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Rsultats et discussion
Identification du domaine de dimrisation MutL
Prdiction de structure secondaire de la protine de E. coli MutL par PsiPred (Jones, 1999) indique que les
structures secondaires sont regroupes dans le N-terminal 335 (1-335 aa) et les 177 rsidus C-terminaux (439
615 aa). Rsidus de 336 438 sont prvus pour former des bobines alatoires. La thrombine digestion de rsultats
MutL en deux fragments, les 350 rsidus N-terminaux et les 265 rsidus C-terminaux (351 615 aa, LC30). Le
fragment N-terminal, LN40, contient l'activit ATPase et des structures cristallines rvle que seuls les 331
premiers rsidus sont tris (Ban et Yang, 1998; Ban et al, 1999). Nos tentatives pour cristalliser la protolyse
gnrs fragment C-terminal n'a pas russi produire des cristaux. Nous avons donc sous-clon et excessive
produit des trois fragments C-terminaux plus courts de MutL, qui contiennent des rsidus 394-615, 415-615 et 432615 et sont nomms LC24, LC22 et LC20 en fonction de leurs poids molculaires. Chaque formes de fragments
dimres purifis comme le fait LC30 (figure 1A et B). Digestion de la trypsine limite, ce qui ne rduit pas la taille
de LC20, convertit le fragment plus LC24 un produit digr de manire unique avec un poids molculaire
similaire celui de LC20 (figure 1C). Nous souponnons que les rsidus 432-615 englobent la rgion pli minimale
qui est essentiel pour la dimrisation et que les rsidus 100 entre 332 et 431 forment un linker prolonge, comme
suggr par les prdictions de structure secondaire.
Crystal structure du LC20
LC20 cristallise dans le groupe spatial P4322, et ces cristaux diffracte des rayons X pour 2.1A (Matriaux et
mthodes). La structure cristalline a t dtermine en utilisant la mthode la longueur anormale Multiwavediffraction (MAD) avec slno- substitution de la mthionine (tableau I) (Hendrickson et al, 1990). Dans la structure
de cristal raffin, chaque unit asymtrique contient une con- LC20 dimre en forme de V li par un axe de dyade
noncrystallographic (Figure 2A). Chaque sous-unit LC20 (rsidus 432-615) peut tre divis en deux sousdomaines. Le (Ex) sous-domaine externe, qui contient des rsidus 432 474 et 570 615, forme le bras extrieur
du "V", et de la (In) sous-domaine interne, qui consiste en les rsidus 475-569, est responsable de la dimrisation .
Le sous-domaine Ex se compose d'un b-feuille quatre brin antiparallle (B1, B2, B3 et B8), une couche de trois
hlices (AA, AE et AF), dont AF contient un seulement cinq rsidus, et un C-terminal hlice (AG) dpassant du sousdomaine Ex dans un solvant (figure 2A et B). L'En sous-domaine est constitu d'un feuillet b antiparallle trois
brins (B4, B5, B6 et B7, avec b4 et b5 presque continue, sauf pour un virage 1201) et une couche de trois hlices
(AB, AC et AD) . Deux hlices antiparallles serres AA (rsidus 460- 473) et AD (rsidus 554-566) Cravate l'Ex et
sous-domaines en une seule entit structurel continu (figure 2A). Une recherche d'homologues structurels par DALI
(Holm et Sander, 1993) ne trouve pas de proches parents de la LC20.
Dimrisation de LC20 se produit entre la paire de antipar- Allel hlices aC lis par un axe de dyade
noncrystallographic et implique brin b5, l'extrmit N-terminale de AB et de l'extrmit C-terminale de la MA de
deux sous-units (figure 2A et C). La surface totale de dimrisation est enterr sur B1000 A 2, et l'indice de la
complmentarit de surface (Lawrence et Colman, 1993) est 0,644, ce qui est comparable une interface
d'anticorps et d'antigne. L'interface dimre LC20 contient la fois des rsidus hydrophobes et hydrophiles.
Gln536, Asp541 et Lys548 stabiliser l'interface du dimre par des interactions polaires directs et mdiation dans
l'eau. L'hlice AC 15-rsidu contient Pro540 et Gly544 dans le milieu, mais l'axe de l'hlice et la hauteur semble
tre normale (figure 2C). Le Ca de Gly544 fait de van der Waals contacts avec Asp541, et l'oxygne du carbonyle
du rsidu 536, qui devrait normalement tre de l'hydrogne li au groupe amine du rsidu 540, est tourn vers
l'extrieur en raison de Pro540. En outre, Asp541 est enterr dans l'interface du dimre et susceptibles proton d
la cristallisation du tampon de pH 4,6 (Matriel et mthodes). Il peut rester protone au pH physiologique cause
de l'environnement hydrophobe. PH neutre ne provoque pas de dissociation de dimres de LC20, LC20 comme
monomres ne sont pas dcelable mme des concentrations submicromolaires de protines par
ultracentrifugation analytique (figure 1B). Les constantes de dissociation de LC20 et MutL dimres sont
susceptibles dans la gamme molaire nano.
