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Una sonda es un reactivo biolgico constituido por un fragmento de ADN que posee
una secuencia de bases complementaria a la del genoma de un microorganismo. Las
sondas gnicas son molculas de ADN sealadas con un marcador que tienen el poder
de reconocer genes en los cromosomas y establecer si dichos genes son normales o
portadores de alteraciones.
OBJETIVOS
I.- Definicin
La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unir
exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama especificidad
de la sonda.
Es decir, Sonda es una secuencia (fragmento) de ADN monocatenario marcada con
algn isotopo radiactivo o mediante mtodos no radiactivos (como fluorescencia); que se
usa para detectar fragmentos de ADN o ARN con homologa secuencial en la paridad de
bases nitrogenadas especficas (Guanina con Citosina y Adenina con Timina).
Las sondas de cDNA se obtienen a partir de la copia de un mRNA y, por tanto,
corresponden a secuencias codificantes de un gen. Las sondas RNA son copias del RNA
y se obtienen in vitro, mediante la sntesis de una cadena complementaria utilizando una
RNA-polimerasa.
El uso y aplicacin de las sondas gnicas est basado en la aplicacin de la tcnica
citogentica de Hibridacin in situ por fluorescencia (cuyas siglas en ingls la denominan
FISH).
Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La deteccin
solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable. Dependiendo del
nmero de estos grupos incorporados y de la seal que emitan la sonda puede tener
diferente sensibilidad.
II.- TIPOS DE SONDAS
A) Segn el tamao: Se escogen en funcin de la secuencia diana (ADN o ARN) y se
tienen en cuenta la longitud y el tipo de secuencia diana as como el medio de
marcaje y deteccin.
1. Sondas grandes: secuencias de ADN bicatenario de una longitud de 1-4 kb.
Pueden ser genmicas, secuencias con intrones y exones, o de ADNc, sin
intrones, obtenidas a partir de la transcripcin inversa del ARNm.
2. Sondas pequeas: son secuencias monocatenarias de 15-50 nucletidos.
Reciben el nombre de oligonucletidos sintticos. Son de ADN.
3. Sondas intermedias: son de ARN.
B) Tipo de sonda y mtodo de sntesis: Distintos tipos de sondas de cidos
nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridacin in situ:
1. Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando tcnicas
Isotpicos
radioactividad
No isotpicos
no radioactivos
Sistemas
directos
Indirectos
Los sistemas isotpicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente con tritio, as
como alta resolucin. Por otro lado el empleo de radioistopos requieren licencia
especial. El mtodo de deteccin (autorradiografa) requiere un tiempo de
exposicin de semanas.
Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un mtodo cuantitativo.
El marcaje de la sonda se puede dar de 2 formas:
Marcaje radiactivo
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que tengan alguno de sus
tomos con un istopo radiactivo, normalmente 32P, pero tambin es frecuente el uso de
tritio. Este tipo de marcaje es apreciable mediante autorradiografa. El uso de este tipo de
marcaje va a asociado con los peligros que trae el uso de elementos radiactivos, as como
tambin por ser un agente mutagnico este podra llegar a modificar la ultra estructura del
ADN de muestra, razn por la que se desarrolla otro mtodo que es el marcaje
inmunolgico.
Algunos istopos han sido usados para marcajes radiocativos en la hibridacin in situ,
que difieren en cuanto a la resolucin de la seal, la velocidad en obtencin de
resultados y la estabilidad de la sonda.
a)
b)
c)
d)
3
H - proporciona una seal
exposiciones autorradiogrficas.
nivel
subcelular
pero
requiere
largas
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S proporciona resolucin de un dimetro celular, con tiempos de
exposicin de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol (DTT)
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pueden ser incluidos en la solucin que contenga S para proteger al azufre de la
oxidacin. La vida media de este istopo es de 87 das y la marca debe ser usada
en un mes aproximadamente.
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P da una resolucin menor que el S y adems proporciona una baja
eficiencia en la autorradiografa, ofrece una pequea ventaja en cuanto a la
velocidad de obtencin de resultados. Posee una vida media de 14 das.
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P da una resolucin similar a S, pero ste tiene una vida media ms corta
(25 das) y el costo es mayor.
Marcaje no radioactivo
Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una molcula
(digoxigenina), a la solucin se le aaden anticuerpos especficos que se unen a
esa molcula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o
fluorescente (como fluorforos o fluorocromos: fluorescena, rodamina) que deja
impronta fotogrfica.
Existen dos tipos de sistemas no isotpicos para la prueba de hibridacin: directo e
indirecto.
