Chromatograhie Methodes Et Principe

Chromatographie
1 Gnralits
Cours TB
2008 - 2009
2008-2009
Chromatographie
Introduction
- ensemble de mthodes de sparation des constituants dun
mlange
- trs employes (LA mthode de sparation actuelle) parce que :
- sparation possible de nimporte quel constituant
- mise en uvre possible lchelle analytique, prparative et
industrielle
- seront envisags
* des gnralits : dfinitions de la chromatographie et
classification des mthodes chromatographiques
* le principe des mthodes
* les mthodologies et applications
2008-2009
2008-2009
Chromatographie
Chromatographie (1/2)
1 3 - tude thorique et modlisation
1 Gnralits
1 3 1 - Modlisation intuitive
1 3 2 - Volumes de rtention
1 3 3 - Efficacit de la colonne et rsolution
1 1 Dfinition de la
chromatographie : principes
gnraux
1 4 Divers temps dune

chromatographie sur colonne
1 5 Divers temps dune
chromatographie sur colonne
1 1 1 - Dfinition
1 1 2 - Caractres gnraux
1 2 - Diffrents types de
chromatographies
2 Principe et utilisation des
mthodes de chromatographie
1 2 1 - Classification selon ltat des

phases
1 2 2 - Classification selon le principe
des interactions entre solut et phase
stationnaire
1 2 3 - Classification selon le mode
dimmobilisation de la phase
stationnaire
1 2 4 - Classification selon les
modalits de migration de la phase
mobile
2008-2009
2 1 Chromatographie dadsorption
2 2 Chromatographie de partage
2 3 Chromatographie par
change dions
2 4 Chromatographie par gel filtration
2 5 Chromatographie par interactions
biospcifiques
hydrophobes
chlation (IMAC = Immobilised
metal affinity
chromatography )
Chromatographie
Chromatographie (2/2)
3 Mthodologie et
applications
3 2 Applications
3 1 Mthodologies
3 1 1 Chromatographie sur colonne
A - Chromatographie en phase liquide
B - Chromatographie en phase gazeuse
3 1 2 Chromatographie de surface
A Mthodologie gnrale
B Diffrence
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3 2 1 Sparation des acides

amins
3 2 2 Sparation de mdicaments par
HPLC
3 2 3 Sparation des protines par
FPLC
3 2 4 Autres applications
Chromatographie
Chromatographie
1 Gnralits
1 1 Dfinition de la chromatographie : principes

gnraux
1 1 1 - Dfinition
Chromatographie : ensemble de mthodes qui assurent la
sparation des constituants dun mlange en utilisant deux
phases non miscibles : les divers constituants sont entrans
d'une manire diffrentielle par une phase mobile le long d'une
phase stationnaire.
Commentaires :
phase : toute partie homogne dun systme.
trois tats physiques dune phase : liquide, gazeux et solide.
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Chromatographie
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1 Gnralits

gnraux
- la sparation de soluts se ralise entre deux phases :
* une phase stationnaire, par dfinition immobile ; choisie
pour sa grande affinit pour les divers soluts ;
affinit
quels mcanismes ?
cependant, affinit pas trop importante : les soluts doivent pouvoir tre
dtachs
* une phase mobile qui entrane les divers soluts
- en fait, les soluts se partagent entre la phase stationnaire et la phase

mobile ; chromatographie = phnomne de partage gnralis
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Chromatographie
Phase
stationnaire
Phase
mobile
Phase
stationnaire
Phase
mobile
Cmo
Cst
Cst
------Cmo
Schmatisation
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Chromatographie
>1
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gnraux
- la sparation est lie la vitesse propre dentranement du solut par
la phase mobile :
* les substances qui migrent le plus sont celles qui ont le plus
daffinit pour la phase mobile,
* les substances qui migrent le moins, celles qui ont le moins
daffinit.
- les soluts restent ou non dans la phase stationnaire

* initialement, du point de vue historique, les soluts restaient
dans la phase stationnaire ; ils taient colors et pouvaient tre visualiss
* vers la seconde guerre mondiale (Tiselius), on a pu
commencer pouvoir mettre en vidence des soluts incolores par
colorimtrie (utilisation de la ninhydrine) : il tait possible de laisser sortir les
soluts de la colonne (chromatographie dlution).
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1 Gnralits

gnraux
- la mise en oeuvre est possible :
lchelle laboratoire
lchelle prparative
* lchelle industrielle.
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Chromatographie
Chromatographie
1 Gnralits
1 2 - Diffrents types de chromatographies

1 2 1 - Classification selon ltat des phases
1 2 2 - Classification selon le principe des
interactions entre solut et phase stationnaire
dimmobilisation de la phase stationnaire
1 2 4 - Classification selon les modalits de
migration de la phase mobile
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Chromatographie
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Chromatographie
1 Gnralits

1 2 1 - Classification selon ltat des phases
Phase
mobile
Phase
station.
chromatographie liquide - liquide

CPL chr. phase
chromatographie liquide - solide
chromatographie gaz
liquide
- liquide.
CPG chr. phase
Chromatographiegazsolide
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Chromatographie
gazeusedgazeuse
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1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre
solut et phase stationnaire
- ADS0RPTION : liaisons de faible nergie (liaisons polaires, ...) assurant la fixation des
soluts la phase stationnaire
- PARTAGE : solubilisation des soluts dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amens
se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins
solubles;
- ECHANGE D'IONS : liaisons ioniques entre charges lectriques portes par les soluts et
par la phase stationnaire (opposes)
- GEL FILTRATION : pas de liaisons : diffusion / exclusion de soluts dans la phase
stationnaire poreuse (chromatographie d'EXCLUSION DIFFUSION)
- INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES : interactions biospcifiques (enzyme - substrat,
antigne anticorps, ...) entre les soluts et la phase stationnaire porteuse dun ligand
(appliques aux protines).
- INTERACTIONS HYDROPHOBES : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et
les soluts (ncessite de la prsence de parties hydrophobes dans la structure du solut)
(s'applique aux protines)
- CHELATION : liaisons datives entre un mtal divalent fix sur un support (phase
stationnaire) et les soluts porteurs de doublets libres (cas classique : His des protines) .
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1 2 3 - Classification selon le mode dimmobilisation de la
phase stationnaire
La phase stationnaire immobilise de 2 manires diffrentes :
- soit tendue sur une surface plane : chromatographie de surface

* la chromatographie sur papier
* la chromatographie sur couche mince
- soit l'intrieur d'une colonne : chromatographie sur colonne .

phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon)
maintenue dans une colonne
introduction en tte de colonne de l'chantillon analyser (au
moyen d'un injecteur)
dtection des soluts (grce un dtecteur)
collection de fractions (collecteur de fractions) .
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1 2 4 - Classification selon les modalits de migration de la
phase mobile
A - Chromatographie par lution
Sortie des soluts de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne.
ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mlange) qui ralisent la rupture diffrentielle
des interactions entre phase stationnaire et soluts
lution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilis : force ionique, polarit par
exemple soit d'une manire brusque (gradient discontinu) soit d'une manire continue (gradient
continu).
caractrisation des soluts dans l'luat .
B - Chromatographie par dplacement

Maintien des soluts dans la phase stationnaire : ils se dplacent dans la phase
stationnaire
c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) o on rvle les soluts
encore prsents dans la phase stationnaire.
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Chromatographie
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Chromatographie
1 Gnralits

1 3 1 Modlisations
1 3 2 Le pic de chromatographie idal
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Chromatographie
15
Chromatographie
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1 3 1 Modlisations
A Modlisation intuitive
- srie de barques sans moteur sur une rivire.
- courant est suppos constant, cest dire quil est identique que lon soit au bord de
la rive ou au milieu.
- les barques transportent des passagers dune ligne marque dpart une ligne
marque arrive .
- les barques, au gr des passagers, sont susceptibles de sarrter sur la berge durant
des temps variables.
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1 Gnralits
Au temps 0,.. Elles

