Gnie gntique

(anne universitaire 2014/2015)

Enseignant responsable de la matire : Pr, KITOUNI Mahmoud

Objectifs de lenseignement
Faire

comprendre

les

multiples

applications

de

ces

microorganismes et leurs applications biotechnologies. .

techniques

chez

les

Contenu de la matire

1. Introduction au Gnie Gntique

- transferts des gnes entre organismes
- profils de restriction modification et dcouverte des enzymes de restriction
- potentialits du gnie gntique

2. Principes gnraux du gnie gntique

2.1-. lments ncessaires au clonage
- lADN cloner
- les enzymes de restriction : leur dnomination et leurs proprits

- les vecteurs de clonage, leur construction et leurs caractristiques

(les vecteurs plasmidique,
cosmidiques)

les vecteurs phagiques, les vecteurs

- les cellules hte : - mthodes de transformation et transfection

2.2. Les tapes du clonage - construction du vecteur
- insertion de lADN cloner
- slection des recombinants

- mise en vidence des recombinants

- mise en vidence des gnes clons grce aux vecteurs plasmidiques
- mise en vidence des gnes clons grce aux vecteurs phagiques

3.- Applications et potentialits du gnie gntique

- production de protine par la bactrie E. coli. ,
- production par la levure Saccharomyces cerevisiae,

- production de linsuline sur E.coli trangnique

Gnie gntique
I. DFINITION

Lexpression gnie gntique ou la technologie de lADN recombinant sapplique la

recombinaison de lADN in vitro, puis au transfert de lADN recombinant dans un
hte appropri qui en assure sa rplication, voir son expression.

Gnie gntique
II. OBJECTIFS
Le gnie gntique principalement trois buts :
1- Obtenir de grande quantits dun ou plusieurs gnes pour en analyser la squence,
lorganisation, la rgulation, etc
2- Obtenir grande chelle lexpression dun gne dont le produit est particulirement
interessant (enzyme, hormone, antigne pour vaccin, etc.
3- Modifier le phnotype dun organisme vivant (cellule, animal, vgtale, virus) en leur
insrant un gne provenant dun autre organisme.

Gnie gntique
III. APPLICATIONS
- Production de vaccins vivants
- Production de plantes rsistantes des insectes ou des pesticides
- Production danimaux transgniques comme modles de maladies humaines
- Thrapie gnique

Gnie gntique
III. METHODOLOGIE
Le clonage de gnes est la base du gnie gntique. Il implique :
- Lisolement et la fragmentation de la source de lADN et linsertion des fragments dADN
dans un vecteur (plasmides, ADN de phages ou de virus etc.)

- Lincorporation de lADN recombinant dans une cellule hte capable dassurer la rplication
du vecteur
- La dtection et lisolement du clone cellulaire contenant le gne intressant

Gnie gntique
Isolement d'ADN
provenant de
deux sources

Les diffrentes tapes en

gnie gntique

Gnie gntique

Les diffrentes tapes en

gnie gntique

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Conjugaison

Campbell, Biologie DeBoeck Universit (1995) p359

Le mle dE. coli montre des pili, dont un pilus sexuel qui se joint une cellule
femelle . Le pilus sexuel tubulaire tablit une jonction cytoplasmique travers
laquelle le mle transmettra de lADN la femelle .

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Conjugaison
Pont cytoplasmique
permettant
lchange de
matriel gntique

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Conjugaison
Bactrie donatrice

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21942/#A1314
Chromosome
bactrien
Pont de
conjugaison

Plasmide
Pilus
Bactrie rceptrice
Le schma montre un transfert en cours : passage d'un monobrin avec rplication chez le donneur
et l'accepteur. Il ne montre pas le rsultat final : la bactrie donatrice reste F+ et la receveuse
devient F+ (le monobrin qui passe et se rplique est recircularis en plasmide F complet,
fonctionnel).

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Transduction
Figure 17.1
Virus injectant son ADN dans une
bactrie. Ce schma reprsente la premire
tape de lun des phnomne biologiques les
plus remarquables : lassujettissement
gntique dune cellule par un Virus.
Linfection dbute lorsque le Virus injecte son
ADN dans la cellule hte. Dans le cas
prsent ici, la cellule est la Bactrie E. coli
et le Virus est un Bactriophage T4. Cest en
tudiant les Virus et les Bactries que les
biologistes ont entrevenu pour la premire
fois la subtilit des mcanismes molculaires
de lhrdit.