El mtodo directo, la molcula detectable (reportera) es enlazada
directamente al cido nucleico y este hbrido puede ser visualizado en
el microscopio inmediatamente despus de la reaccin de hibridacin. El
paso limitante en ste mtodo es que el hbrido subsista a las condiciones de
lavado. Lo ms importante, adems, es que la molcula reportera no
interfiera con la hibridacin.
Los mtodos indirectos, requieren una marca que contenga la molcula
reportera, introducida qumica o enzimticamente, que pueda ser detectada
por afinidad citoqumica. En este mtodo al igual que el anterior, el marcaje
no debe interferir con la hibridacin, ya que la molcula reportera debe estar
accesible a los anticuerpos que la detecten.
Las ventajas de estas tcnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que est en cultivo puro.
Hoy en da se utiliza para identificar microorganismos no cultivables, de lento crecimiento
o difcil y de identificacin compleja. Es posible utilizarlo en cualquier tiempo de muestra
biolgica y permite la identificacin de genes no expresados fenotpicamente. Son
tcnicas muy vlidas, pues el ADN es muy estable.
Otra forma de intentar resolver este problema consiste en aumentar en vitro el nmero de
copias mediante tcnicas de amplificacin.
Sondas centromricas:
Identifican los centrmeros, los cuales a pesar de ser prcticamente idnticos para
todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que permite que
la mayor parte de los centrmeros individuales puedan ser distinguidos a
excepcin de los centrmeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrmeros
de los cromosomas 14 y 22.
Permiten detectar cromosomas concretos e identificar alteraciones de tipo
numricos, especialmente monosomas, trisomas y otras aneuploidas en
metafases y tambin en ncleos interfsicos. Se conocer como sondas CEP
(chromosome enumeration probe)
Sondas subtelomricas:
Son sondas de ADN que identifican regiones cromosmicas prximas a los
telmeros, que contienen secuencias nicas que son especficas para cada
cromosoma. Poseen una alta resolucin que vara segn la medida de la sonda
utilizada (30-100 Kb). Han demostrado ser una herramienta muy til para la
deteccin de muchas anomalas cromosmicas que implican las regiones
telomricas. Dicha identificacin es importante dado que estas regiones
subtelomricas contienen gran cantidad de genes.
OTRAS SONDAS
Sondas BCR/ABL:
Especificaciones de la sonda:
BCR (22q11.23) verde
ABL (9q34) rojo.
La presencia del cromosoma Filadelfia (Ph') tiene una importante repercusin diagnstica
y pronstica en una serie de enfermedades hematolgicas. Esta anomala es
caracterstica de la leucemia mieloide crnica (LMC), esta anormalidad afecta a los
cromosomas 9 y 22.
El defecto gentico del cromosoma Filadelfia consiste en un fenmeno conocido como
translocacin. Partes de dos cromosomas, el 9 y el 22 (translocacin 9-22), intercambian
sus posiciones. El resultado es que parte del gen de regin de fractura (BCR, Breakpoint
Cluster Region, en ingls) del cromosoma 22 (regin q11) se fusiona con parte del gen
ABL del cromosoma 9 (regin q34). El gen ABL toma su nombre de Abelson, el nombre
de un virus causante de leucemias precursor de una protena similar a la que produce
este gen.
El resultado de esta translocacin es la produccin de una protena de peso p210 o p185
(p es una medida de peso para protenas celulares en unidades de masa atmica).
Puesto que el cdigo del gen ABL es capaz de aadir grupos fosfatados a residuos de
tirosina (mediante la enzima Tirosinquinasa), la fusin de los genes BCR-ABL tambin es
una enzima Tirosincinasa (Aunque la regin BCR del gen es tambin una enzima
serina/treonina protena-kinasa, la funcin de la tirosina kinasa es muy relevante para la
terapia de esta enfermedad).
La protena resultante de la fusin BCR-ABL interacta con la subunidad receptora
Interleuquina 3beta(c). La transcripcin del BCR-ABL permanece activa continuamente,
sin necesidad de ser activado por otras protenas mensajeras. En cambio, el BCR-ABL
activa un nmero de protenas y enzimas controladoras del ciclo de divisin celular.
Adems, inhibe la reparacin del ADN, causando la inestabilidad del genoma y siendo una
potencial causante de la temida crisis en cadena de la leucemia mieloide crnica, con
una alta tasa de mortalidad.
El cromosoma Filadelfia se designa como cromosoma Ph (o Ph'), y la translocacin que lo
causa se expresa como t (9;22)(q34;q11).
DiGeorge/VCFSTUPLE1
DiGeorge/VCFSN25
Prader-Willi/Angelman
Angelman(UBE3A/D15S10)
Smith-Magenis/Miller-Dieker/ILS
Williams-Beuren
Wolf-Hirschhorn
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
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