1 3 1 Modlisations
1 Modle de barques sur une rivire :
Au temps zro
les barques attaches

sur la ligne de dpart
libres en mme temps, au temps zro
Dpart
Arrive
Courant
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1 3 1 Modlisations
Dpart
Arrive
- diffrence de
Dpart
dure du trajet entre
les lignes de dpart
et celle darrive,
lie aux arrts plus
ou moins longs.
Arrive
- avance, dans le
courant, la mme
vitesse
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1 3 1 Modlisations
Dpart
Arrive
- temps pass naviguer tO identique pour toutes les barques

- temps dpart - arrive tR diffrents du fait de la dure des arrts
effectus tR..
tR = tO + t'R
tR : temps mis par les barques pour atteindre l'arrive
tO : temps pass naviguer
tR: temps des arrts sur la rive.
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1 Gnralits

1 3 1 Modlisations
2 Retour la chromatographie
barques = les diffrents soluts ;

berge = la phase stationnaire ;
la rivire = la phase mobile.
(1)
tR = to + tR
tR : temps correspondant la sortie du solut de la colonne : temps de
rtention dans la colonne
to : temps pass dans la phase mobile = temps mort
tR : temps pass dans la phase stationnaire.
De mme aucun solut ne peut sortir avant le temps to, temps qui correspond
au transport dans la phase mobile.
tR est le temps de rtention rduit du temps mort, cest dire tR - to
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1 3 1 Modlisations
B Analogie chromatographie / distillation
Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941
Liquide appauvri
en solut volatil
Vapeur enrichie en
solut volatil
chaque niveau,
partage du solut
- entre la phase liquide
et la phase gazeuse
(distillation)
- entre la phase
stationnaire et la phase
mobile
Colonne de chromatographie
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Colonne plateau
Chromatographie
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1 3 1 Modlisations
Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941

Liquide appauvri
en solut volatil
Vapeur enrichie en
solut volatil
Plateaux thoriques
Plus une colonne comporte de plateaux
(thoriques), meilleure sera la sparation
Ou encore, plus la hauteur dun plateau sera
faible, meilleure sera la sparation
Colonne
plateau
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Chromatographie
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Chromatographie
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Chromatographie
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1 3 1 Modlisations
Remarque : reprsentation schmatique dune chromatographie
0
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tR
tR
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1 Gnralits

1 3 2 Le pic de chromatographie idal
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Chromatographie
25
Chromatographie
1 Gnralits

A Efficacit de la colonne
sparation caractrise par le nombre effectif
de plateaux thoriques Neff .
Plus ce nombre est lev, meilleure est la
sparation.
On dmontre que :
tR2
L
Neff
= ------- =
2
1,2
11
--------H
Pic gaussien
0,6
0,5
1/2
= 1/2 / (8 Ln 2 )1/2
ou
avec L, longueur de la colonne (en cm)

H, hauteur quivalente dun plateau
thorique (en cm) (HEPT)
t2, variance du pic (en units de temps)
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Chromatographie
tR
tR
26
Chromatographie
1 Gnralits

1,2
Neff peut galement tre calcul partir

de tR et de , ce dernier paramtre tant
dtermin depuis lintersection des tangentes
au point dinflexion avec la ligne de base.
Neff = 16 tR2 / 2
11
Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 m et une

longueur de 25 cm, on arrive 15000 - 20000 plateaux
thoriques effectifs.
Souvent il est plus facile de mesurer la largeur du
pic mi hauteur 1/2 :
Comme = 1/2 / (8 ln 2)1/2
Neff =
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L
tR2
--------- = 5,54 . -----------H
1/22
Chromatographie
Pic gaussien
0,6
0,5
1/2
= 1/2 / (8 Ln 2)1/2
tR
tR
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Chromatographie
1 Gnralits

Calculer de H partir de lquation de Van Deemter (CPG initialement).
H = A
H = 2 . dP .
B / u
+ 2 . . DM
: hauteur dun plateau thorique

: rgularit du remplissage
dp : diamtre des particules
8 . k . e2
/ u + --------------------------- . u
2 . (1 + k)2 . DS
: facteur de tortuosit
DM :: diffusivit de lchantillon dans la phase mobile
DS :: diffusivit de lchantillon dans la phase stationnaire
k : facteur de capacit
e : paisseur de la phase stationnaire (grains)
u : vitesse linaire de dplacement de la phase mobile
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Chromatographie
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Chromatographie
1 Gnralits

H =
H = 2 . dP .
Hauteur dun plateau
thorique
B / u
+ 2 . . DM / u
+
+
8 . k . e2
--------------------------- . u
2 . (1 + k)2 . DS
: diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins

diffrents entre les molcules : diffusion turbulente
B : facteur correspondant la diffusion normale du liquide pendant lanalyse :
diffusion longitudinale
C : facteur correspondant la diffusion dans la phase stationnaire : rsistance au
transfert de masse
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Chromatographie
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Chromatographie
1 Gnralits

H =
: facteur correspondant
aux chicanes, aux chemins
diffrents entre les molcules
: diffusion turbulente
2008-2009
B / u
B : facteur correspondant
la diffusion normale du
liquide pendant lanalyse :
diffusion longitudinale
Chromatographie
C : facteur correspondant la
diffusion dans la phase
stationnaire : rsistance au
transfert de masse
30
Chromatographie
1 Gnralits

H =
Hauteur dun plateau

thorique
B / u
B/u
C.u
A
u
Conclusions :
- existence dun dbit optimum pour obtenir une hauteur minimale dun
plateau thorique (nombre maximal de plateaux thoriques)
- pour viter la diffusion (largissement des pics), il faut grains de faible
diamtre (mais pertes de charge)
- importance du remplissage Chromatographie
de la colonne.
2008-2009
31
Chromatographie
1 Gnralits

B Rsolution
La rsolution est, pour une

colonne, la capacit de
sparation de deux soluts.
VR1 - VR2
Rs = 2 --------------------1 + 2
1 VR1
2008-2009
Chromatographie
2 VR2
VR
32
Chromatographie
1 Gnralits
1 4 Divers temps dune chromatographie sur

colonne
- Mise en contact des soluts avec la phase stationnaire
(soluts susceptibles dtre fixs et soluts non
susceptibles dtre fixs) : charge de la colonne
- passage dune phase mobile 1 : sortie de la colonne
(lution) des soluts non susceptibles dtre fixs et
obtention de lluat 1 (filtrat)
- passage dune phase mobile 2 : luant vrai qui rompt
les liaisons entre solut et phase stationnaire (lution
vraie) et obtention de lluat 2.
VR
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Chromatographie
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2008-2009
Chromatographie
34
Chromatographie
1 Gnralits
1 5 Divers types de mise en uvre dune

chromatographie en phase liquide
- basse pression
- moyenne / haute pression ; actuellement
chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC)
VR
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Chromatographie
35
Chromatographie
2 Principes des mthodes
de chromatographie
Cours TB
2008 - 2009
2008-2009
Chromatographie
36
Chromatographie
2 Principe des mthodes de
chromatographie
change dions
3 Mthodologie et
applications
3 1 Mthodologies
B Diffrence

biospcifiques
3 2 Applications

hydrophobes
chlation

amins
HPLC
FPLC
2008-2009
Chromatographie
37
Chromatographie
2 Principe et utilisation des mthodes de chromatographie
2 1 1 Principe : interaction
2 1 2 Phase stationnaire
2 1 3 Phase mobile
2 1 4 Conditions de fixation et dlution
2 1 5 Utilisation
2 3 Chromatographie par change dions
2 5 Chromatographie par interactions biospcifiques
2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes
2 7 Chromatographie par chlation (IMAC = Immobilised
metal affinity chromatography )
2008-2009
Chromatographie
38
Chromatographie
2 Principe des mthodes de chromatographie
2 1 1 Principe
Fixation, en gnral, par des liaisons lies la polarit
Support solide
2008-2009
Support solide
Adsorption
Chromatographie
Dsorption =
remplacement par
une autre molcule
39
Chromatographie
2 1 2 Phase stationnaire,
Solide insoluble, finement divis, "actif " (capable de fixer des
soluts)
- polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont
activer .
- non polaire : carbone actif

- sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour
les protines
2 1 3 Phase mobile
Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG)
Ralise la rupture des liaisons solut - phase stationnaire
(phnomne de dsorption)
2008-2009
Chromatographie
40
Chromatographie
- Cas des liaisons polaires :
par ordre d'adsorption croissante,
esters, ctones et aldhydes, alcools et les amines, acides et les bases
Utilisation de gradients de solvants organiques polaires

- Cas des protines : gradient croissant de tampon phosphate
2008-2009
Chromatographie
41
Chromatographie
2 1 5 Utilisation
- utilise pour la sparation des molcules organiques de masse molculaire
infrieure 1000 g.mol-1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire :

* fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gner telle
ou telle mthode analytique. (phase liquide, chelle analytique)
* fixation de substances pyrognes existant dans une solution destine
lusage parentral. (phase liquide, chelle industrielle)
* sparation des acides gras (mthyls) (phase gazeuse, chelle
analytique).
-gel d'hydroxyapatite et le phosphate tricalcique utiliss pour la sparation des
protines ; techniques concurences par la chromatographie dinteractions
hydrophobes
-- mise en uvre en basse presioon, CLHP, et chromatographie de surface
2008-2009
Chromatographie
42
Chromatographie
Type
d'interaction
Phase stationnaire
Phase mobile
Conditions d'lution
Fixation de soluts
sur
un support solide
par
ADSORPTION
- Liaisons
polaires
(le plus souvent)
- Liaisons non
polaires
(cas du carbone
actif)
Solide insoluble, finement divis,

"actif "
capable de fixer des soluts)
- polaire : gel de silice (Kieselguhr),
alumine
Ces supports sont activer
- non polaire : carbone actif
- sels de calcium : phosphate
tricalcique,
hydroxyapatite pour les protines
Liquide (CPL)
ou
gazeuse (CPG)
Ralise la
rupture
des liaisons
solut phase
stationnaire
(phnomne de
dsorption)
- Cas des liaisons polaires :

par ordre d'adsorption
croissante,
on a les
esters, puis les ctones et
aldhydes, puis les alcools
et les
amines et enfin les acides et
les
bases
Utilisation de gradients de
solvants organiques
polaires
- Cas des protines : gradient
croissant de tampon
phosphate
2008-2009
Chromatographie
Mise en uvre et
Applications
- Sur colonne (CPL,
CPG)
- Sur couche mince
(CCM)
- Molcules
organiques
(M < 1000 g.mol-1)
comme
mtabolites,
mdicaments
- Sparation
d'hydrocarbures
sur carbone actif
- Protines :
recherche
(ancien)
43
Chromatographie
2 2 1 Principe
2 2 2 Supports
2 2 4 Utilisation
2008-2009
Chromatographie
44
Chromatographie
2 2 1 Principe
Sol
Sol
Support
Phase
solide stationnaire
Phase
mobile
phases
normales
Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbe sur un

support solide)
phases
inverses
Solubilisation dans une phase liquide apolaire adsorbe sur un

support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixs sur un support
solide
2008-2009
Chromatographie
45
Chromatographie
n
o
r
m
a
l
e
s
i
n
v
e
r
s
e
s
Solubilisation dans
une
phase liquide
(adsorbe sur un
support
solide)
Solubilisation dans
une
phase liquide adsorbe
sur un support ou
radicaux hydrophobes
fixs sur un support
solide
2008-2009
Liquide polaire : eau, par exemple
- Liquide apolaire plus ou moins visqueux

- Chanes hydrocarbones en C8, C16, C18,
phnyl, fixes sur de billes de silice,
agarose, rsine ou verre
Solvants
organiques
peu polaires
Solvants
organiques
plus polaires que la
phase stationnaire
Chromatographie
Gradient de polarit croissante
Gradient de polarit dcroissante
- Sur colonne (CPL,

CPG)
- Sur couche mince
(CCM)
- Petites molcules
polaires
comme les acides amins
- Sur colonne (CPL,

CLHP)
- Petites molcules
apolaires, comme des
drivs d'acides amins
46
Chromatographie
2 2 2 Supports
- terme "support" prciser : matriau inerte qui sert de fixateur (inerte) la phase
stationnaire liquide. Il permet cette phase stationnaire dtre en un tat physique
liquide.
= support bien distinguer ici de la phase stationnaire.
- supports = solides finement diviss qui prsentent une trs grande surface, ceci afin
de retenir dans un petit volume une grande quantit de phase liquide ; rtention
nergique de phase stationnaire, sans interaction avec les soluts ; les proprits
dadsorption doivent tre totalement masques.
2008-2009
Chromatographie
47
Chromatographie
2 2 2 Supports
- utilisation possible de la plupart des phases stationnaires de la chromatographie
dadsorption sous forme poreuse ou pelliculaire.
gel de silice trs souvent employ car peut retenir jusqu 70 % de

son poids deau ; grande capacit et bonne rtention des solvants mais garde
certaines proprits dadsorption..
Terre de diatomes, autre support siliceux, naturel (squelette siliceux
dinfusoires ou Kieselguhr ou clite) ; peut retenir de grandes quantits de
solvant, mme polaires.
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Chromatographie
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Chromatographie
2 2 2 Supports
- billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire lobjet de greffage de groupements
fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : ralisation dune
silanation , cest dire traitement par des drivs permettant la fixation de
groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses.
- sont galement utilisables, la poudre de cellulose et un certain nombre de polymres
synthtiques drivs du vinylbenzne.
2008-2009
Chromatographie
49
Chromatographie
2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles
A - Les phases stationnaires
1 - Chromatographie en phases normales
-phase stationnaire liquide (assez) polaire : classiquement (Martin et Synge) des
solutions aqueuses alcalines, acides ou tamponnes, de mthanol ou dthanol
- simplement eau,
- aussi de substances visqueuses :
theroxydes rendus trs polaires par la prsence de groupements hydroxyles ou nitrile :
thers, glycols, polythylne glycols, oxydipropionitrile.
2008-2009
Chromatographie
50
Chromatographie
A - Les phases stationnaires
2 - Chromatographie en phases inverses
- phase stationnaire peu polaire ou apolaire

-chromatographie en phase gazeuse : polyesters de glycols, de polyethers de glycols, de
silicones, de carbures saturs ;
- chromatographie en phase liquide : chanes alkyles en C8 et C18 greffes sur de la silice
- dune manire gnrale, phases stationnaires prpares par imprgnation (par exemple, en prsence
de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des drivs halogns du silane).
2008-2009
Chromatographie
51
Chromatographie
B - Les phases mobiles
- choix et conditions demploi dune phase mobile : mmes considrations gnrales
que celles de la chromatographie dadsorption. :
- pouvoir solvant et inertie chimique vis vis des soluts
- compatibilit avec les systmes de dtection
- inertie chimique et insolubilit vis vis de la phase stationnaire
- Attention : une non miscibilit rigoureuse difficile obtenir : saturation des

phases les unes dans les autres par des contacts pralables :
mlange des solvants dans une ampoule dcanter et sparation ultrieure.ou, en CLHP,
passage du solvant dans une prcolonne, avant le systme dinjection, charge de phase
stationnaire.
2008-2009
Chromatographie
52
Chromatographie

B - Les phases mobiles
-En chromatographie de partage phases normales,

phase stationnaire = eau et
phase mobile
= butanol, dalcool benzylique, de chloroforme ou de
tolune.
En CLHP, on utilise les pentane, cyclohexane, hexane (purs ou additionns de
chloroforme), dichloromthane, ttrahydrofurane, chloroforme, dioxanne, ther butylique,
nitromthane, hexane mthanol.
- En chromatographie en phases inverses,

phase mobile (plus) polaire = eau, mthanol (CH3-OH), actonitrile (CH3-CN)
ou mlange de ces solvants.
2008-2009
Chromatographie
53
Chromatographie
2 2 4 Utilisation
- utilise sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse.
- sert la sparation de molcules organiques de masse molculaire infrieure
1000 g.mol-1
- sparation dantibiotiques, des substances anticancreuses, des mtabolites, de
substances prohibes (drogues, substances dopantes , ..)
- Phases normales (composs polaires)ou phases inverses (composs plus
hydrophobes)
- Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires dions (voir plus loin)
R1
R2
2008-2009
R3
R1
R4
R2
chantillon moins
hydrophobe
Chromatographie
R3
R4
Complexe hydrophobe
54
Chromatographie