La seule mutation faux-sens signals dans la rgion C-terminale de MutL qui se traduit par un phnotype mutateur
dominant dans de E. coli est Ala518 Thr (Aronshtam et Marinus, 1996). Tous les autres mutations dans la rgion
C-terminale de MutL avec un phnotype mutateur dominant sont dues une deletion ou troncature tion. Ala518
est situ dans un virage serr entre B6 et B7. Il est concevable que la mutation A518T de dstabilise la structure
de LC20 et se traduit par un phnotype similaire des troncatures du domaine C-terminal.
Structure de conservation parmi les homologues de MutL
La conservation de la squence amino-acide entre les rgions C-terminales de dimrisation homologues MutL n'a
pas t signale. Une recherche rcente de BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST /) rvle que homologues MutL
dans tres trie Gram-positives, par exemple, hexB, partagez similarit de squence avec PMS2 humaine et MLH3
dans la rgion de dimrisation C-terminal (figure 2B). Comparaison par paires entre Hexb et PMS2 ou Hexb MLH3
et donne lieu la valeur de E-1010 106 ou, respectivement, ce qui suggre que la similarit de squence est
statistiquement significative (Altschul et Gish, 1996). En outre, les prdictions de structure secondaire pour PMS2,
MLH3 et hexB par PsiPred (Jones, 1999) indiquent que ces trois protines contiennent le mme ordre et les types
de structures secondaires comme la structure coli E. LC20 (figure 2B). Bien que l'identit entre la squence de E.
coli MutL et ses trois homologues dans la rgion de dimrisation C-terminal est aussi faible que 13%, l'alignement
guid par les rsultats de structure secondaire conservs dans une similarit de 36% (figure 2B). Les rsidus
essentiels pour la formation du noyau hydrophobe sont conservs parmi ces quatre homologues MutL. Squence
conservation entre chacun de ces quatre homologues de MutL et MLH1 humaine est difficile dtecter, mais, sur la
base des prdictions de structure secondaire, MLH1 humaine est susceptible de se plier aussi PMS2 et MLH3, avec
des insertions en saillie dans le solvant environnant hlice ab. Nos alignement de squence et de structure
prdictions sont cohrentes avec les domaines de dimrisation rapports par Wu et al (2003), mais pas avec les
rsultats de tests de levure deux hybrides (Kondo et al, 2001). Sur la base de l'homologie structurelle potentiel,
les rsidus C-terminaux 571-862 de PMS2 humain et des rsidus 475 756 de MLH1 humain ont t produites et
former des htrodimres stables MLH1-PMS2 (nos donnes non publies).
Un modle de MutL intacte et une grande cavit centrale sparant LN40 et LC20
Un MutL dimre pleine longueur a t modlis en supposant que les axes de la dyade de LN40 et LC20 dimres
sont aligns (figure 3A). En plaant l'extrmit C-terminale de LN40 et l'extrmit N-terminale de LC20 ct de
l'autre, la LN40 en forme de selle est en face de la LC20 forme de V, et le modle MutL rsultant contient une
grande cavit centrale. Comme les axes de dyade concernant les domaines N- et C-terminaux ne sont pas
ncessairement colinaires et la liaison entre les deux domaines est non structure, la taille et la forme de cette
cavit est susceptible de varier en fonction de l'orientation relative des LN40 et LC20.
La rgion de liaison entre les ATPase N-terminale et C-terminales des domaines de dimrisation actions de rit de
pas de squence entre les homologues de MutL. MutL dans E. coli, il est long et 100 rsidu domin par Pro (20%),
Ala (17%), Gln (12%) et des rsidus chargs (20%). Il est prvu pour tre dpourvue de structures secondaires et
est en effet sensible la protease digestion (Figure 1C).
Bas sur la structure cristalline de SMAD4 (Qin et al, 1999), les rgions riches en proline sont souvent tendus et
pas trop souple en raison des angles pine dorsale de torsion restreint de prolines. Pour examiner le rle
fonctionnel de cette rgion de liaison, nous avons construit les sept mutants de dltion suivantes. Les trois
premires mutations de faon squentielle enlevs 30 rsidus dans l'diteur de liens, MutLD1 (rsidus 341-370
enlev), MutLD2 (371-400 enlev) et MutLD3 (400-429 supprims). Les quatre prochaines mutations supprimer
squentiellement 10 rsidus supplmentaires de MutLD2, MutLD4 (40 rsidus enlevs, 366-405), MutLD5 (50, 361410), MutLD6 (60, 356-415) et MutLD7 (70, 351-420).
