DEPARTAMENTO DE GENTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA

INSTITUTO DE BIOCINCIAS
UNIVERSIDADE DE SO PAULO

BIOLOGIA CELULAR (BIO-206)

INTRODUO AOS MTODOS DE ESTUDO DA

CLULA

I. INSTRUMENTAO EM CITOLOGIA: O MICROSCPIO FOTNICO

A clula, o objeto de estudo da Citologia, pode ser estudada sob diversos

aspectos: podemos procurar conhecer sua forma e a de seus constituintes, a
natureza qumica desses constituintes e seu modo de funcionamento. Em outras
palavras, essas investigaes so denominadas morfolgicas, qumicas ou
bioqumicas e fisiolgicas e a cada uma delas correspondem mtodos de estudo
particulares. Esta parte do curso de Citologia tratar justamente de introduzir o aluno
nos diversos tipos de abordagem normalmente utilizados no estudo da clula.
De uma maneira geral, podemos dizer que, devido s suas pequenas
dimenses, um estudo detalhado da clula e de seus constituintes com a vista
desarmada virtualmente impossvel. Para se ter uma idia, as dimenses mais
comumente observadas entre as clulas de animais e vegetais superiores, situam-se
na faixa de 10 a 20 m (lembrar que 1 m = 10-3 mm; 1 nm = 10-6 mm e 1 = 10-1 nm).
Por isso, o citologista obrigado a se utilizar de instrumentos de aumento para a
observao conveniente da clula.
Os

estudos

morfolgicos

ou

morfofisiolgicos

da

clula

comeam

normalmente com o emprego do microscpio ptico, mais corretamente denominado

de microscpio fotnico (por se utilizar da luz como fonte de formao de imagens)
ou microscpio composto (pode ser constitudo por dois sistemas de lentes
sobrepostas: a objetiva e a ocular). Este instrumento pode ser considerado como a
ferramenta bsica e indispensvel de todo o citologista.
A observao da clula ao microscpio fotnico feita por luz transmitida,
possibilitando assim que detalhes estruturais internos possam ser evidenciados.
Contudo, esta observao por transmisso de luz exige que o objeto a ser estudado
responda a certas condies. Para que a luz possa atravess-lo, o objeto deve ser
suficientemente fino. No caso da clula, para se ter uma imagem conveniente sem
grande sobreposio de estruturas, essa espessura deve ser da ordem de 5 m.
Como raramente uma clula apresenta uma espessura to pequena, somos
obrigados a fazer fatias ou cortes da clula para atingir a espessura desejada.
Alm da espessura, a observao da clula por transmisso ao microscpio
fotnico apresenta ainda um outro problema: ela s efetiva se certas regies do
objeto absorverem mais luz do que outras, ou seja, se esse objeto apresentar
contrastes. Como em geral os constituintes celulares tm muito pouco contraste, o
citologista obrigado a lanar mo de certos artifcios para contornar esse problema.
A alternativa mais lgica criar, artificialmente, este contraste, no nvel de certas
estruturas celulares. Isto pode ser obtido atravs do uso de corantes, que so

substncias que absorvem certos comprimentos de onda da luz visvel e tm

afinidade por determinados constituintes celulares. Uma outra maneira de se criarem
contrastes artificialmente atravs da utilizao de certas montagens pticas
especiais que so capazes de ampliar as pequenas diferenas de contrastes
existentes entre as diversas regies da clula. Como exemplo dessas montagens,
temos o microscpio de fase, o microscpio de interferncia, o microscpio de
polarizao, etc.
- Partes do Microscpio Composto.
Compe-se fundamentalmente das seguintes partes:
A) Partes Mecnicas
1. P - a base do aparelho e suporta todas as outras partes.
2. BRAO - preso ao p, rgido ou articulado, suporta o canho, a platina, o
condensador e o espelho (ou fonte luminosa).
3. CANHO - o tubo onde se dispem as parte pticas de ampliao; pode ser fixo
ao brao ou possuir movimento vertical.
4. REVLVER - uma pea giratria onde se conectam as objetivas e que permite a
instantnea mudana das mesmas.
5. PLATINA - a mesa de trabalho, onde se coloca a preparao para exame; possui
uma abertura central que d passagem luz proveniente da fonte; pode ser fixa ao
brao (se o canho for mvel) ou possuir movimento vertical (se o canho for
fixo).
6. "CHARRIOT" - um dispositivo preso platina, dotado de movimento anteroposterior e lateral, destinado a movimentar a preparao.
7. PARAFUSO MACROMTRICO - um dispositivo destinado a dar grandes e rpidos
deslocamentos verticais ao canho ou platina; serve para focalizao grosseira.
8. PARAFUSO MICROMTRICO - um dispositivo destinado a dar pequenos e lentos
deslocamentos verticais ao canho ou platina; serve para focalizao fina.