2 3 1 Principe
2 3 2 Supports
2 3 3 Conditions de fixation et dlutions
2 3 4 Utilisation
2008-2009
Chromatographie
55
Chromatographie

2 3 1 Principe
- soluts lis la phase stationnaire par des liaisons ioniques
phase stationnaire = macromolcules changeuses d'ions, solide

-phase mobile
= tampon de pH et de force ionique dfinis :
fait cesser les interactions entre soluts et phase stationnaire
2008-2009
Chromatographie
56
Chromatographie

2 3 1 Principe
Support (Su)
Mlange sparer
+
+++ +
++ + +
+ +
+ +++
Groupement charge ici

positive

()
Extraction - purification des enzymes

2005 - 2006
57
Chromatographie

2 3 1 Principe
+
+++ +
++ + +
+
++ +++
+ + + + +
++
+ + +++
+

( )

2005 - 2006

()
par augmentation du pH
58
Chromatographie
2 3 2 La phase stationnaire : les changeurs dions

A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'changeurs
Selon le type de charge de lion chang, et la charge de lchangeur,

on distingue :
- changeurs danions
- changeurs de cations.
1-
les changeurs d'anions, changeurs sous forme cationique
Su-A+ Ye- + Xssupport charg +

Ye- =
2008-2009
<====> Su-A+ Xe-
solut
+ Ys-
solut fix
contre ion
Chromatographie
59
Chromatographie

1 - les changeurs d'anions, changeurs sous forme cationique

Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive :
en gnral damines I, II, III, IV
groupements les plus classiques pour les protines : groupements DEAE et TEAE.
- CH2 - CH3
DEAE, Su O- CH2 - CH2 - N
- CH2 - CH3
(changeur faible, non ionis certains pH, pH acides)
- CH2 - CH3
pKA = 9,5
- CH2 - CH3
Su O- CH2 - CH2 - N
+ H+ <=====> S O- CH2 - CH2 - N+ - H
- CH2 - CH3
- CH2 - CH3
- CH2 - CH3
+
TEAE,
Su O- CH2 - CH2 - N - CH2 - CH3
- CH2 - CH3
(changeur fort, ionis tous les pH)
2008-2009
Chromatographie
60
Chromatographie

2 - Les changeurs de cations, sous forme anionique

Su-A- Ye+ +
support charg -
Xs+
<==========> Su-A- Xe+
solut
+ Ys+
solut fix
Ye+ = contre ion
2008-2009
Chromatographie
61
Chromatographie
ECH
ANG
E
D'IO
NS
Fixation de soluts par

des liaisons ioniques
entre charges
opposes (faiblement
nergtique)
2008-2009
Billes de composs organiques naturels

(dextrane, cellulose, ), synthtiques
(polyacrylamide, rsines, ) ou minraux
(verre, silice, ) avec greffage de
groupements ioniss ou ionisables
changeant des anions ou des cations
- Anions : DEAE, AE,
- Cations : CM, SP,
Liquide : tampons
(Tris, phosphate,
citrate, ) de pH
et de donns
variant lors de
l'lution
Chromatographie
Gradient de pH (discontinu) et / ou
de force ionique croissante
(discontinu ou continu)
- Sur colonne (CPL,

CLHP)
- Sparation d'ions (acides
amins, ) et de
macroions (protines,
acides nucliques, )
62
Chromatographie

2 - les changeurs de cations, sous forme anionique

Exemples de groupements fonctionnels : -SO3-, - COO-, SP, CM
SP : sulfopropyle
CM carboxymthyle
Su - CH2 - CH2 - CH2 -SO3Su - CH2 COO-
Remarque : certains changeurs avec les 2 types.(en particulier pour la dsionisation de

leau)
2008-2009
Chromatographie
63
Chromatographie

B - Les supports
1 - Supports organiques
a - Polymres synthtiques
b - Polymres naturels
- Drivs du dextrane
- Drivs de la cellulose
- Drivs de lagarose
- Drivs mixtes
Document
2 - Supports minraux
2008-2009
Chromatographie
64
Chromatographie

A - Fixation
- choix de la nature (forme anionique ou cationique) de lchangeur utilis
- pH tel que les soluts se fixent
- fixation en prsence dun tampon de faible force ionique
B - Elution
- modification des interactions lectrostatiques entre solut et phase stationnaire :
changement de pH et/ou de force ionique.
- en discontinu ou en continu.
2008-2009
Chromatographie
65
Chromatographie

2 3 4 Utilisation
- utilise pour la sparation de toutes substances porteuses de charges lectriques

(acides amin, protines, )
- particulirement important pour les protines (supports hydrophiles).
2008-2009
Chromatographie
66

2005 - 2006
67
Charge + des protines

(cations) : sparation sur
changeur - (sur changeur de
cations)
CM
Charge - des protines (anions)

: sparation sur changeur +
(sur changeur danions)
DEAE

2005 - 2006
68
Chromatographie

2 4 1 Principe
2 1 2 Supports
2 1 4 Utilisation
2008-2009
Chromatographie
69
Chromatographie

- galement appele chromatographie de permation de gel, chromatographie
d'exclusion - diffusion
- origine :
mise sur le march d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement
rticul, le SEPHADEXTR, suite aux travaux en 1959 par PORATH et
FLORKIN.
2008-2009
Chromatographie
70
Chromatographie
GEL
FILT
RAT
ION
Type d'interaction
Phase stationnaire
Phase mobile
ABSENCE
d'interactions au sens
strict
Diffusion plus ou
moins grande dans un
support poreux : les
molcules les plus
grosses sont lues les
premires
Liquide contenu dans les billes poreuses

dont la matire constitue le support
Les supports sont des composs organiques
naturels (dextrane, agarose, ),
synthtiques (polyacrylamide, rsines, )
ou des composs minraux (verre ou silice)
Liquide : tampons
(Tris, phosphate,
citrate, ) de pH
et donns
2008-2009
Chromatographie
Conditions d'lution
Simple percolation de la colonne

par un tampon adquat, sans
modification au cours de l'lution
(lution isocratique)
Mise en uvre et
Applications
- Sur colonne (CPL,
CLHP)
- Sparation de
macromolcules (ADN,
protines, ) selon leur
taille
- Dtermination de M par
la reprsentation :
Kav = - log M + b
71
Chromatographie

2 4 1 Principe
- pas de liaison entre solut et phase stationnaire = pas, ici, de "rtention
- comportement diffrent des molcules du fait de leur diffusion ou non
lintrieur dune matrice poreuse = tamisage molculaire inverse dans un gel
= sortie en premier des grosses molcules, exclues des billes d'un gel, ; en dernier, les
petites qui ont diffus
= SEPARATION du fait de cette diffusion plus ou moins grande
Remarques : .
- sparation selon la taille des molcules dun type de forme dtermin (en gnral
forme globulaire)
- possibilit de dterminer les masses molculaires.
2008-2009
Chromatographie
72
2008-2009
Chromatographie
73
ve
vo
vt
2008-2009
Chromatographie
74
Chromatographie

2 4 1 Principe
A - La phase stationnaire
- constitue de grains de gel pourvus de pores de diamtres variables, ceci dans une
gamme permettant la diffusion des soluts de masses molculaires dtermines.
- pores de plus faible diamtre (diamtre minimal)
- pores de plus grand diamtre (diamtre maximal)
- ensemble de pores de diamtres intermdiaires
- un support de gel filtration ne permet la sparation que dans une gamme

dtermine de masses molculaires.
2008-2009
Chromatographie
75
Chromatographie

2 4 1 Principe
B -La phase mobile :
- ne fait pas cesser des interactions entre soluts et phase stationnaire qui
nexistent pas
- rle : simplement assurer le dplacement linaire des soluts .
-simple liquide qui passe travers la phase stationnaire
= liquide qui permet de garder les molcules dans leur tat natif, cest dire dun
simple tampon dans le cas des protines
Copie
2008-2009
Chromatographie
76
Chromatographie

