bp

POLY
PstI (1644)
NcoI (1867)

URA3
XmaI (2541)
Ava I (2541)
SmaI (2543)
POLY

ARS1
Ava I (4703)

CEN4
YCp50: pBR322 plus the URA3 gene,
plus CEN4, plus ARS1

Promotores de levaduras
Promotor

Condicin

Acid phosphatase

PHOS

lnducible

Alcohol dehydrogenase I

ADH I

Constitutivo

Alcohol dehydrogenase II

ADH II

lnducible

Galctokinase

GAL 1

lnducible

Metallothionein

Cup 1

lnducible

Phosphoglycerate kinase

PGK

Constitutivo

Triose Phosphate isomerase

TPI

Constitutivo

La mayora de vectores de expresin actuales tienen promotores

inducibles, como los de shock trmico, o el GAL 1 y el GAL10 que se
inducen 1000 veces en presencia de galactosa.

Mtodos artificiales para introducir

ADN exgeno en levaduras:

Electroporacin

Obtencin de protoplastos en medio

hipertnico y mezclndolos con el ADN en
presencia de una sustancia fusognica como
el polietilenglicol (PEG)

Tratamiento de clulas completas con sales de

litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con
choque trmico para estimular la
transformacin

Sistemas de expresin en
levaduras:

Desventajas

Inestabilidad de plsmidos en gran escala

Vectores episomales

Superglicosilacin de glicoprotenas

100 o ms residuos manosa versus 8-13

puede alterar la actividad de la protena

Protenas secretadas quedan atrapadas en

periplasma (entre la membrana y la pared
celular)

se usan seales peptdicas

Soluciones a los problemas en

sistemas de expresin en levaduras

Levaduras modificadas genticamente para

llevar a cabo glicosilacin igual a humanos

Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)

Delecin de genes de glicosilacin de levaduras

Agregado de genes de glicosilacin de humanos

Soluciones a los problemas en

sistemas de expresin en levaduras

Usar otro tipo de levaduras

Pichia pastoris

Hansenula polymorpha

No solo Saccharomyces cerevisiae

Usar otros eucariotas

Clulas de insectos

Cultivos de clulas de mamferos

Pichia pastoris Expression

system: Ventajas

Puede utilizar metanol como fuente de carbono en

ausencia de glucosa.

Utiliza el promotor AOX1 (alcohol oxidasa)

Las protenas producidas suelen ser plegadas

correctamente y secretadas en el medio.

Bastante fciles de crecer en un frasco con agitacin y

manipuladas genticamente

Son GRAS

Capaz de expresar un alto nivel de protenas

heterlogas

La existencia de una seal de secrecin para una fcil

purificacin del sobrenadante.

Ventajas de Pichia pastoris sobre

Saccharomyces cerevisiae

El gen de alcohol oxidasa (AOX1) es inducible por metanol

El metanol es la fuente de carbono e inductor

AOX1 : gen altamente regulado que se reprime en

ausencia de metanol

evita los efectos txicos de la expresin de protenas

heterlogas hasta que la expresin es inducida por el
metanol.

Pichia puede crecer hasta densidades mayores que S.

cerevisiae (150 g / litro)

Mayor rendimiento reportado en Pichia (12 g/L para el

fragmento de la toxina tetnica C)

Puede utilizar tambin promotor GAP (gliceraldehdo-3fosfato deshidrogenasa), un promotor constitutivo con
crecimiento en glucosa, glicerol o metanol.

Otros promotores: AOX2, FLD (formaldehdo

deshidrogenasa), ICL 1 (Isocitrato liasa)

Posibilidad de utilizar mtodos estndar de S. cerevisiae

para su manipulacin gentica.

Otras ventajas

Metabolismo preferentemente respiratorio, lo que

permite grandes densidades celulares

Mejores modificaciones postraduccionales que S.

cerevisiae: procesamiento proteoltico, glicosilacin y
formacin de puentes disulfuro

Grandes rendimientos de protena (mayor que

baculovirus y mamfero)

Altos niveles de secrecin de protena heterloga casi

sin secrecin de protenas nativas

Fcilmente escalable en industria y mas barato y

rpido que los sistemas de eucariotas superiores.

Modificaciones post-traduccionales:
S. cerevisiae vs. Pichia

Pichia no hiperglicosila

Polisacridos tipo manosa

S. cerevisiae agrega 50-150 residuos de manosa y

Pichia agrega 8- 14 residuos de manosa (+ cortos que
S. cerevisiae)

Pichia hace poca O-glicosilacin

S. cerevisiae termina en alfa-1,3 glucanos (alta

actividad antignica)

Pichia no termina en alfa-1,3,y por ello, poseen mayor

similitud con protenas humanas

Protenas expresadas en
Pichia

Proteinas expresadas en
Pichia

Produccin de protenas
recombinantes en Pichia pastoris

Quimosina recombinante: clonado del gen de la

quimosina bovina en Pichia. Se usa en la coagulacin de
la casena, en la obtencin de quesos.

Hormona de crecimiento humana (E. coli y levaduras)

Vacuna contra la Hepatitis

Limitaciones del sistema de

expresin en Pichia pastoris

El metanol que se necesita para la induccin implica

riesgo por su toxicidad y puede no ser adecuado para
producir protenas alimentarias. Se necesitan
promotores fuertes no inducibles por metanol

Promotor del gen de la gliceraldehdo-3-fosfato

deshidrogenasa (GAP). Alto nivel constitutivo de expresin
en glucosa o glicerol. Desventaja: constitutivo.

Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codifica para la

glutatin deshidrogenasa dependiente de formaldehdo.
Se puede inducir por metanol o metilamina (una fuente
inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles
inducidos de expresin con este promotor son parecidos a
los del gen AOX1 en metanol.

Se necesitan promotores de expresin moderada:

El gen PEX8, que codifica una protena de biognesis del

peroxisoma. Bajo nivel de expresin con glucosa, y se induce
moderadamente (unas 10 veces) cuando las clulas se pasan
a metanol.

El gen YPT1: confiere expresin baja pero constitutiva en

glucosa, metanol o manitol.

Carencia de mas genes marcadores para seleccionar los

recombinantes.

Hasta hace poco, solo se dispona de HIS4, ARG4 y Sh ble

(resistencia a zeocina). Ahora hay otros marcadores: ADE1,
URA3.

Pichia methanolica Expression System

designed for high-level production of recombinant proteins
posttranslational modifications offered by eukaryotic hosts
strong AUG1 promoter for rapid, high-level protein expression
Transcription from the AUG1 promoter is tightly repressed in medium
containing glucose or glycerol as a carbon source
When cells are shifted to medium with methanol as the sole carbon source,
transcription is rapidly induced to very high levels (better than P. pastoris)
suitable for high-level production of toxic recombinant proteins
pMET vectors offer the following features:
Strong AUG1 promoter for high-level, tightly-regulated expression
alpha -factor signal sequence for secretion
C-terminal V5 epitope (detection with an Anti-V5 Antibody) and (6xHis)
tag
gene for auxotrophic selection on drop-out medium
3 reading frames relative to the C-terminal fusion tag
3 reading frames relative to the secretion signal sequence.

EXPRESIN DE PROTENAS EN
LEVADURAS
Dr. Vctor Blancato