mutants mutLD2, mutLD3 et mutLD4 se comportent comme de type sauvage dans les tests de rparation des
msappariements (tableau II). Les plasmides portant l'un des trois mutants de dltion peut com- plter une
souche mutL aboutissant des taux plus de trois fois de cellules de type sauvage mutation par rapport une 300
armoires diffrence entre type sauvage et mutL cellules nulles (tableau II). Protines MutLD2, MutLD3 et MutLD4
Sans surprise, purifis lient l'ADN et hydrolysent l'ATP comme MutL natif, et subissent des changements
conformationnels au cours du cycle de l'ATPase (tableau II et la figure 4). En dpit de l'ATPase normale et des
activits de liaison l'ADN in vitro, mutLD1 est dfectueux dans la rparation des msappariements in vivo et a
une augmentation de 30 fois dans le taux de mutation (tableau II).
Nos rsultats concordent bien avec les analyses de la mutagense systmatique de la levure MLH1 (Argueso et al,
2003). Un balayage faux-sens de mutation dans la squence entire de levure MLH1 a constat que des mutations
qui ont eu aucun effet sur la rparation des appariements ou miotique recombinaison de l'ADN ont t regroups
dans une priode de 70 rsidus entre l'ATPase N-terminal et domaines de dimrisation C-terminaux. Altrations des
rsidus immdiatement N-terminale de la rgion de mutation insensible mais toujours dans le 150 rsidu lieur
alatoire bobine prdit conduit des dfauts fonctionnels. Il semble que la rgion insensible mutation- 70 rsidu de
levure MLH1 correspond aux rsidus E. coli MutL supprims dans MutLD2 et MutLD3, et la rgion de la mutation
sensible la levure MLH1 correspond ceux dans MutLD1 supprim. Le phnotype native prsente par les
mutants D2, D3 et D4 indiquent que les C-terminaux des deux tiers de l'agent de liaison entre LN40 et LC20 ne
ncessite pas une squence d'acides amins spcifique et l'agent de liaison peut tre raccourci de 100 60
rsidus.
Les mutants mutLD5, D6 et D7 avec 50, 60 et 70 rsidus enlevs, cependant, ont des taux de mutation a
augment de 20, 60 et 200 fois, en dpit de l'activit d'ATPase normale des protines mutantes (tableau II).
Dynamique de dispersion de lumire analyses rvlent que le coefficient de diffusion de type sauvage, D2 et D5
mutant MutL augmente de faon monotone avec decreas- ing longueur de liaison (tableau III), ce qui suggre que
les domaines N- et C-terminales sont rapprochs comme le lieur est shor- tened. En supposant que dans la
prsence de AMPPNP et Mg2 N- et domaine C-terminal sont deux entits distinctes, les sparations structurelles
de 160, 111 et 76A entre leurs centres de masse dans de type sauvage, D2 et D5 protine mutante,
respectivement, sont tenus de rendre compte pour les rayons de Stokes observ. Le diamtre de la cavit centrale
de type sauvage MutL est donc B100A , assez grand pour encercler 2-4 duplex d'ADN simultanment. Enlvement
additionnel de l'agent de liaison la protine mutante D7 ne conduit pas une rduction supplmentaire de la
taille de la protine en prsence de l'une EDTA ou AMPPNP et Mg2 (TableIII)
.The20residuesdeletedinD7butpresentin D5 peut restreindre la liaison avec la structure locale et leur enlvement
de presse probablement le liaison de compactage et augmente la taille observe de la protine mutante D7. Le
phnotype mutateur de mutLD7 implique que la grande cavit centrale de MutL jouent un rle critique dans la
rparation des msappariements.
LC20 est implique dans la liaison de l'ADN
MutL lie la fois l'ADN double et simple brin sans spcificit de squence (Bende et Grafstro m, 1991; Mechanic et
al, 2000; Drotschmann et al, 2002a). L'activit de liaison l'ADN de MutL est dtect en l'absence d'un cofacteur
de nucleotides mais amliore en prsence de AMPPNP (Ban et al, 1999). La structure cristalline d'un complexe
LN40-AMPPNP rvl une rainure charg positivement l'intrieur de la forme de selle LN40 dimre (figure 3A).
Mutation de Arg266 Glu dans le milieu de la rainure abolit largement l'activit de liaison l'ADN de la pleine
longueur MutL (Junop et al, 2003). Bien LN40 seul lie l'ADN, la prsence de la rgion de dimrisation C-terminal
dans la pleine longueur MutL amliore grandement la liaison (figure 4B) ADN. Curieusement, liaison l'ADN par
LC20 seul est pas dtect (figure 4B).