2 4 2 Supports
- par dfinition, poreux
- conditionns sous forme de billes, pour faciliter le passage de la
phase mobile, cest dire diminuer les pertes de charge et viter le
colmatage
- peuvent tre organiques, minraux ou mixtes.
Documents
2008-2009
Chromatographie
77
Chromatographie

2 4 3 Conditions de sparation
A - Description schmatique du phnomne
Supposons le gel immobilis dans une colonne. Le comportement des soluts se divise
en 3 classes de comportements :
1 - Les grosses molcules
2 - Les petites molcules
3 - Les molcules de taille intermdiaire
Conclusion : Il y a pour chaque gel un domaine de masse molculaire :
- en dessous duquel il n'y a aucune sparation
- au dessus duquel il n'y a aucune sparation
- la sparation ne se ralise que dans un domaine de masse molculaire spcifique
du gel considr (en fait, il correspond au diamtre maximum (moyen) et minimum (moyen) des
pores).
2008-2009
Chromatographie
80
Mlange initial
CONSTITUANTS
NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES

Conclusion :
Seule sparation
2008-2009
Chromatographie
81
Chromatographie

B - Quantification ; dtermination des masses
molculaires
1 - Les divers volumes
a Description : dfinition des divers volumes
- Vo : volume mort
Aucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonne
Il correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel
- Vt : volume total de la colonne
Vt = volume du solut correspondant la percolation totale de la
colonne (extrieur et intrieur des billes)
- Ve : volume d'lution ; valeur intermdiaire entre vo et vt
2008-2009
Chromatographie
82
Chromatographie

molculaires
1 - Les divers volumes
b Interprtation de ces divers volumes
Vo : volume entre les grains

Ve : volume d'lution de la substance tudie
VT : volume total, cest dire somme des volume mort Vo, volume des grains Vg,
volume et volume de liquide dans les grains Vs.
REMARQUES :
- Vo et VT se retrouvent dans tous les types de chromatographie (cf caractres gnraux)
- Vo et VT sont caractristiques dune colonne remplie dune phase stationnaire donne,
percole avec une phase mobile un dbit donn ; il y a changement de ces divers volumes
caractristiques d'une colonne selon les conditions : dbit de phase mobile, pression, phase
mobile, tempraturedo ncessit de lutilisation dun paramtre caractrisant la
diffusion dun solut indpendamment de ces conditions ce sera KD.
2008-2009
Chromatographie
83
Approche de la valeur de Vs
partir de lexpression du volume total de la colonne
Vt = Vo + Vs + Vg
Vs
Vg
Vo
2008-2009
Chromatographie
84
CONSTITUANTS
NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES
ve
vo
vt

Conclusion :
Sparation
2008-2009
Chromatographie
85
Chromatographie

molculaires
2 - Le coefficient de diffusion KD, le coefficient de diffusion accessible : Kav
a - Le coefficient de diffusion KD
- Dfinition du coefficient de diffusion KD
coefficient de diffusion KD dun solut :

rapport du volume de solut suprieur Vo (soit Ve - Vo) sur le volume contenu dans
les grains Vs.
Ve - Vo
KD = ---------------Vs
2008-2009
Chromatographie
86
Chromatographie

molculaires
a - Le coefficient de diffusion KD
- Proprits du coefficient de diffusion
On dmontre que KD = - . log MM , do
KD
1
Log MM
2008-2009
Chromatographie
87
KD
1
0
Log MM
Mais ceci concerne KD et log MM, avec

KD =
Ve - Vo
---------------Vs
Or, pour dterminer KD, il faut connatre Vs. ce qui nest pas
le cas ..
do une approche de la valeur de Vs, par exemple,
partir de lexpression du volume total de la colonne
2008-2009
Chromatographie
88
Chromatographie

molculaires
b - Le coefficient de diffusion accessible KAV
Vt = Vo + Vs + Vg
do Vs = Vt - Vo - Vg
Or Vg est ngligeable. On peut donc admettre que
Vs = Vt - Vo
dtermination du coefficient de diffusion; alors appel
coefficient de diffusion accessible ... Kav (available = accessible)
Kav
2008-2009
Ve - Vo
= --------------Vt - Vo
Chromatographie
89
ve
vo
vt
Log kDa
Kav
2008-2009
Copie
Chromatographie
90
Courbes thoriques
Courbes exprimentales
KAV
log MM
log MM
et
2008-2009
Log MM
KAV
= - c . Ve + d
Chromatographie
91
Chromatographie

molculaires
c - Dtermination de masse molculaire par chromatographie
de gel filtration
diverses oprations raliser :

- Dtermination de Vo et Vt avec des substances appropries
- Passage de substances talons (dans de domaine de sparation) ; ralisation
des calculs de Kav ; construction de la courbe
- passage de la substance analyser ; calcul de Kav et report sur la courbe
2008-2009
Chromatographie
92
Dtermination de masse molculaire par chromatographie

de gel filtration 1/2
1 - Dtermination de vo et vt avec des substances appropries
2 - Passage de substances talons (dans le domaine de sparation) ;

ralisation des calculs de Kav ; construction de la courbe
Kav
Calcul des Kav
Log kDa
Copie2008-2009
Chromatographie
93
Dtermination de masse molculaire par chromatographie

de gel filtration 2 / 2
3 - Passage de la substance analyser ; calcul de Kav et report sur la courbe

Kav
Calcul du Kav
Kav
Log kDa
Log kDaX
Copie2008-2009
Chromatographie
94
Exprience de dessalage

2005 - 2006
95

2005 - 2006
96

2005 - 2006
97
Chromatographie

2 4 4 Utilisation
- initialement dveloppe pour la sparation des protines
sparation
dtermination de la masse molculaire, en concurrence avec
l'lectrophorse en gel de polyacrylamide en milieu dnaturant
- dessalage des solutions protiques
- concentration des solutions protiques (en batch).
2008-2009
Chromatographie
98
Chromatographie

(chromatographie daffinit)
2 5 1 Principe
A - Gnralits
- condition sine qua non : solut sparer (protine) capable de se fixer rversiblement
un ligand spcifique qui est attach une matrice insoluble.
M
+
L
<=====
MacroLigand
molcule
attach
la matrice
ML
Complexe
- ncessite une connaissance prliminaire dtaille de la structure et de la spcificit

biologique du compos purifier
2008-2009
Chromatographie
99
Chromatographie

( RL)/(L)
2 5 1 Principe
KA n (P)
A - Gnralits
M
KA =
<=====
ML
(M L)
----------------(M) . (L)
n (P)
- valeurs de KA comprises ici entre 105 et 108 M-1

- dtermination de KA la mthodologie de Scatchard
( RL)/(L) = KA n (P) - KA (RL)
2008-2009
Chromatographie
100
(RL)
Mlange sparer au
contact de la phase
stationnaire
Fixation spcifique de la protine

( adsorption ) au sens large
Libration de la phase solide (dsorption)
101
Chromatographie

Type d'interaction
- Fixation des soluts
par des interactions
spcifiques avec un
ligand fix par
covalence sur un
support solide
- Interactions protine ligand caractrise par
la constante de
dissociation "KD"
2008-2009
Phase stationnaire
- Billes de composs organiques naturels
(dextrane, cellulose, ), synthtiques
(polyacrylamide, rsines, ) ou minraux
(verre, silice, ) avec greffage d'un ligand
par covalence
- Exemples de ligands (classiquement de
petites molcules) : 2',5'-ADP, 5'-AMP,
arginine, bleu Cibacron, calmoduline,
polyU, protine A, protine G,
Phase mobile
Conditions d'lution
Mise en uvre et
Applications
Liquide : tampons
(Tris, phosphate,
citrate, ) de pH et
donns.
Variation au cours
de l'lution et / ou
tampon contenant
une substance plus
forte affinit pour le
ligand
- Gradient de pH (discontinu) et / ou
de force ionique croissante
(discontinu ou continu)
- Gradient de ligand de meilleure
affinit
- Sur colonne (CPL, CLHP)