B) Sistema de iluminao
1. ESPELHO OU FONTE DE LUZ DIRETA - preso parte inferior do brao, refletindo
ou projetando a luz para a parte inferior do condensador.
2. DIAFRAGMA OU RIS - colocado sob o condensador, destinado a restringir o
dimetro do feixe luminoso.
3. CONDENSADOR - um sistema ptico de refrao preso parte inferior do brao,
sob a platina, podendo ou no possuir movimento vertical (e lateral para
centragem), destinado a fazer convergir sobre a preparao a luz proveniente da
fonte.
C) Sistema de ampliao
1. OBJETIVA
2. OCULAR
- Princpios de Formao de Imagem ao Microscpio Fotnico
A luz proveniente da fonte luminosa, seja ela direta ou refletida, aps
atravessar o condensador, concentrada sobre a preparao. A luz incidente no
condensador deve ser paralela para que toda a luz emergente possa convergir no
foco daquele sistema ptico. Assim, no caso da existncia de espelho, a face plana
deve ser utilizada quando a luz for artificial e emitir luz paralela e a face cncava
quando a luz for natural (difusa) ou artificial divergente.
A preparao (objeto) a ser observado deve ter como vimos, uma espessura
reduzida para permitir a transmisso da luz. Cada um de seus pontos funciona como
fonte intensa para a formao de imagens pela objetiva.
A objetiva fornece uma imagem real, ampliada e invertida da preparao,
conforme se pode ver na construo geomtrica da Figura 1. Nessa figura, Ho a
preparao, Hi a imagem formada pela objetiva, F1 e F2 os focos, f a distncia focal
da objetiva e D a distncia entre a objetiva e a imagem. Note que a objetiva foi
considerada, para efeitos didticos, como uma lente simples, apesar de ser, na
realidade, um sistema de lentes. Como veremos adiante, o mesmo foi feito com
relao ocular. Contudo, as relaes obtidas so as mesmas.
Analisando a construo geomtrica da Figura 1, pode-se tirar a relao:
Hi = D - 1
Ho f

De onde se conclui que a distncia focal e o poder de ampliao de uma

objetiva so inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a distncia focal
da objetiva, maior ser seu poder de ampliao (maior o Hi).
A imagem fornecida pela objetiva ser novamente ampliada pela ocular,
funcionando essa imagem, portanto, como "preparao" ou "objeto" para a ocular.
Assim, esta lente fornecer uma imagem virtual, ampliada e direta dessa imagem j
formada pela objetiva, como se pode ver na Figura 2. Nessa figura temos tambm que
o Ho a preparao (no caso a imagem formada pela objetiva), Hi a imagem formada
pela ocular, F1 e F2 os focos, f a distncia focal e D a distncia entre a lente e a
imagem.
Analisando-se a construo geomtrica da Figura 2, temos:
Hi = D + 1
Ho