Pour dterminer si LC20 est directement impliqu dans la liaison d'ADN, des grappes de rsidus chargs
positivement ont t identifis dans LC20 et muts au glutamate dans trois patchs (figures 2B et 3). Arg465,
Arg468, Lys548 et Arg563 dfinissent une grande tache charg positivement (P-1) sur la surface concave de la
LC20 face la cavit centrale; His606, Lys610 et Lys613 (P-2) l'extrmit C-terminale et Arg451 et Lys593 (P-3)
sur la surface convexe de LC20 forment deux plaques supplmentaires qui ne sont pas face la cavit centrale
(figure 3C). Les trois protines de patch-mutant se comportent bien en solution et conservent une activit d'ATPase
normale (Tableau II). Le P-2 et P-3 protines mutantes ont rduit l'activit de liaison l'ADN (figure 4B), mais les
mutants correspondants se comporter comme de type sauvage dans l'essai de rparation des msappariements
(tableau II), ce qui suggre que l'ADN liants ing par les rsidus dans P patches -2 et P-3 est fonctionnellement sans
importance. En revanche, la P-1 mutation rduit l'activit de liaison d'ADN de la protine mutante un niveau
similaire celui de LN40 seul (figure 4B) et augmente la vitesse de la cellule mutante de mutation de prs de 100
fois (tableau II). Mme une double mutation de Arg465 et Arg468 Glu dans les P-1 rsultats des correctifs une
augmentation de 10 fois le taux de mutation (tableau II). tant donn que la P-1 mutation n'a aucune incidence sur
la dimrisation ou l'activit d'ATPase de MutL (Figure 4A et Tableau II), la rparation des msappariements avec
facults rsulte probablement de la fixation dans la cavit centrale ADN rduite.
Hays, 2004), d'apporter MutH en proximit avec les MutS (ATP) complexe -MutL-concordance ncessite boucle sur
l'inadquation entre l'ADN et hmimthyl GATC site de clivage (Yang et al, 2000). En raison de l'asymtrie des
interactions MutS-ADN (Lamers et al, 2000; Obmolova et al, 2000), le complexe MutS (ATP) -MutL- incompatibilit
est susceptible d'tre stro-spcifique et tionnel en. Selon que le site GATC hmimthyl est de 50 ou 30 sur le
site de non-concordance, la boucle d'ADN de la squence intermdiaire doit tre configur diffremment pour
placer la liaison scissile dans le site actif MutH (Modrich et Lahue, 1996). Notre observation selon laquelle la liaison
de l'ADN par MutL est pas requise pour l'activation MutH (Junop et al, 2003) suggre que l'ADN adjacent au site de
clivage MutH est non contrainte et le substrat d'ADN peut approcher MutH dans les deux sens (figure 7, en bas
gauche).
Aprs le brin de fille est entaill, MutH laisse et UvrD est recrut. L'exigence de MutL d'interagir avec la fois et
UvrD substrat d'ADN (figure 6) contraint UvrD comment est charg. Nous proposons que, lors de l'activation de
UvrD, MutL contacts ADN adjacent au site de msappariement ainsi que l o se droule le UvrD duplex et des
boucles de la squence intermdiaire dans sa grande cavit centrale (figure 7, en bas droite). L'orientation de
UvrD est ainsi dirig par le complexe MutS-MutL-UvrD-ADN et non pas par la polarit de la nick par rapport au site
de dcalage. Ce modle propos peut aussi demander eucaryote rparation des msappariements. Non
seulement les structures d'homologues MutL conserves, le recrutement de Exonuclease I par Mutsa humaine et
Mutla pour liminer l'ADN partir d'une entaille 50 ou 30 sur le site de dcalage est rappelle UvrD activation par
MutL (Genschel et al, 2002).
Bien que l'hydrolyse de l'ATP par MutL est pas requise pour l'activation de UvrD dans nos essais d'activit
d'hlicase (figure 6), elle peut jouer un rle dans l'activation in vivo UvrD. Liaison de l'ATP par MutL, qui favorise
l'association du domaine ATPase, peut faciliter la formation d'un ferm MutS-MutL UvrD- ADN-complexe (Figure
7, en bas droite) et d'augmenter UvrD processivit. Hydrolyse de l'ATP par MutL, qui dissocie les domaines
ATPase, peut ouvrir le complexe MutS-MutL-UvrD-ADN pour librer les tensions topologiques et rduire la taille de
la boucle d'ADN UvrD droule ADN (figure 7, au milieu droite). Le cycle d'ATPase de MutL lent peut maximiser le
nombre de paires de bases droule chaque fois que le complexe MutS-MutL-UvrD se ferme sur un substrat d'ADN.
Pour dtendre l'ADN devant le site de dcalage, UvrD peut avoir dplacer MutS et MutL.
Matriels et mthodes
Prparation de protine et la cristallisation
Trois mutL fragments C-terminaux ont t clones dans pET15b (Novagen) en utilisant les sites de restriction Ndel et
BamHI pour gnrer pWY1293 (LC24), pWY1294 (LC22) et pWY1295 (LC20). LC24 Histi- dner-tiquet, LC22 et
LC20 protines ont t purifies en utilisant une colonne d'affinit Ni-chlateur. His ont t limins par digestion
par la thrombine, et les protines ont t en outre purifis sur une colonne MonoS et concentres B10mg / ml
dans du Tris 20 mM (pH 8), NaCl 150 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM, 5% de glycerol et 3% d'isopropanol pour
espace de rangement.