- Exemples d'application :
interaction enzyme substrat, antigne anticorps, hormone rcepteur,
Trs efficace lors de la
purification des enzymes
Chromatographie
102
Chromatographie

2 5 1 Principe
B La phase stationnaire
- Support (solide) sur lequel est fix un ligand par une liaison solide, une liaison covalente
C La phase mobile
- Tampon faisant diminuer les interactions entre soluts et phase stationnaire (ligand) ou
contenant un ligand ayant davantage daffinit pour le solut macromolculaire.
2008-2009
Chromatographie
103
Chromatographie

2 5 2 La phase stationnaire
A Le support
* proprits de la matrice idale pour la chromatographie dinteractions

biospcifiques :
- possder les groupements chimiques permettant la fixation covalente du
ligand et tre stable dans les conditions de cette fixation
- interagir faiblement avec les autres macromolcules pour minimiser les
adsorptions non spcifiques
- possder de bonnes proprits de flux.
* En pratique, particules sphriques, uniformes, et rigides :

- les dextranes rticuls (SEPHACRYL S)
- l'agarose (SEPHAROSE, BIO - GEL A)
- les gels de polyacrylamide (BIO - GELS P)
- le polystyrne(BIO - BEADS S)
- la cellulose
- le verre poreux et la silice.
2008-2009
Chromatographie
104
Chromatographie

2 5 2 Les supports
B Le ligand
1 - Gnralits : choix du ligand

- nature chimique du ligand dtermine par la connaissance prliminaire de la
spcificit biologique du compos purifier.
- frquemment possible de slectionner un ligand qui montre une spcificit
absolue
- D'un autre cot, possible de slectionner un ligand qui prsente une
slectivit de groupe : il fixe des composs qui possdent une spcificit
chimique dtermine :
Exemple : AMP 5' qui peut fixer rversiblement beaucoup de
deshydrognases NAD+ car l'AMP 5' est analogue, du point de vue structure,
une partie de la structure du NAD+.
2008-2009
Chromatographie
105
2008-2009
Chromatographie
106
Copie
2008-2009
Chromatographie
107
Copie
2008-2009
Chromatographie
108
Chromatographie

2 5 2 Les supports
B Le ligand
2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire

a - Groupement fonctionnel permettant la fixation
b - Utilisation d'un bras ( arm - spacer )
c - Ractions de fixation
2008-2009
Chromatographie
109
Chromatographie

2 5 2 Les supports
B Le ligand
2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire

Groupement fonctionnel permettant la fixation
- ligand avec groupement chimique adquat pour permettre sa fixation la matrice
(support) : groupements fonctionnels comme : - NH2 , - COOH, - SH et OH
- support avec groupements fonctionnels compatibles =
activation (voir synthse peptidique et immobilisation des enzymes).
Copie
2008-2009
Chromatographie
110
Chromatographie

A Fixation des soluts
Conditions favorisant les interactions :
- pH,
- force ionique assez forte pour minimiser l'adsorption non spcifique
des polylectrolytes et des groupements chargs sur le ligand
- prsence de cofacteurs comme des ions mtalliques ncessaires
l'interaction entre le ligand et les macromolcules.
Pour que la fixation soit complte, ces conditions doivent tre

optimises.
Copie
2008-2009
Chromatographie
119
Chromatographie

B - Elution
1 - Sortie des substances non fixes (luat 1)
Passage d'un tampon faisant sortir de la colonne ce qui n'est pas fix.
2 - lution non spcifique
Changement de pH : acide actique dilu ou de lammoniaque (NH4+ OH-)
= changement dans l'tat d'ionisation de groupes ionisables du ligand ou de la
macromolcule (critique dans la liaison ligand macromolcule).
Changement de force ionique : peut tre effectu sans changement
concomitant de pH : ceci provoque une lution due la rupture des interactions entre
ligand et macromolcules ; utilisation, par exemple, de NaCl 1 M
2008-2009
Chromatographie
120
Chromatographie

B - Elution
3 - Elution spcifique
utilisation de substances ayant une plus grande affinit pour le ligand ou
pour la macromolcule :
- substrats ou inhibiteurs rversibles de la macromolcule s'il s'agit d'un enzyme
- autre ligand ayant plus grande affinit pour la macromolcule : NADP+ dans le
cas de l'AMP 5'
Remarque :
ncessit dliminer (par exemple par gel filtration) les produits utiliss pour l'lution :
sels,
lautre ligand, ....
2008-2009
Chromatographie
121
Chromatographie

2 5 4 Utilisation
A Sparation dune molcule prsente dans un
mlange
1 - Spcificit absolue
Sparation spcifique de protines :
- enzymes :
- inhibiteur (comptitif) utilis comme ligand (arginine, benzamidine, )
- analogues de coenzymes : 5AMP, 2,5 ADP comme ligand
- isolement d'enzymes du mtabolisme des acides nucliques par utilisation de
nuclotides immobiliss comme ligand
- rcepteurs d'hormones
- hormone utilise comme ligand
Remarque : utilisation galement possible pour
- la concentration de solutions dilues
- la sparation de molcules natives de molcules dnatures
2008-2009
Chromatographie
122
Ligand
Substances spares
Copie
2008-2009
Chromatographie
123
Ligand
Substances spares
Copie
2008-2009
Chromatographie
124
Chromatographie

2 5 4 Utilisation
A Sparation dune molcule prsente dans un
mlange
1 - Spcificit absolue
Sparation spcifique dacides nucliques :
* sparation d'ARN m par hybridation sur des colonnes de poly (U)SEPHAROSE 4B
* sparation d'ARN viral sur des colonnes de poly (A)-SEPHAROSE 4B :
ceci est utilis pour la prparation des ADN copies
* sparation d'ARN complmentaire et d'ADN partir d'ADN sb fix sur
matrice
2008-2009
Chromatographie
125
Chromatographie

2 5 4 Utilisation
A Sparation dune molcule dun mlange

2 - Spcificit de groupe
* utilisation de colorants fixant des familles de macromolcules "dye-ligand
chromatography"
- BLEU CIBACRON : colorant coupl un support par la triazine utilis
comme ligand pour purifier des protines : interaction moins spcifique : sparation de
srum albumine (voir TP), d'interfron, de plasminogne et denzymes de restriction
- Rouge Procion (isolement denzymes ayant des cofacteurs nuclotidiques)
* Autres substances
calmodulines,
concavaline A
immunoglobulines IgG : protine G utilise comme ligand
lectines
hparine : isolement de facteurs de croissance et de coagulation 2008-2009
Chromatographie
127

2005 - 2006
128

2005 - 2006
129
Chromatographie

2 5 4 Utilisation
B Techniques drives
1 - Sparation de cellules
- Sparation de cellules dans un mlange
- Par exemple,
- utilisation des proprits antigniques de la surface cellulaire
- utilisation de la nature chimique des rsidus hydrates de carbone sur
la surface
- utilisation des interactions entre un rcepteur membranaire et le
ligand.
Exemples de ligand : la protine A (qui assure la liaison avec les rgions Fc
des Ig),
les lectines
des ligands spcifiques pour des rcepteurs
membranaires.
2008-2009
Chromatographie
130
Chromatographie

2 5 4 Utilisation
B Techniques drives
2 - "Covalent chromatography"
- formation d'une liaison covalente entre le ligand li et le compos
sparer (en gnral des protines) = pont disulfure entre thiols
- support : thio-propyl SEPHAROSE et le thio-SEPHAROSE
- lution ralise par addition de dithiothreitol ou de cystine qui vont se
fixer sur le support
- technique utilise pour purifier la papane ou lurase qui ont beaucoup de
groupements thiols, de mme pour la sparation des mRNA nouvellement synthtiss.
2008-2009
Chromatographie
131
Chromatographie