De onde se conclui que, similarmente objetiva, a distncia focal e o poder de

ampliao da ocular so inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a
distncia focal de uma ocular, maior ser seu poder de ampliao.
Na Figura 3 podemos observar a marcha dos raios luminosos em um
microscpio fotnico, desde a preparao at a formao de imagem virtual da
ocular e convertida em imagem real na retina do observador.
Nessa figura existem alguns parmetros considerados importantes. Um deles
a distncia de trabalho, que simplesmente a distncia entre a preparao e a lente
frontal da objetiva. No caso, quanto maior for o aumento da objetiva (menor distncia
focal), menor ser a distncia de trabalho.
Um outro parmetro a regio crtica, que a regio onde devem ser
formadas as imagens fornecidas pela objetiva, para que a ocular possa torn-las
virtuais e ampliadas e situadas a uma distncia que no pode ser menor que a d
(distncia mnima de viso distinta).
O comprimento ptico simplesmente a distncia entre os focos da objetiva e
da ocular.
- Poder de Resoluo
O poder de resoluo de um microscpio fotnico ou outro instrumento ptico
qualquer, pode ser definido como a capacidade que este sistema possui de formar
imagens distintas e ntidas de dois pontos situados muito prximos em uma
preparao. O limite mximo de resoluo terico aproximadamente a metade do

comprimento de onda da fonte luminosa. Como o microscpio fotnico usa luz

visvel (4000 a 7000 ou 400a

700 nm), o mximo de poder de resoluo deste

aparelho estaria em torno de 2000 (ou 200 nm).

- Abertura Geomtrica de uma Objetiva
um parmetro que caracteriza uma objetiva, sendo definido como o ngulo
mximo formado pelos raios luminosos extremos que partem de um ponto da
preparao, situado sobre o eixo ptico, atingindo os bordos da lente. Na Figura 4:
ag = 2
- Objetivas de Imerso - Abertura Numrica de uma Objetiva
Para se aproveitar uma maior quantidade de luz quando a objetiva de grande
aumento e, portanto, de pequeno dimetro e sendo utilizada a uma distncia de
trabalho muito pequena, trabalha-se com a lente frontal imersa em um lquido de alta
refringncia, em geral leo de cedro (ndice de refrao de 1,575). Com o emprego
deste leo, pode-se fazer convergir o feixe luminoso proveniente do condensador,
captando-se aqueles raios luminosos que, com objetivas secas, seriam perdidos.
Estas objetivas so denominadas de objetivas de imerso. A conseqncia direta do
emprego dessas objetivas o aumento da luminosidade.
Como o ndice de refrao do lquido de imerso (n) altera a distncia de
trabalho e, consequentemente a abertura geomtrica da objetiva, foi criado um novo
parmetro que a abertura numrica. Este parmetro, normalmente impresso no
prprio suporte metlico da objetiva, definido como (Figura 5):
an = n . sen
Onde n = ndice de refrao do meio
= metade da abertura geomtrica
No caso de uma objetiva seca, no existe leo, e o ndice de refrao (n)
corresponder ao do ar que 1. Portanto:
an = sen

Poder Penetrador
a capacidade que tem uma objetiva de permitir a observao simultnea de
pontos situados em diferentes nveis de preparao. Pela Figura 6 pode-se verificar
que a distncia entre as imagens dos planos extremos da preparao, com objetivas
de pequena distncia focal (F2) bem maior do que com objetivas de grande
distncia focal (F1). Assim, podemos concluir que quanto maior for o aumento da
objetiva (e menor sua distncia focal), menor ser seu poder penetrador.
II. EXAME A FRESCO E COLORAO VITAL
1. EXAME A FRESCO
O exame a fresco um mtodo muito simples, consistindo na observao ao
microscpio de clulas, pequenos organismos vivos ou fragmentos de tecidos vivos,
num meio lquido o mais prximo possvel do meio natural desses organismos.
A finalidade desse mtodo permitir a observao de estruturas "in vivo", de
modo a poder observar manifestaes funcionais, como a ciclose, reaes a
estmulos, etc., alm de ser importante na contraprova de outros mtodos de estudos
de estrutura celular que utilizem o estudo de clulas mortas.