Se-Met-LC20 marqu a t produit dans des cellules B834 (DE3) comme dcrit (Hendrickson et al, 1990). Les
cristaux de LC20 ont t cultives selon la mthode de diffusion de vapeur goutte pendante 41C contre le
rservoir contenant de 1,0 1,5 M de NaCl, 60 mM d'actate et Li2SO4 de sodium 100 mM (pH 4,6) et par une
meilleure macro-ensemencement. Pour la conglation instantane, 25% de glycrol a t ajout la liqueur mre.
Dtermination de la structure et de raffinement
Les cristaux de LC20 diffracts rayons X mieux que 2.1 avec 0,121 mosacit. A trois longueurs d'onde MAD
ensemble de donnes d'un cristal Se-Met a t recueilli X9B dans NSLS, Brookhaven National Laboratory. Les
donnes ont t traites l'aide HKL2000 (Otwinowski et Minor, 1997). Quatre des six sites Se t trouv et raffin
2,5 A rsolution en utilisant SOLVE (Terwilliger, 2003). Les phases ont t amliores par aplatissement solvant
en utilisant DM (CCP4, 1994). Les modles structurels ont t construits et affins en utilisant SNC et O (Jones et
al, 1991; Bru doigt et al, 1998). Le modle final contient un dimre LC20 (rsidus 433-613 et 432-613), 2 Cl, 1
Nath, 292 l'eau, les molcules 2 de l'isopropanol et 2 glycrol. Plus de 89% des rsidus se situent dans les rgions
les plus favorises de la parcelle Ramachandran et aucun dans les rgions non admises.
Prparation du mutant MutL
MutL mutants ont t tires partir du plasmide pTX418 utilisant Quik- Change (Stratagene) et dsigns comme
pWY1383 (N33A), pWY1368 (MutLD1), pWY1369 (MutLD2), pWY1370 (MutLD3), pWY1404 (P-1), pWY1400 (P-2) et
pWY1398 (P-3). pWY1431 (MutLD4), pWY1432 (MutLD5), pWY1433 (MutLD6) et pWY1434 (MutLD7) ont t tires
de pWY1369. Les rgions codantes ont t transfrs dans pProEXHTb (Life Technologies), qui code pour une Nterminal Son tiquette amovible par la protase TEV. Des mutations ont t vrifies l'aide squenceur d'ADN
PRISM-310 (ABI). Expression et purification de protines mutantes ont t effectues de manire similaire MutL
type sauvage (Ban et Yang, 1998).
Analyse d'quilibre de sdimentation
LC24 purifie, LC22 et LC20 ont t dialyses dans du NaCl 200 mM, Tris 20 mM (pH 8,0), 4,2 mM de 2mercaptothanol, 0,1 mM d'EDTA et 5% (v / v) de glycerol. Expriences d'quilibre de sdimentation ont t
menes 4.01C sur un Beckman Optima XL-A ultracentrifugation analytique. Les donnes ont t acquises des
vitesses de rotor allant de 8000 12000rpm. L'quilibre a t atteint dans les 48h. Les donnes ont t analyses
en fonction d'un seul solut idal pour obtenir la masse molculaire dynamique, M (1vr). Les valeurs
exprimentales de la masse molculaire M ont t dtermins en utilisant des densits, r et V comme dcrit
(Perkins, 1986) exprience de diffusion de lumire .dynamic
De type sauvage, des protines mutantes D2, D5 et D7 ont t incubes avec AMPPNP et purifi par filtration sur
gel dans 20 mM de Tris (pH 8,0), 0,2 M de KCl, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM et 0,1 mM d'EDTA. La moiti de chaque
chantillon a t trait avec 8 mM d'EDTA dissocier les domaines N-terminaux. La translation coefficient de
diffusion D a t mesure partir de l'analyse d'auto-corrlation de la lumire diffuse quasielastically. Fonctions
d'autocorrlation ont t accumuls partir de 200 ml d'mg / B0.2 chantillons de protines ml pour 1-3 min
l'aide d'un 24.01C Brookhaven Instruments BI-9000 AT autocorrlateur angle y comprises entre 90 451 et le
temps d'chantillonnage de 0,1 ms-40 ms. Un laser ions argon (Lexel, Modle 95) a t utilis dans le mode
TEM00 la 514.5nm. Coefficient de diffusion, le rayon de Stokes et coefficient de frottement ont t calcules en
utilisant Brookhaven Instruments logiciel d'analyse. Une srie de modles avec le dimre LN40 LC20 et spare de
60 180A long d'un axe commun dyade ont t construits. Coefficient de diffusion et le rayon de Stokes thorique
de ces modles ont t calcules l'aide HYDROpro (Garcia de la Torre et al, 2000).