Campbell, Biologie DeBoeck Universit 1995 p344

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Transduction

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Transduction

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Transformation

Binding
DNA
(a)

(b)
Uptake of DNA

RecA-mediated
homologous
recombination
(d)

(c)

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie

Enzymes agissant sur les acides nucliques

La polynuclotide kinase, la terminal transferase, la phosphatase alcaline, la DNA
polymrases, la reverse transcriptase, la RNA polymrases, la poly(A) polymrase,
la DNA ligases, la RNA ligase, la topoisomrase, les enzymes de restriction, les
ribonuclases (A, T1, H), les dsoxyribonuclases, la protinase K, la galactosidase.

Gnie gntique
Dveloppement du gnie gntique
Le gnie gntique sest dvelopp grce aux progrs raliss dans les domaines
de la microbiologie et de lenzymologie
Enzyme de
restriction
EcoR1

Enzyme de
mthylation
EcoR1

ADN tranger
non mthyl

5
3

GAATTC
CTTAAG

5
3

3
5

Hydrolyse
Enzyme de
restriction
EcoR1

Extrmit cohsives
5
3

AATTC
G
CTTAA

(a) : Restriction

ADN de lhte
non mthyl
GAATTC
CTTAAG

3
5

Lenzyme de restriction
EcoR1 ne peut pas cliver
lADN mthyl
CH3

3
5

5
3

GAATTC
CTTAAG
CH3

(b) : Modification

3
5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
- Les endonuclases de restriction sont des enzymes bactriennes participant un
mcanisme de dfense des bactries vis--vis des virus : systme de restrictionmodification.

- Elles catalysent la coupure de lADN non mthyl en des endroits caractriss par
une squence spcifique de nuclotides (site de restriction). Les produits de cette
digestion sont les fragments de restriction, dont la longueur, toujours la mme pour
un ADN donn, ne dpend que de la squence primaire de cet ADN.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Il existe trois types isols des bactries
Type II
Gnie gntique

Type 1

Type III

Exemple

EcoB

Les enzymes de restriction

EcoRI

EcoPI

Site de reconnaissance

TGAN8TGCT

GAATTC

AGACC

Site daction (clivage)

Environ 1kb aprs le

site de reconnaissance

Entre G et A
24-26 pb 3 au site
(des deux brins) de reconnaissance

TGAN8TGCT
ACTN8 ACGA

GAATTC
CTTAAG

AGACC
Un seul brin
mthyl

Non

Oui

Site de mthylation

Nuclase et mthylase sur la Oui

mme enzyme
Besoin pour le clivage

ATP, Mg2+, S-AdoMet

Mg2+, Mn2+

Mg2+, S-AdoMet

Besoin pour la mthylation

ATP, Mg2+, S-AdoMet

S-AdoMet

Mg2+, S-AdoMet

S-AdoMet : S-adnosyle-mthionine

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
- Lanalyse de la longueur des fragments de restriction, la recherche de variations
individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est
une des techniques danalyse de la squence primaire de lADN la recherche
de substitutions, dinsertions ou de dltions qui modifient le nombre de sites de
restriction et donc la longueur des fragments de restriction.

- Le type II est le plus utilis car le site de reconnaissance est lui-mme le site de
coupure,

- Les extrmits des fragments de restriction peuvent tre formes de deux brins
dgale longueur (bouts francs) ou bien prsenter un brin plus long que lautre de
quelques nuclotides (bouts collants).

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
bouts francs

bouts collants
(cohsifs)

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Nomenclature des enzymes de restriction

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Nomenclature des enzymes de restriction
- Les enzymes de restriction sont des hydrolases (classe 3 de la E.C.) agissant sur des
liaisons esters (sous-classe 3.1), cest--dire des estrases.
- Parmi les estrases on distingue celles qui hydrolysent un acide nuclique en
fragments polynuclotidiques (endonuclases) et en particulier celles dont les produits
gardent leur phosphate 5 initial (sous-sous-classe 3.1.21).
- Enfin en fonction des cofacteurs, les enzymes de restriction ne ncessitent que la
prsence de lion Mg++ dans le milieu (3.1.21.4)
- Le nom de chaque enzyme est driv du nom despce ou de varit de la Bactrie qui
la produit. On crit linitiale du nom du genre, les deux initiales du nom de lespce, 1
lettre ou 1 nombre pour dsigner la varit (ou souche) et aprs un espace un chiffre
romain pour dsigner successivement les diffrentes enzymes de restriction obtenues
partir de la mme souche.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Restriction (raction gnrale)
Substrat
(ADN)