Para que a clula sobreviva o maior tempo possvel, necessrio o uso de lquidos
chamados conservadores fisiolgicos que so solues que proporcionam s
clulas que esto sendo observadas condies as mais aproximadas possveis do
seu ambiente natural. Isso possibilita um exame mais prolongado.
Podemos classificar os lquidos conservadores em naturais e artificiais:
(a) Lquidos

naturais:

gua

doce

(organismos aquticos), gua do mar (para

organismos marinhos), humor aquoso (do globo

ocular

de

bovinos), soro

sangneo (tcnicas de cultura de tecido), lquido amnitico, lquido asctico

(obtido de processos patolgicos), etc.
(b) Lquidos artificiais:
- Soro Fisiolgico
NaCl em gua - 0,9% para mamferos
0,8% para anfbios
0,6% para insetos
- Lquido de Ringer
Cloreto de sdio
Cloreto de potssio
Cloreto de clcio
Bicarbonato de sdio
gua destilada
- Lquido de Knop - para rgos e tecidos vegetais.
- Lquido de Tyrode - para hematologia.
(Esses ltimos, alm dos sais acima, levam em sua composio magnsio, glicose, etc.).

A grande vantagem desse mtodo no produzir modificaes nem na forma

nem na funo do objeto examinado, servindo portanto de contraprova para outros
mtodos. Outra vantagem a sua rapidez.
O emprego do exame a fresco est restrito dentro de estreitos limites: s se
aplica a objetos finos e transparentes; no permite observaes prolongadas e
mostra apenas uma pequena parte dos detalhes das estruturas. , portanto,
relativamente grosseiro e leva eventualmente morte celular.
O exame a fresco pode ser feito entre lmina e lamnula, utilizando-se lquidos
fisiolgicos. O condensador deve ser abaixado nos microscpios comuns ou a
observao deve ser feita em fase. Se for necessrio, para evitar o esmagamento (por
exemplo para visualizar o movimento de protozorios), deve-se

suspender a

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lamnula entre quatro pilares de cera, ou utilizar o mtodo da gota pendente, que tem
a vantagem de criar uma micro-cmara mida para observaes mais prolongadas.
Consiste na utilizao de uma lmina escavada com uma lamnula contendo uma
pequena gota de material nessa regio. A gota deve ficar suspensa. A cmara assim
construda pode ser vedada com parafina.
2. COLORAO VITAL
O mtodo da colorao vital constitui um procedimento intermedirio entre a
observao a fresco e a observao aps a fixao. Constitui-se o uso de corantes
no txicos que permitem que as clulas continuem vivas, embora penetrem
facilmente no organismo.
Corantes vitais
- Azul de Metileno - para observao, por exemplo, de protozorios entre lmina e
lamnula.
- Vermelho Neutro.
- Verde Janus - cora mitocndria.
- Carmin Ltico.
Esses corantes se empregam em grandes diluies, de 1:500 at 1:100.000,
variando a diluio para cada corante e para cada uso, por exemplo, se destinar a ser
injetado, ou se, simplesmente, o organismo for mergulhado no corante.
Esses corantes no reagem quimicamente com nenhuma estrutura celular. A
colorao vital se processa apenas por atrao eletrosttica entre o corante e a
estrutura.
Demonstrar a existncia real dos diversos elementos morfolgicos revelados
pelos materiais fixados. , entretanto, uma tcnica limitada pelo pouco detalhe de
estrutura que fornece.

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III. FIXAO
Os mtodos de exame a fresco do apenas informaes insuficientes sobre a
clula viva porque os elementos que a constituem possuem mais ou menos o mesmo
ndice de refrao, o que de certo modo resolvido pelo microscpio de contraste de
fase ou outras montagens pticas especiais.
Um pedao de tecido cortado de um organismo no mantm sua estrutura, ao
nvel microscpico, por causa principalmente da:
. evaporao
. diferenas osmticas
. ataques de microorganismos
. autlise (auto digesto das clulas pelas suas prprias
enzimas ativadas pela cessao da atividade metablica
vital e normal das clulas).
Para estudar a estrutura da clula necessrio proceder colorao,
suprimindo com a cor a falta de contraste das clulas. A colorao muito limitada e
quase impossvel no estado vivo, por isso necessrio matar as clulas para se
proceder colorao.
A fixao uma operao destinada a matar as clulas, conservando-as o
mais prximas possvel do seu aspecto quando vivas. O fixador, portanto, deve
imobilizar a clula, conservar exatamente todas as suas partes constituintes e no
fazer aparecer novos detalhes de estrutura (artefatos). Desse modo ser possvel ao
pesquisador utilizar corantes txicos, fazer testes histoqumicos que raramente so
aplicveis a clulas vivas, manter preparaes permanentes, cortar os tecidos em
seces finas, para o estudo da estrutura intracelular e principalmente das relaes
intercelulares.
No existe um fixador absolutamente perfeito; portanto, o melhor fixador ser
aquele que apresentar o menor nmero possvel de modificaes secundrias no
tecido analisado. Um tecido bem fixado mostrar clulas bem preservadas,
permitindo a visualizao de detalhes de sua estrutura fina.