Introduction : historique :
expriences de "contrle" effectues lors du dveloppement des supports de
chromatographie d'affinit
tude du comportement de matrices contenant des bras espaceurs en l'absence de
ligands
dans la plupart des cas, aucune fixation notable = comportement espr
dans certains cas (bras hxamthylne), forte liaison des enzymes mme en
l'absence de groupements chargs (amine ou carboxylique ) aux extrmits qui
auraient pu fonctionner comme des changeurs d'ions
utilisation pour la sparation de protines dune chromatographie d'interactions
hydrophobes , c'est--dire dune chromatographie fonde sur les interactions entre
des chanes aliphatiques d'un support et les rgions hydrophobes la surface de
protines.
Copie2008-2009
Chromatographie
132
Chromatographie
- Peu de fixation de protines de courtes chanes aliphatiques faible concentration

saline (les interactions ioniques prdominent)
- les interactions hydrophobes augmentent avec l'augmentation de la force ionique : les
sels masquent les interactions lectrostatiques (et provoquent la prcipitation par
SOLTING OUT (sulfate d'ammonium)) = extension de la chromatographie toutes
les protines
- Inconvnient : prcipitation des protines.
Copie2008-2009
Chromatographie
133
Chromatographie

2 6 1 Principe
- prsence de rsidus superficiels non polaires chez beaucoup de protines
Copie2008-2009
Chromatographie
134
Copie2008-2009
Chromatographie
135
Chromatographie

2 6 1 Principe
Fixation de la protine
lution de la protine
( adsorption ) au sens large

sur les groupements hydrophobes

2005 - 2006
136
Chromatographie

2 6 1 Principe
- possibilit dutiliser ces interactions entre ces groupements et des groupements non
polaires fixs un support fixe.
A - Phase stationnaire
- supports classiques possdant des groupements hydrophobes
B - Phase mobile
- tampons permettant de diminuer les interactions hydrophobes entre support et
protines : par exemple, en diminuant la salinit du tampon.
Copie2008-2009
Chromatographie
137
Chromatographie

2 6 2 Les phases stationnaires
- le plus souvent drivs de lagarose (SEPHAROSETR) avec substitution par
des groupements amino hexyl ou octyl.
- une des structures les plus classiques avec des groupements hydrophobes phnyl
ou octyl :
phnyl
SEPHAROSE - O - CH2 - CH - CH2 - O
OH
(CH2)7 - CH3
(octyl)
Copie2008-2009
Chromatographie
138
Chromatographie

A - Fixation
- forte force ionique afin de favoriser les interactions hydrophobes
- en fait, concentration en sel (sulfate d'ammonium) juste infrieure celle
provoquant la prcipitation de la protine purifier.
- effet de la nature des ions sur les interactions hydrophobes et la
prcipitation :
anions :
PO43- > SO42- > CH3-COO- > Cl- > Br- > SO42- > ClO4- > I- > SCNcations :
NH4+ < K+ < Na+ < Li+ < Mg2+ < Ca2+ < Ba2+
Plus la structure est perturbe, moins l'interaction hydrophobe est marque
Copie2008-2009
Chromatographie
139
Chromatographie

B - Elution
- diminution de la temprature
- utilisation de solvants organiques
- diminution de la force ionique (remplacer le sulfate d'ammonium par du
chlorure mercurique)
- diminuer la polarit de l'luant (thylne glycol - SDS)
- diminuer le pH : rduction des effets d'change d'ions dus aux charges
positives associes au couplage de l'isoure dans la matrice.
Copie2008-2009
Chromatographie
140

2005 - 2006
141

2005 - 2006
142
Chromatographie

2 6 4 Utilisation
- Technique utilise
pour la sparation des protines dans des conditions

assez semblables celles de la prcipitation fractionne par les sels.
- En fait, sparation sans trs grande efficacit : chevauchement des composs

les uns sur les autres. Aprs une prcipitation fractionne, les chances
d'obtenir une bonne sparation sont minces...
Copie2008-2009
Chromatographie
143
Chromatographie

2 6 4 Utilisation
- Aspects positifs :
- capacit de rtention des protines aussi importante que celle ralise pour
l'change d'ions
- puisque la sparation est ralise haute concentration saline, il n'est pas
ncessaire de changer le tampon avant application
- du fait de l'effet stabilisant des sels, le rendement de rcupration de lactivit
biologique est le plus souvent excellent.
- Protines fixes faible concentration saline = celles ayant une faible

solubilit dans l'eau : globulines, protines associes aux membranes et
protines prcipitant entre 20 et 40 % de sulfate d'ammonium ; peuvent tre
difficiles luer.
- Technique en progression.
Copie2008-2009
Chromatographie
144
Chromatographie
2 6 5 Technique drive : chromatographie par appariement

dions
- addition la phase mobile de substances ioniques capables de former avec
les soluts sparer des paires dions caractre hydrophobe
R1
R2
Agent de la ralisation de la
paire dions
R3
R1
R4
R2
chantillon moins
hydrophobe
R3
R4
Complexe hydrophobe
- des sels dammonium quaternaires tels que les ttrathyl ou

ttrabutylammonium (+Nbu4) pour les composs ioniques
- des alkylsulfonates pour la sparation des cations forms par protonation des
amines
- favorise leur rtention sur les silices greffes n-octyle : C8 ou n-octadcyle : C18 =
sparation possible de composs ioniss ou ionisables.
2008-2009
Chromatographie
Phases rverses
145
R1
R2
Agent de la ralisation de la
paire dions
R3
R1
R4
R2
chantillon moins
hydrophobe
R3
R4
Complexe hydrophobe
Bu
Bu - N+ - Bu
Bu -
CH3 CH2 CH2 CH2
butyl
Bu
Sparation en phases inverses
2008-2009
Chromatographie
146
Chromatographie
2 7 " Metal chelate chromatography" ou "Immobilised

metal affinity chromatography (IMAC)
technique drive de la chromatographie daffinit :
sparation des protines de mme taille et de mme point isolectrique selon
leur affinit pour des ions mtalliques immobiliss par chlation (Zn2+, Cu2+, Cd2+,
Co2+ Hg2+ et Ni2+).
fixation des macromolcules en fonction du pH et de la prsence d'un rsidu
histidine dans la macromolcule.
chantillon appliqu pH neutre et lution du compos en diminuant le pH et la
force ionique du tampon ou en incluant de lEDTA dans le tampon (autres chlatants d'ions :
l'acide iminodiactique et le TRIS(carboxymthyl) thylnediamine)
(technique utilise pour la sparation du fibrinogne, de la superoxyde

dismutase et des protines nuclaires diffrentes des histones)
utilisation pour des protines recombinantes (de fusion) dans lesquelles sont
inclus des tags (poly His) qui fixent des ions (Ni2+)
2008-2009
Copie
Chromatographie
147
- technique utilise pour la sparation du fibrinogne, de la superoxyde

dismutase et des protines nuclaires diffrentes des histones
- Utilisation pour des protines recombinantes (de fusion) dans

lesquelles
sont inclus des tags (poly His) qui fixent des ions
2+
(Ni )
- protines de fusion : protines obtenues par gnie gntique (expression
dans une cellule hte E. coli) comprenant :
- la protine dintrt
- un morceau ( domaine ) dune protine servant de marqueur (tag) :
ici poly His
(mieux accepte par la cellule hte + facilit de sparation)
Fixation des protines

(azote de His) par
lintermdiaire
dions
2+
2+
2+
2+
2+
2+ 2+
minraux
(Me = Ni par exemple (Zn , Cu , Cd , Co Hg et
2+
Ni
)).
- lution par EDTA, par exemple

