PRCTICA 1

COLORIMETRA: ANALISIS ESPECTROFOTOMTRICO DE LA VITAMINA

RIBOFLAVINA
La colorimetra es una de las tcnicas empleadas con mayor asiduidad en los
laboratorios de Bioqumica y otras disciplinas cientficas. Esta tcnica suministra
informacin cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolucin. El colormetro
es un instrumento diseado para dirigir un haz de luz paralela monocromtica a travs
de una muestra lquida y medir la intensidad del haz luminoso emergente.

FUNDAMENTO
La fraccin de luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda
est relacionada con el paso ptico de la cubeta que contiene la solucin y con la
concentracin de la especie absorbente. Estas dos relaciones estn combinadas en la
ley de Lambert-Beer:

Log Io/I = A = C l
en donde Io e I son las intensidades de la luz incidente y emergente respectivamente, l
el paso ptico (cm), C la concentracin molar de la especie absorbente (moles/litro) y
el coeficiente de absorcin molar (M-1cm-1). El trmino Log Io/I se denomina
absorbancia y se designa por A. Fijando el paso ptico (habitualmente 1 cm) resulta
que la absorbancia A es directamente proporcional a la concentracin del soluto
absorbente. El coeficiente de absorcin molar vara con la naturaleza del compuesto
absorbente, el disolvente, la longitud de onda y con el pH.
La aplicacin obvia de la ley de Lambert-Beer es el uso del colormetro para
determinar la concentracin de una gran variedad de molculas que absorben luz
( p.e.
carotenos, clorofila, hemoglobina, etc). La tcnica se extiende a sustancias no
coloreadas como azcares o aminocidos despus de alguna reaccin capaz de
convertir sustancias incoloras en derivados coloreados.
Los espectros de absorcin, grficos que relacionan absorbancia con longitudes
de onda, son frecuentemente utilizados en Bioqumica para la caracterizacin e
identificacin de biomolculas.
En esta prctica se realizar un sencillo anlisis espectrofotomtrico de la
vitamina riboflavina que consistir en: obtencin del espectro de absorcin y
construccin de una recta patrn para verificar la ley de Lambert-Beer, clculo del
coeficiente y determinacin de la concentracin de riboflavina de en una muestra
problema.

MATERIALES Y REACTIVOS
Tampn fosfato potsico 20 mM pH 7.0 (25 ml)
Disolucin de riboflavina 50 M en tampn fosfato 20 mM pH 7.0 (25 ml)
Colormetro y cubetas desechables
Pipetas automticas
Cmo se preparan estos reactivos?
Cmo funcionan las micropipetas automticas?
Qu son las cubetas desechables
Cmo funciona el colormetro

PROCEDIMIENTO
A) Obtencin del espectro de absorcin de riboflavina:
1. Realizar medidas de absorbancia de la disolucin de riboflavina, tomando una
alicuota de 2 ml, en el intervalo de longitudes de onda () comprendido entre 340 y
510
nm a intervalos de 10 nm.

(nm)
340
350
360
370
380
390
400
410
420

TABLA 1.Absorbancia
(nm)
430
440
450
460
470
480
490
500
510

Absorbancia

B) Construir la recta estndar o recta patrn para la Riboflavina

1. A partir de la disolucin madre de Riboflavina preparar en tubos desechables de 10
ml una serie de 6 disoluciones tal como se indica en la tabla siguiente y medir la
absorbancia de cada uno de los tubos a la longitud de onda en la que se haya
obtenido el mximo de absorcin en el espectro del apartado anterior
Absorbancia
Tubo
nmero
1
2
3
4
5
6
7

TABLA 2.Riboflavina (50 M) Tampn fosfato

mL
(20 mM), mL
0
5
1
4
2
3
3
2
4
1
5
0
Desconocida
(Tubo X)

[Riboflavina]M

RESULTADOS Y ANLISIS DE LOS MISMOS

1. Dibujar en papel milimetrado el espectro de absorcin representando A frente a .
2. Sealar el mximo de absorcin a partir del espectro y calcular para ese valor.
Hay algn otro valor elevado? Cul es el valor de en ese caso?
3. Calcular las concentraciones M de Riboflavina e incluirlas en la ltima columna de
la Tabla 2.
4. Construir la recta patrn representando los valores de Absorbancia obtenidos a la
longitud de onda a la que aparece el mximo de absorcin frente a las concentraciones
de Riboflavina incluidas en la Tabla 2.
5. Determinar por interpolacin en la recta patrn la concentracin de la disolucin de
Riboflavina contenida en el tubo X.

6. Calcular a partir de la recta patrn de Riboflavina.