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- A Qualidade dos fixadores

1) Poder de Penetrao: o fixador deve penetrar rapidamente tanto nas camadas
superficiais como nas profundas; de outro modo, as camadas internas podero se
necrosar antes de serem atingidas por ele.
2) Deve alterar os constituintes da clula, de modo a torn-los insolveis: esta ao
no deve ser violenta e instantnea; ao contrrio, deve-se produzir secundariamente
em relao morte das clulas, de modo a no produzir contraes.
3) A acidez uma qualidade importante, sendo o cido actico um dos mais
empregados. O meio alcalino dificulta a coagulao, nos fixadores que agem desta
maneira.
Em resumo, o bom fixador deve: favorecer a observao das estruturas; impedir o
aparecimento de alteraes; impedir o aparecimento de estruturas artificiais; no
impedir coloraes posteriores; aumentar a afinidade do tecido pelos corantes;
impedir o desaparecimento dos elementos solveis e possuir alto poder de
penetrao.
Agentes Fixadores
Podem ser Fsicos e Qumicos
Fsicos
O frio no , em geral, um bom agente fixador, no mximo ele suspende as
alteraes devidas necrose e digesto enzimtica. Alm disso, a formao de
cristais e o aumento de volume dos lquidos com o congelamento acarretar
distores no material.*
O calor exerce uma ao bem diferente, segundo seja aplicado a objetos
midos ou secos. Os fixadores em ebulio so utilizados para certos casos. O calor
seco tem uso em esfregaos previamente desidratados, podendo, entretanto,
provocar distores.

Empregado juntamente com agentes crioprotetores (como o glicerol),

que impedem a formao de cristais, muito utilizado em exames
citolgicos rpidos como, por exemplo, em patologia.
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Qumicos
So preferveis para o estudo dos tecidos. Podemos classific-los de modo a
reuni-los em dois grandes grupos de acordo com seu efeito sobre as protenas (o que
pode ser testado com uma soluo de albumina).
1) Coagulantes - agem como o calor, coagulando as protenas, transformando o
protoplasma celular numa rede. Ex.: metanol, etanol, acetona, cido ntrico, cido
pcrico, etc.
2) No coagulantes - ex: cido actico, formaldedo, tetrxido de smio e dicromato
de potssio.
Esses

agentes

fixadores,

entretanto,

no

so

capazes

de

reunir,

individualmente, todas as qualidades necessrias para um bom fixador. raro,

portanto, que se empregue, hoje em dia, um fixador nico. Utilizam-se, isso sim,
misturas de fixadores de maneira a que um componente complete a ao do outro.
Algumas das misturas fixadoras mais usadas:
(a) Bouin - cido pcrico, formalina e cido actico glacial. Trata-se de um fixador
extremamente penetrante, que praticamente serve para todas as espcies de
trabalho.
(b) Zenker - dicromato de potssio, cloreto de mercrio e sulfato de sdio. Esse
fixador apresenta o inconveniente de exigir uma lavagem cuidadosa do material
por tempo prolongado.
(c) Carnoy - cido actico, metanol e clorofrmio. Usado em citogentica.
A fixao qumica normalmente realizada imergindo-se a pea a ser estudada
no fixador. O volume deve ser 20 a 30x da pea a ser fixada. Para peas de grande
tamanho, til usar-se o mtodo da perfuso, que consiste em injetar o fixador
atravs da rede vascular do organismo.