ADN essais de dcalage de mobilit
MutL se lie aussi bien un ADN un brin nt 110 ou 110 pb ADNdb, ADNsb et la liaison a t teste dans cette
tude. Un 32P 50 marqu l'extrmit simple brin de 110-mer ADN (5 nM) a t incube avec 10, 20, 40, 80, 160
et 640 des protines de MutL nm (monomres) dans du Tris 20 mM (pH 8,0), KCl 90 , DTT 1 mM, 0,1 mg / ml de
BSA dans de la glace pendant 1 h. ATP (1 mM) ou AMPPNP avec 5 mM de MgCl2 ont t ajouts au tampon de
liaison en cas de besoin. Les mlanges ractionnels (15ml) ont t analyss sur des gels 4,5% tris- glycine de
Polyacrylamide et quantifis l'aide Typhoon 8600 (Molecular Dynamics). Tous les essais in vitro ont t rptes
au moins trois fois. Les valeurs moyennes avec des carts types sont prsents.
Dosages d'activit ATPase
L'activit d'ATPase de MutL mutants a t dose comme dcrit (Ban et al, 1999). Les protines (1,7 mm) ont t
incubes avec un ATP marqu au 32P (20 mM-1 mM) dans 20 mM de Tris (pH 8), 1 mM de DTT, 90 mM de KCl et
MgCl2 5 mM pendant 2 heures 221C ou 371C 1 h. Les ractions ont t inities par l'addition d'a-32P-ATP
marqu et termines par l'addition d'un volume gal d'EDTA 50 mM.
Dosage d'hlicase
Natif UvrD a t surexprim dans BL21 Star (DE3) pLysS (Invitrogen) 251C, purifie sur hparine et MonoQ
colonnes et stock dans du Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM, NaCl 200 mM et 20% de glycrol . Un
substrat ADNdb 68 pb conte- nant un G: T dcalage (gras) et un pseudo sur le site GATC (soulign) a t prpar
par recuit 32P 50 marque l'extrmit de 50 Pd (ACATGCGGTA CCAAGCTTCTCGAGG) avec 50 -d
(GATCCTTGAATTCCAATAGGCCTG CCCTGGAAATACAGGTTTT) et 50-D (GAAAACCTGTATTTTCAGGG
CAGGCCTATTGGAATTCAACGATCCTCGAGAAGCTTGGTACCGCATG). fX174 ssADN a t recuite avec une extrmit
marqu 125-mer oligonuclotide 32P 50. Pour MutL titrage, 1 nM substrat d'ADN circulaire et une quantit
croissante de MutL, LN40 ou LC24 ont t mlangs dans du Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM, MgCl2 3 mM, ATP 3,
4,5 mM de b-mercaptothanol et 0,1 mg / ml albumine de srum bovin, et les ractions ont t inities par addition
de 1 nM UvrD, incubes pendant 15 minutes 371C, et stoppes par l'addition d'un volume gal de 30% de
glycerol, 0,2% de SDS, EDTA 5 mM et 100 mg / ml de proteinase K ( New England Biolabs). Pour l'essai d'activation
UvrD, 1 nM MutL (dimre), 1 nM et 1 nM UvrD circulaires ou d'ADN linaire substrats ont t utiliss. Le temps de
raction pour les substrats d'ADN linaire tait de 5 minutes 221C. Des chantillons de raction (10 ml) ont t
analyss sur un 10% (ADN linaire) ou 4,5% (ADN circulaire) du gel de TBE et quantifis l'aide Typhoon 8600.
Protine de reticulation BS3
MutL, LN40 ou LC30 (2,5 mM) et 2,5 mM UvrD ont t incubes avec 0,11, 0,33, 1 ou 2 mM de Hepes BS3 20 mM
(pH 7,5), 90 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 et 1 mM de DTT pendant 1 heure 221C. AMPPNP (3mm) et 7,5 mM ADN
double brin, qui a t faite par un recuit-mer 23 (50 GGACGA GCCGCGCGCTAGCGTCG30) et un 43-mer
(50CGACGCTAGCGTGCG GCTCGTCCTCATGGTCATGGTCATCTAG30), ont t ajouts comme indiqu. Les produits de
raction de (10 ml) ont t spars sur des gels de SDS 4-12% et colors avec du bleu de Coomassie.