Produit
(ADN digr)

- La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction implique la prsence

dans le milieu ractionnel des facteurs suivants :
Enzyme
Substrat : ADN double brin non digr
Produit : ADN double brin digr
Cofacteurs

- En gnral, seul le Mg++ est indispensable. Quelques endonuclases font appel

dautres cofacteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzyme la S-AdnosylMthionine (S-AdoMet).
- Des facteurs physiques contrlent aussi ces ractions : pH, potentiel
doxydorduction, force ionique. Lnergie libre dgage par lhydrolyse est
suffisamment importante pour que la raction ne soit pratiquement pas
rversible dans les conditions habituelles.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Tampons dincubation (restriction)
- Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettant
loptimisation des ractions de multiples enzymes avec le mme tampon.
- Toutes les enzymes de restriction ncessitent la prsence de lion Mg++
- Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel doxydo-rduction (dithiothritol 1 mM), la force
ionique (NaCl ou CH3COOK de 0 100 mM) varient dun tampon lautre.

- De rares enzymes ncessitent des conditions spciales prcises par leur mode
demploi.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Tampons dincubation (restriction)
10 mM Tris propane-HCl
(pH 7,0 25 C)
10 mM MgCl2
(1 mM DTT)

10 mM Tris-HCl
(pH 7,9 25 C)
10 mM MgCl2
50 mM NaCl
(1 mM DTT)

10 mM Tris-HCl
(pH 7,9 25 C)
10 mM MgCl2
100 mM NaCl
(1 mM DTT)

20 mM Tris-CH3COOH
(pH 7,9 25 C)
10 mM Mg(CH3COO)2
50 mM CH3COOK
(1 mM DTT)

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
EcoR I
NNNNGAATTCNNNN

2H2O Mg++

NNNNCTTAAGNNNN

NNNNG
NNNNCTTAA

ADN double brin

AATTCNNNN
GNNNN

ADN digr

- EcoR I est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.
- Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
EcoR I
- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie
du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les
fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
- La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent la
reconnaissance du site par EcoR I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas
hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
EcoR V
Mthylation (-)
NNNNGATATCNNNN

2H2O Mg++

NNNNCTATAGNNNN

NNNNGAT
NNNNCTA

ADN double brin

ATCNNNN
TAGNNNN

ADN digr

- EcoR V est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R.
- Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 GATATC 3
3 CTATAG 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
EcoR V
- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du
palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui
en rsultent sont dits bouts francs .

5 GATATC 3
3 CTATAG 5
- La mthylation des adnines du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site
par EcoR V. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN
parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
Pvu II
Mthylation (-)
NNNNCAGCTGNNNN

2H2O Mg++

NNNNGTCGACNNNN

NNNNCAG
NNNNGTC

ADN double brin

CTGNNNN

GACNNNN

ADN digr

- Pvu II est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.

- Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 CAGCTG 3
3 GTCGAC 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
Pvu II
- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du
palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui
en rsultent sont dits bouts francs .

5 CAGCTG 3
3 GTCGAC 5
- La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la
reconnaissance du site par Pvu II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas
hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
Hae III
Mthylation (-)
NNNNGGCCNNNN

2H2O Mg++

NNNNCCGGNNN

NNNNNGG
NNNNNCC

ADN double brin

CCNNNNN

GGNNNNN

ADN digr

- Hae III est une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus.
- Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides :

5 GGCC 3
3 CCGG 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
Hae III
- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du
palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui
en rsultent sont dits bouts francs .

5 GGCC 3
3 CCGG 5
- La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyse inhibe la
reconnaissance du site par Hae III. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas
hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
Pvu I
Mthylation (-)
NNNNCGATCGNNNN

2H2O Mg++

NNNNGCTAGCNNNN

NNNNCGAT
NNNNGC

ADN double brin

CGNNNN

TAGCNNNN

ADN digr

- Pvu I est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris.

- Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 CGATCG 3
3 GCTAGC 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction
Pvu I
- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie
du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les
fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

5 CGATCG 3
3 GCTAGC 5
- La mthylation de la deuxime cytosine proche du site dhydrolyse inhibe la
reconnaissance du site par Pvu I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas
hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction

Pst I
Mthylation (-)
NNNNCTGCAGNNNN

2H2O Mg++

NNNNGACGTCNNNN

NNNNCTGCA
NNNNG

ADN double brin

GNNNN
ACGTCNNNN

ADN digr

- Pst I est une enzyme de restriction produite par Providencia stuartii.

- Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 CTGCAG 3
3 GACGTC 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Exemples denzymes de restriction

Pst I
-

Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie
du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les
fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

5 CTGCAG 3
3 GACGTC 5
- La mthylation de la premire cytosine ou de ladnine du site dhydrolyse inhibent
la reconnaissance du site par Pst I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas
hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys..

Gnie gntique
Alphabet dgnr
Alphabet dgnr du code gntique
A = Adnosine
C = Cytosine
G = Guanine

T = Thymidine

H = non G (A, C ou T)

R = A ou puRine

V = non T (A, C ou G)
D = non C (A, G ou T)

Y = C ou T
pYrimidine

B = non A (C, G ou T)

K = G ou T ctone
(keto en anglais)

S = C ou G 3 liaisons H
(strong en anglais)

M = A ou C aMine

W = A ou T 2 liaisons H
(weak en anglais)

N = A, C, G ou T
Le complment de

ACGT

RY

KM

SW

BDHV N

est

TGCA

YR

MK

SW

VHDB N

Gnie gntique
Alphabet dgnr
- La spcificit large de certaines enzymes ou encore la dgnrescence du code
gntique implique quon doit indiquer quelquefois dans les squences des lettres
correspondant plusieurs bases azotes diffrentes pour le mme nuclotide prsent
une position.
- Le choix peut porter sur deux des 4 nuclotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, C
ou G, A ou T ; ou bien sur 3 nuclotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ;
ou enfin sur les 4 nuclotides : A, C, G ou T.

- Les rgles de complmentarit impliquent videmment une dgnrescence de la

squence de lautre brin en regard dune position dgnre.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Ava II

Mthylation (-)
NNNNGGWCCNNNN

2H2O Mg++

NNNNCCWGGNNNN

NNNNG
NNNNCCWG

ADN double brin

GWCCNNNN

ADN digr

- Ava II est une enzyme de restriction produite par Anabaena variabilis.

- Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides :

5 GGWCC 3
3 CCWGG 5

GNNNN

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Ava II
-

Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin).
Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie
du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les
fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

5 GGWCC 3
3 CCWGG 5
-

La mthylation des cytosines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site

par Ava II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN
parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys..

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Hind II
Mthylation (-)

NNNNGTYRACNNNN

2H2O Mg++

NNNNCARYTGNNNN

NNNNGTY

NNNNCAR

ADN double brin

RACNNNN
YTGNNNN

ADN digr

- Hind II est une enzyme de restriction produite par

souche Rd.

Haemophilus influenzae,

- Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

5 GTYRAC 3
3 CARYTG 5

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Hind II
- Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont
identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque
lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome
toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent
sont dits bouts francs .

5 GTYRAC 3
3 CARYTG 5
-

La mthylation de ladnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site

par Hind II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN
parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

Gnie gntique

Les enzymes de restriction

Digestion dune squence (Hae III)

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Digestion dune squence (Hae III)
- Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Hae III.
- Les apolipoprotines A et B (Apo A et B) sont des lipoprotines fabriques par le
foie, intervenant dans le mtabolisme des lipides (graisses). L'ApoA1 sert au retour
du cholestrol vers le foie o il va tre dtruit : de ce fait, elle est surtout un
marqueur de protection vis--vis des maladies cardio-vasculaires. L'ApoB participe
plutt au transport et aux dpts de cholestrol sur les parois des artres. Elle est
donc un marqueur d'athrosclrose, responsable de maladies cardio-vasculaires
(notamment d'infarctus du myocarde).
- Chacune des squences GGCC engendre une coupure de lADN, ce qui produit des
fragments de restriction dont le longueur dpend de la frquence de cette squence
sur lADN.

Gnie gntique
Les enzymes de restriction
Digestion dune squence (Hae III)

- On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de
restriction).

- La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des
squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en
rsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mme
longueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a un
polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = Restriction
Fragment Length Polymorphism).