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IV - COLORAO
Os processos de colorao tm um papel importante na tcnica histolgica.
Uma boa parte do conhecimento a respeito dos corantes devida a Otto Witt que em
1876 apresentou uma teoria sobre a colorao. Segundo Witt a cor condicionada
por certos grupos ou radicais que ele chamou de cromforos. De acordo com as
idias atuais, esses seriam constitudos por conjuntos de tomos no saturados,
responsveis pela cor das molculas das quais eles fazem parte. Em sua maioria so
substncias aromticas que tm a possibilidade de alterar rapidamente a
configurao da molcula entre os vrios estados possveis, sendo essas alteraes
denominadas ressonncia, envolvendo a absoro de ondas eletromagnticas.
As substncias que possuem um ou vrios cromforos so chamadas
cromognios. Dito de outro modo, os cromforos so grupamentos atmicos que
do a potencialidade de colorao s molculas que so ento chamadas de
cromognios.
Um exemplo de cromforo a quinona. A quinona por si s no tem a
tendncia a se ligar a uma substncia de uma preparao microscpica, pois as
substncias que apresentam essa tendncia se ionizam em soluo aquosa e a
quinona no. Portanto, no basta somente que a substncia tenha cor, isto , um
cromforo por si s no confere molcula a capacidade tintorial. Um grupo
ionizvel tambm necessrio. Esses grupos ionizveis que transformam
substncias coloridas em corantes so denominados auxocromos. Alm de
geralmente conferir o poder tintorial, os auxocromos aumentam a intensidade da cor,
como seu nome sugere. Um dos auxocromos mais comuns em corantes o grupo NH2, grupo amida.
Tintforos por outro lado, so grupos que no modificam o espectro de
absoro e, portanto, a colorao de um cromognio, mas fazem aparecer o poder
tintorial, agindo nesse sentido da mesma forma que os auxocromos.
Dentre os radicais que agem como tintforos, temos por exemplo o grupo
carboxila, -COOH.
A finalidade da colorao no a obteno de uma imagem de diversos
coloridos, mas acentuar os contrastes das estruturas celulares.

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Classificao dos Corantes

Os corantes podem ser classificados, de acordo com sua origem, em naturais
e artificiais (ou sintticos).
A) Naturais - produtos extrados de animais, como o carmin, ou dos vegetais, como a
hematoxilina, a orcena, etc.
B) Artificiais ou sintticos - derivados da destilao da hulha e, genericamente
conhecidos como corantes

de anilina. Do ponto de vista qumico, esses

corantes so sempre sais, podendo assim ter carter cido, bsico, neutro ou
indiferente.
(a) Corantes cidos:
Nesses corantes a base incolor e o cido colorido (cromforo). Temos por
ex.: a Eosina em que a propriedade do corante devida ao cido eosnico; na parte
bsica, temos o sdio que incolor. Outros exemplos: Fucsina cida, Vermelho
congo, Eritrosina. Tingem o citoplasma, a quitina, etc., de reao bsica (acidfilos).
(b) Corantes bsicos:
Possuem a base colorida e o cido incolor. Temos por exemplo, o azul de
metileno, que um cloridrato de azul de metileno; o poder do corante devido ao
composto bsico de azul de metileno e no ao cido clordrico que a parte incolor.
Outros exemplos: Fucsina bsica, Azul de Toluidina, Violeta de Genciana. So
corantes absorvidos com certa avidez pelas estruturas celulares de reao cida
(basfilas) como a cromatina.
(c) Corantes neutros:
Tanto o cido como a base so coloridos. Ex.: o Eosinato de Azul de Metileno.
Esses corantes se obtm misturando partes convenientes de corantes cidos e
bsicos e tm grande importncia em estudos hematolgicos.
(d) Corantes indiferentes:
No so nem cidos nem bsicos e so incapazes de formar sais. So
insolveis em gua, mas solveis em lcool e nos lipdios. So desse grupo os
corantes de lipdios Sudan III e Vermelho Escarlate.