Test in vivo de rparation des msappariements
La souche E. coli CC107 est ara D (gpt-lac) 5 Thi / B F0 128 lacIZ proA (Cupples et al, 1990). CC107 mutL ::
miniTn10 a t construit par transduction CC107 Tetr avec un vir lysat P-1 cultives sur des souches portant un
insertions miniTn10 dans mutL (Miller et al, donnes non publies). MutL CC107 a t transform avec les
constructions plasmidiques de mutL et plaqu sur LB plus ampicilline (Junop et al, 2003). Les frquences de (RifR)
des mutants rsistants la rifampicine ont t dtermines par plaquage d'chantillons de cultures d'une nuit
cultives dans du milieu LB (plus ampicilline si le plasmide Ampr confrant a t utilis) sur des plaques avec 100
mg / ml de rifampicine, l'incubation 371C pendant 20 h, et marquant les colonies RIFR. Les dilutions ont t
tales galement sur des plaques LB pour dterminer le titre.
Coordonnes atomiques et facteurs de structure de LC20 ont t dposs auprs de la Protein Data Bank (code de
l'adhsion de 1X9Z).
Remerciements
Nous remercions Dr Z Dauter pour le soutien de la ligne de rayonnement synchrotron, le Dr J Hurley de l'aide pour
la collecte de donnes MAD, Dr S Matson pour le vecteur d'expression UvrD, Dr M Junop pour le partage de
donnes non publies, le Dr D Hinton de l'aide avec le dosage pieds impression KMnO4 , et les Drs R et D Craigie
Leahy pour lire le manuscrit. Nous remercions galement l'un arbitre pour des commentaires dtaills et
perspicaces. AG et SR-M ont t les bnficiaires de bourse post-doctorale de la Human Frontiers Science Program.
Figure 1 domaine de dimrisation de E. coli MutL. (A) Un Coomassie- bleui gel SDS de dimres de LC30 rticul par
0,11, 0,33 et 1 mM BS3. Analyse (B) l'quilibre de sdimentation LC24, LC22 et LC20. Profils des trois protines
(code couleur) 12000r.pm et 41C sont traces sur la gauche. Les lignes grises pointilles reprsentent des
valeurs pour les dimres correspondants attendus. Rsidus pour chaque protine sont prsents sur la droite. (C)
digestion par la trypsine de LC24 et LC20. Au total, 9 ml de 0,5 mg / ml ou LC24 LC20 a t digr par 1 ml de
0,01, 0,03 ou 0,1 mg / ml de trypsine dans la mmoire tampon de stockage de protine pendant 1 heure 221C.
Les produits de digestion ont t spares par SDS-PAGE et colores avec du bleu de Coomassie.
Figure 2 Crystal structure du LC20. Diagrammes (A) de ruban d'une sous-unit de LC20 et deux vues orthogonales
d'un dimre LC20. The Ex et sous-domaines en sont prsents dans pourpre et vert, respectivement. Structures
secondaires sont tiquets dans une sous-unit. Alignement (B) de la squence des domaines C-terminaux
dimrisation de Streptococcus pneumoniae hexB, PMS2 humain et MLH3, MutL et E. coli. Structures secondaires de
LC20 qui sont prvus pour exister aussi dans les trois autres protines sont prsents sous forme de flches (Bbrin) et botes (hlices). Rsidus hydrophobes et polaires conservs sont surligns en jaune et violet (Ex) ou vert
(En). Rsidus muts dans P-1, P-2 et P-3 sont cods par couleur en rouge, bleu et vert, respectivement. Vue (C)
stro de la paire d'hlices en courant alternatif l'interface du dimre. Une carte de densit d'lectrons 2FoFc
est superpos. Les chanes latrales de Ile537, Pro540 et l'atome Ca du Gly544 sont surligns en vert, et des
chanes latrales de Glu541 en rose. D'autres chanes latrales de l'hlice aC sont omis pour plus de clart. Figures
2A, C et 3 ont t gnrs en utilisant des rubans (Carson, 1987).
Figure 3 Un modle de MutL intacte. (A) un diagramme en ruban de pleine longueur MutL. LN40 et LC20 sont
placs pour partager un axe de dyade commun. Pour esthte, la sparation des deux domaines (160 A ) est pas
l'chelle. L'extrmit C-terminale de LN40 (331) et N-terminale de LC20 (433) sont relis par une ligne en
pointills. AMPPNP (rose), Asn33, Glu29 et Arg266 (or), les rsidus dans la P-1 (rouge), P-2 (bleu) et P-3 (vert) des
correctifs, et l'diteur de liens suppression D1, D2 et D3 sont prsents . (B) Asn33 chlate Mg2 (de sphre verte)
pour liaison de l'ATP et Glu29 est la base gnrale pour hydrolyse de l'ATP. Les molcules d'eau sont prsents
comme des sphres rouges. (C) des mutations de patch. Une sous-unit de LC20 (bleu clair) est reprsent avec
des prsentations de boule-et-bton des chanes latrales en P-1 (rouge), P-2 (bleu) et P-3 (vert). Le P-1 correctif
tend travers l'interface du dimre de la sous-unit voisine (violet).
