SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA

REGIONAL BOLIVAR
CENTRO AGROEMPRESARIAL Y MINERO
TECNLOGO EN PROCESOS BIOTECNOLGICOS APLICADOS A LA INDUSTRIA
GUIA DE LABORATORIO N4. TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM Y TINCIONES SELECTIVAS
1. INTRODUCCION
La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos
de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos principales: primero
un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la tincin; enseguida un paso de
decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de clulas y finalmente un colorante de
contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas pero no tiene efecto sobre las clulas que an
retienen el colorante primario.
La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales
ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram
positivas y Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano
que se encuentra en las paredes celulares deestas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen
muchas capas de peptidoglucano, lascuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoico. El cido
teicoico reacciona con elcristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las
molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover.
Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar
una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la
clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la
capa exterior de lipopolosacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la
remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas.
Cuando otro colorante, usualmente safranina, se aade, las clulas Gram positivas siguen de color azulvioleta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del
procedimiento de tincin, las clulas Gram positivas sern del color del cristal violeta, o colorante
primario, y las clulas Gram negativas sern del color de la safranina que es el colorante de contraste.

2. OBJETIVOS
Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la
tincin de Gram.
Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin
de las bacterias.
3. EQUIPOS, MATERIAL E INSUMO

Microscopio ptico
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol cetona
Safranina
mechero
asa microbiolgica
Aceite de inmersin
Papel de arroz
Plumn indeleble
Cultivos microbianos
Porta objetos
Fenol al 2%

POR ING SANDRA LILIANA PABON

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GUIA DE LABORATORIO N4. TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM Y TINCIONES SELECTIVAS
Beaker de 100 ml
Verde Malaquita
Tinta china
4. PROCEDIMIENTO
4.1 TINCIN DE GRAM
a) Preparacin del frotis.
b) Cubrir con cristal violeta durante un minuto.
c) Volcar el colorante y lavar con agua por no ms de dos segundos.
d) Tratar con lugol por un minuto, lavar con agua y secar sobre papel secante o filtro.
e) Decolorar
rar con alcohol por 30 segundos (goteando).
f) Secar sobre papel.
g) Cubrir con colorante de contraste (safranina o fucsina).
h) Lavar con agua.
i) Secar y observar con lente d
de inmersin.
Resultados: Bacterias teidas de violeta: grampositivo. Bacterias teidas de rosado: gramnegativo.
4.2 TINCIN SELECTIVA DE ESPORAS.
a)
b)
c)
d)

Colocar un pequeo trozo

zo de papel filtro sobre el frotis realizado.
Agregar verde malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparacin.
Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitado con agua en ebullicin.
Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante y eliminar el colorante con agua
destilada.
e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.
f) Lavar nuevamente y dejar secar al aire.
aire.(Ver figura 1)

Figura 1.

POR ING SANDRA LILIANA PABON

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4.3 TINCIN NEGATIVA PARA OBSERVACIN DE CAPSULAS.

a) Hacer una suspensin de microorganismo
ganismo en una gota de agua destilada y mezclar
cuidadosamente con la tinta china.
b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando orto portaobjetos
porta
perpendicular en un angulo de 45 sobre la muestra.
c) Desplazar poco apoco el segundo portaobj
portaobjetos
etos a lo largo del primero para una capa
fina de la mezcla.
d) Dejar secar al aire.( Ver figura 2)

Figura 2.

5. RESULTADOS
Reportar las observaciones
nes de forma, agrupacin y tamao relativo de cada uno de los
microorganismos
Comparar sus observacion
observaciones microscpicas con las reportadas en la literatura.
6. PREGUNTAS

Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos
ejemplos de tincin diferencial.
Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram?
Explique el fundamento de la tincin de esporas. por qu se debe calentar la preparacin?qu
preparacin
dificultades se tendran si no se adiciona safranina al final de la tincin.
Explique el fundamento de la tincin negativa realizada en la prctica . Qu tipo de
informacin se obtiene? Investigue que otra tcnica de tincin selectiva que permita observar
estas estructuras bacterianas

POR ING SANDRA LILIANA PABON