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- Mordente
Uma colorao pode ser direta ou indireta, dependendo do fato de haver ou
no uma substncia intermediria entre o corpo a ser colorido e o corante.
Os sais de certos metais alteram radicalmente o comportamento de certos
corantes. Esses sais metlicos so chamados mordentes. Forma-se um complexo
tecido-mordente-corante e, uma vez formado, ele insolvel em todos os fluidos
neutros usados ordinariamente em histologia, de modo que facilita os procedimentos
posteriores. O mordente provoca uma combinao qumica entre dois corpos que
no tm afinidade qumica entre si. Forma-se ento o precipitado fortemente colorido
e insolvel em gua.
Exemplo: os almens que, em geral, so sulfatos duplos de alumnio e outro
metal, tm a propriedade de formar, com certos corantes, solues intensamente
coloridas e com propriedades seletivas.
- Marcha de Colorao
Colorao Progressiva - nesse tipo de colorao, a absoro do corante pelas
clulas controlada e interrompida no ponto desejado.
Colorao Regressiva - nesse caso, h um exagero de absoro do corante,
ou super colorao que, em seguida deve ser extrado novamente. A diferenciao
consiste na remoo do excesso de colorao at que o corante fique retido apenas
pelos componentes celulares ou tissulares que interessam ao estudo. Pode ser
obtida pelo emprego do lcool etlico puro ou acidificado, por exemplo.
Tipos de Colorao
Ortocromtica - quando o tecido aparece corado nas cores do prprio corante.
Metacromtica - quando o tecido aparece com cor ou cores diferentes das do
corante. Ex.: Azul de Toluidina, entre pH 4,5 e 5,0 cora o DNA em azul e o RNA em
vermelho.

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V. INCLUSO E MICROTOMIA
A maior parte das peas fixadas dever ser tratada posteriormente, de modo a
permitir sua observao por meio da luz transmitida.
Para isso, preciso reduzi-la a fatias delgadas, obtidas por cortes. Esses
cortes, com espessura de 3 a 4 m so impossveis de obter em tecidos frescos ou
mesmo fixados. Desse modo, faz-se a incluso da pea numa substncia plstica que
permita a obteno de seces finas do tecido. A substncia deve penetrar
totalmente at os componentes celulares mais delicados, de modo a preservar a
estrutura fina.
possvel ento orientar e manusear as peas.
- Meios ou Massas de Incluso
1) Meios aquosos - no necessrio, neste caso, desidratar as peas. Utilizados
principalmente para pesquisas de fisiologia celular e histoqumica ou anatomia
vegetal.
- gelatina glicerinada: para organismos delicados;
- goma (arbica) glicerinada: para objetos duros e quitinosos, como pelos de
mamferos, por exemplo.
2) Meios anidros - so muito comuns nos estudos gerais de Histologia. Utilizam
produtos de incluso insolveis em gua, sendo, portanto, imprescindvel a
desidratao da pea, uma vez que a gua parte integrante dos tecidos. Aps a
desidratao, impregna-se a pea com o solvente do meio de incluso.
(a) Celoidina
Nesse caso, feita a impregnao a frio dos objetos com nitrocelulose
dissolvida numa mistura de lcool e ter. O uso dessa massa de incluso permite
executar cortes de grandes dimetros, sem riscos de quebras, como ocorre com a
parafina. conveniente para objetos pouco homogneos ou que apresentam grandes
cavidades, para materiais duros ou fibrosos (artrpodos, por ex.), ou para tecidos
que suportam mal as elevaes de temperatura. No h necessidade de remover a
celoidina dos cortes, o que facilita o manejo. Entretanto, um processo muito
demorado (pode levar meses), sendo muito difcil obter cortes finos, e quase
impossvel obt-los em srie. A conservao dos blocos difcil e necessrio o uso
de um micrtomo de deslizamento, especial, que molha automaticamente o bloco e a
navalha com lcool 70, medida que vai cortando.