Figure 4 Proprits de protines mutantes MutL. (A) d'association du domaine N-terminal ATPase lors de la liaison
de AMPPNP ( AMPPNP) est surveill par des profils d'lution partir de Sephadex-une colonne d'exclusion de taille
200. De type sauvage MutL sans AMPPNP est lue tt (rouge pour les A280 et orange pour A260), depuis ses
domaines ATPase N-terminale sont dissocies comme reprsent dans le dessin anim rouge. Lorsqu'il est li
AMPPNP, les domaines ATPase deviennent associ (bleu dessin anim), et la protine est lue plus tard (bleu
fonc et la lumire pour A280 et A260). AMPPNP liaison se traduit galement par une augmentation de A260
A280. Pour protines mutantes, 'th' et '' indiquer la prsence ou l'absence de AMPPNP. Parmi les sept protines
mutantes, seulement N33A AMPPNP ne se lie pas et ne subit pas des changements de conformation. (B)
lectrophorse essais de dcalage de mobilit (EMSA) de la liaison ssADN par type sauvage MutL, LN40 et LC20
(premier panneau), diteur de liens suppression (deuxime panneau) et des protines de patch-mutant (troisime
panneau); liaison ssADN par quatre MutL protines mutantes avec et sans AMPPNP (quatrime panneau). AMPPNP
n'a aucun effet sur le N33A et E29A mutant MutL et R266E a peu d'activit de liaison l'ADN. Gels (C) EMSA de
huit protines de MutL indiqus dans (b). La liaison d'ADN a t dose en prsence d'ATP (premire six) ou AMPPNP
(deux derniers).
Figure 5 La reticulation UvrD et MutL par BS3. Coomassie-bleus colors gels SDS-PAGE de UvrD (D) et pleine
longueur MutL (L) (A), LN40 (LN) (B), ou LC30 (LC) (C) rticuls par 0,11 mM BS3. Les trois premires voies sont
MutL (LN40 ou LC30), MutL (LN40 ou LC30) mlang avec UvrD et UvrD. Les neuf voies suivantes sont les rsultats
de rticulation chaque ensemble de trois chantillons de protine en prsence d'ADN et AMPPNP, AMPPNP, ou de
l'ADN. Molecular- standards de poids sont indiques. MutL (70 kDa), LN40 (40 kDa) et UvrD (80 kDa), et LC30
dimre (60 kDa) sont tiquets. Monomres LC30 couru hors gel et sont donc absents. Les flches rouges
indiquent les bandes rticuls, dont la formation dpend AMPPNP et de l'ADN; les flches bleues indiquent l'espce
indpendante rticul de AMPPNP ou de l'ADN.
Figure 6 UvrD activation par MutL. (A) de droulement de l'ADN circulaire de 1 nM comme illustr sur le dessin par
1 nM UvrD hlicase et une quantit croissante de MutL, LN40 ou LC24 est reprsent sur 4,5% de gels de
Polyacrylamide TBE (panneaux de gauche). Les quantits d'ADN droul sont quantifis et tracs sur le panneau
droit. (B) d'activation de UvrD par des protines mutantes MutL se dtendre le substrat d'ADN circulaire. Les deux
gels TBE et graphiques barres correspondants sont prsents. (C) d'activation de UvrD pour se dtendre un
substrat d'ADN linaire comme schmatis. Le 50 extrmit d'un brin marqu au 32P est marqu par un point.
Seuls les graphiques barres sont prsents. Dans chaque graphique barres, la colonne la plus gauche est
UvrD (1 nM) seul, son droit de 1 nM de type sauvage ou mutant MutL est ajout en tant marqu. Une ligne
horizontale marque la quantit d'ADN droul par UvrD seul.
Figure 7 Une hypothse de travail de MutL mdie rparation des msappariements dans E. coli. MutS, MutL, MutH
et UvrD sont forme- et un code couleur, et mthyl (modle) et non mthyls brins (fille) d'ADN sont reprsents
en noir et gris, respectivement. Aprs MutS se lie un site de dcalage (en haut gauche), elle recrute MutL en
prsence d'ATP (prsente comme un point rouge) pour former un MutS (ATP) complexe ternaire -MutL-ADN (milieu
gauche). Ce complexe ternaire active MutH cliver le brin non mthyl sur un site GATC hmimthyl. Le clivage
entre 50 et 30 au site de msappariement est possible parce que les deux orientations d'un site GATC peuvent tre
loges (en bas gauche). Pour l'activation UvrD, l'ADN de contacts MutL prs de deux l'inadquation et des sites
GATC entaills et boucles sur la squence intermdiaire. En prsence d'ATP, une ferm complexe MutS-MutLUvrD-ADN est form (en bas droite). Hydrolyse de l'ATP par MutL 'ouvre' le complexe MutL-UvrD-ADN MutS-
librer des contraintes topologiques et de rduire la taille de la boucle d'ADN UvrD droule le ADN (au milieu
droite). L'achvement de la rparation concordance ncessite l'ADN re-synthse et brin ligature (en haut droite).