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(b) Incluso em parafina

A parafina uma mistura de hidrocarbonetos saturados slidos extrados por
resfriamento dos resduos pesados do petrleo. Tem pouca afinidade (parum affinis)
qumica (inerte). muito solvel no xilol, sendo entretanto insolvel no lcool e na
gua.
As vantagens da parafina consistem em permitir a obteno de cortes finos; o
processo de incluso rpido (24 horas); possvel obter cortes seriados pela
facilidade de produo de fitas; os blocos podem ser guardados indefinidamente.
Existem, tambm, algumas, como por exemplo, tecidos de difcil penetrao,
tais como ossos, dentes, etc. Estes tecidos necessitam de longo tempo de incluso,
o que desaconselhado, pois este processo extrai lipdeos, uma vez que os agentes
de diafanizao e desidratao so solventes de lipdios.
(c) Incluso em resinas plsticas - particularmente as resinas acrlicas tm sido cada
vez mais empregadas em histologia no lugar da parafina, principalmente por
permitirem cortes mais finos (1-3 m) e, portanto, com melhor definio das
estruturas celulares.
- Procedimento para a incluso em parafina
1) Desidratao pelo lcool - com durao varivel, de acordo com o tamanho da
pea.
2) Impregnao em solvente de parafina - consiste em trocar por um solvente de
parafina o lcool que impregna o objeto desidratado. Essa operao chamada
diafanizao, uma vez que os lquidos utilizados tornam o material transparente.
Os lquidos devem ser solveis em lcool em todas as propores. O xilol
bastante utilizado neste procedimento.
3) Impregnao em parafina - no pode ser feita a frio, uma vez que a parafina
slida temperatura ambiente. Durante a impregnao, a parafina deve ser
mantida na estufa, prxima a seu ponto de fuso (aproximadamente 60oC).
4) A pea agora retirada do banho de parafina e levada para uma forma vaselinada
cheia de parafina fundida. A pea deve ser orientada. A parafina se solidifica
rapidamente, de modo que a orientao do corte fica fcil. Esfria-se rapidamente a
parafina, de modo a no formar cristais de grande tamanho ou bolhas.
Quando o processo bem feito, pode-se guardar o material indefinidamente.

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 Corte dos blocos - usa-se um micrtomo automtico que regula a espessura dos
cortes, aderindo-se uns aos outros, de modo a se obter uma fita. As fitas so
fceis de manipular, com o auxlio de um pincel e se pode obter cortes em srie
(cortes seriados).
Montagem dos cortes - os cortes so esticados em gua aquecida a 40oC e
"pescador" com uma lmina albuminizada com o auxlio de um pincel o excesso
de gua escorrido e os cortes secos em estufa a 40oC. Posteriormente a
parafina retirada das preparaes, banhando-se as lminas em xilol.
- Colorao dos cortes com hematoxilina-eosina (HE)
Para se fazer a colorao do material (esfregao de mucosa bucal, por ex.),
este precisa ser hidratado de maneira lenta atravs de uma srie de lcoois em
concentraes cada vez menores. A razo disto que os corantes so aquosos. Para
montagem permanente, o material precisa ser diafanizado pelo xilol e montado em
Blsamo do Canad (ver mais abaixo). Assim, o xilol age como diafanizador e
tambm como solvente do blsamo. Uma vez que o xilol no miscvel em gua (nem
o blsamo), o material deve ser desidratado novamente. Se o xilol ficar turvo, ou
aparecerem bolhas de gua na preparao, porque o material no foi
convenientemente desidratado.
Montagem permanente - consiste em colocar o objeto entre lmina e lamnula, em
um lquido refringente, que servir de meio de conservao e meio de observao.
Esse meio deve se tornar slido posteriormente.
O meio de montagem deve ter ndice de refrao prximo ao do vidro, deve
secar rapidamente, no rachar, nem se alterar. Os meios de montagem mais usados
so o Blsamo do Canad, resina proveniente de conferas da Amrica do Norte
(sendo que o material, nesse caso, deve estar totalmente desidratado), o Euparal que
tem a desvantagem de no secar muito rapidamente e o Permount que seca
rapidamente.
Alm dos processos de incluso acima discutidos, existem outros mtodos
que permitem o corte do material biolgico a ser estudado ao microscpio de luz. Um
destes mtodos envolve, por exemplo, o congelamento do material em nitrognio
lquido e seu corte posterior em um micrtomo refrigerado denominado de criostato.
Em mtodo rpido, muito til em patologia quando, por exemplo, se necessita de
uma anlise imediata de um tecido. Para determinados tipos de material que tenham
uma certa consistncia possvel fazer ainda cortes a mo livre, com resultados
razoveis. o caso de alguns tipos de tecidos vegetais, como caules e folhas.

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