2005 - 2006
148
Protines de fusion
Squence tag
gne dintrt
ADN recombinant = obtenu

par gnie gntique
Expression

2005 - 2006
149
2008-2009
Chromatographie
150
2008-2009
Copie
Chromatographie
151
Chromatographie
3 Mthodologie et applications
Cours TB
2003 - 2004
2008-2009
Chromatographie
152
Chromatographie
1 Gnralits
1 1 Dfinition de la
chromatographie : principes
gnraux
1 1 1 - Dfinition
1 3 1 - Modlisation intuitive
1 3 2 - Volumes de rtention
1 2 - Diffrents types de
chromatographies
1 3 3 - Coefficient de partition,
constante de distribution
1 3 4 -Facteur de capacit, facteur de
partition
1 3 5 - Facteur de slectivit
1 2 1 - Classification selon ltat des

phases
1 2 2 - Classification selon le principe
des interactions entre solut et phase
stationnaire
1 3 7 - Reprsentation schmatique
dimmobilisation de la phase
dune chromatographie
stationnaire
1 2 4 - Classification selon les
modalits de migration de la phase
2008-2009
Chromatographie
153
mobile
Chromatographie
2 Principe des mthodes de
chromatographie
change dions
3 Mthodologie et
applications
3 1 Mthodologies
B Diffrence

biospcifiques
3 2 Applications

hydrophobes
2 7 Autres chromatographies

amins
HPLC
FPLC
2008-2009
Chromatographie
154
Chromatographie
Mthodologie et applications
3 1 Mthodologies
1 Gnralits
a Les divers temps de mise uvre et

appareillage
b Les principales mthodologies
c Les principales diffrences entre
mthodologies
2 Basse pression
a Appareillage
b Mthodologie
B Diffrences
3 1 3 Chromatographie en batch et
mthodologies drives
3 Moyenne haute pression

a Appareillage
b Mthodologie
1 Appareillage
2 Mthodologie
3 2 Applications
amins
HPLC
FPLC
2008-2009
Chromatographie
155
Chromatographie
3 1 Mthodologies
B Diffrences
2008-2009
Chromatographie
156
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2008-2009
Chromatographie
157
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
a - Les divers temps de la mise en uvre et
lappareillage utilis
b Les principales mthodologies
c Principales diffrences entre les mthodologies
2008-2009
Chromatographie
158
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
a1 Les divers temps de la mise en uvre

- Mise en service et vrification de lappareillage
- Prparation des ractifs
- Prparation et mise en place de la phase stationnaire
- charge de la colonne
- lution des substances non fixes
- lution des substances fixes
- Dtection
- Lavage
- Exploitation des rsultats
2008-2009
Chromatographie
159
2008-2009
Chromatographie
160
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
a2 Lappareillage utilis pour la mise en uvre

- support : choix avec nature chimique, granulomtrie, tat physique (sec
ou humide)
- colonne : choix de la forme (rapport hauteur / diamtre) qui doit tre
adapt au type de chromatographie choisi ; taille de la colonne ;
prparation de la colonne (vrification de lhomognit du support =
remplissage et le vrifier exprimentalement; garder les colonnes prpares
(basse pression ; chambre froide))
-rservoir de phase mobile et pompe : prparation de la phase mobile et
vrification de son dbit (stabilit) et de la pression
- introduction de l'chantillon analyser
- lution : appareil gradient ou non : gradient ; gradient discontinu et
gradient continu ou absence de gradient (isocratique)
2008-2009
Chromatographie
161
lution par gradient

Gradient discontinu
Gradient continu
En ordonnes, intensit dun paramtre physico-chimique P permettant llution (polarit, pH, force
ionique , concentration en ligand, temprature)
Intensit de P
Plusieurs tapes
Attention :
difficile pour pH
Intensit de P
Une seule tape

linaire
convexe
concave
2008-2009
Volume de
Existence
phase mobile
Chromatographie
de gradients
dcroissants
Volume de
phase mobile
162
Appareil gradient
Intensit de P
C1
C2
V1
V2
Volume de
phase mobile
Vers colonne
2008-2009
Chromatographie
163
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
a2 Lappareillage utilis pour la mise en uvre
- dtecteur : dtection des soluts et leur quantification

- systme informatique : stockage et traitement des informations,
commande et contrle du systme
insrer figure des diffrentes parties d'un appareil de chromatographie
2008-2009
Chromatographie
164
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
b - Les principales mthodologies
1 - Initialement : phase stationnaire dans une colonne avec

percolation de la phase mobile, ventuellement en augmentant
la pression hydrostatique (en levant le niveau du rservoir de
solvant) pour obtenir un dbit acceptable (1 mL / min)
mais
mauvais comportement des supports :
- colmatage du SEPHADEX devant l'augmentation de la pression
- particules anguleuses (alumine et gel de silice) ; perturbation du flux
et mauvaises performances
= impossibilit d'augmenter les pressions (impossible dobtenir

qques atm)
= chromatographie basse pression

2008-2009
Chromatographie
165
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
2 - apparition de nouveaux supports (adsorption et partage au dbut)

- plus fins et billes (meilleure sparation) mais augmentation
des pertes de charges
- rsistant une augmentation de pression
d'o le
Concept de
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) ou
Chromatographie Liquide Haute Pression(CLHP)
2008-2009
Chromatographie
166
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
3 - De tels supports = non adapts aux substances protiques.

PHARMACIA (1975 ?) : supports d'change d'ions initialement
hydrophiles (rsines) et permettant de fonctionner une pression plus faible,
adapte au protines :
concept de FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography").
d'ou le concept de chromatographie moyenne pression
4 - supports de proprits semblables proposs par d'autres fabricants : supports
de types plus nombreux, fonctionnant pression plus rduite ; globalement
augmentation des performances par rapport la basse pression
Concept de
Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) ou
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2008-2009
Chromatographie
167
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
Conclusion :
On distinguera :
- chromatographie basse pression
- chromatographie moyenne et haute pression
(chromatographie haute performance)
2008-2009
Chromatographie
168
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
- Colonne
1 - Taille
- colonnes beaucoup plus petites en FPLC et HPLC pour chelle prparative et
analytique : quelques ml ont mme efficacit que 100 ml en basse pression
- grosses colonnes l'chelle dveloppement et industriel : 10 litres ...60 cm
de large et 50 cm de hauteur
2 - Support
- grandes varits : aspect commercial voir catalogues
- finement diviss ; homognit des supports
2008-2009
Chromatographie
169
Colonnes de chromatographique
Principaux types (laboratoire)
Moyenne / haute pression
Basse pression
2008-2009
Chromatographie
170
Principaux types (laboratoire)
2008-2009
Chromatographie
171
Principaux types (industrie)
Moyenne / haute pression

2008-2009
Chromatographie
172
2008-2009
Chromatographie
173
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Gnralits
Pression : basse pression jusqu' 3 bars, HPLC vers 60 bars, au

maximum 200 bars
- Dtection et traitement des rsultats : technique trs fine : d'o des
dtecteurs " la hauteur" : au del des dtecteurs classiques spectromtrie de masse
applicable aux protines (recombinantes)
- Automatisation : pousse pour FPLC / HPLC
Conclusion :
- basse pression : technique souvent manuelle ; mise en uvre prparative
- moyenne et haute pression : grand degr d'automatisation et d'informatisation :
toutes parties performantes : appareillage sophistiqu, utilisation aide par l'informatique ;
mise en uvre analytique et industrielle
2008-2009
Chromatographie
174
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit.
a Appareillage
schma d'une systme basse pression
Rservoir dluant
Injection
Robinet
Sortie de colonne
Colonne (avec adaptateur et
jaquette)
2008-2009
Chromatographie
175
Rservoir dluant
Robinet
Injection
Sortie de colonne
Colonne (avec adaptateur et
jaquette)
2008-2009
Chromatographie
176
2008-2009
Chromatographie
177
2008-2009
Chromatographie
178
2008-2009
Chromatographie
179
Chromatographie
3 1 Mthodologies
a Appareillage
a1 - colonne
taille de l'ordre de 30 cm de haut,
diamtre 1,6 cm (en moyenne)
support en fonction du type de
chromatographie choisi, c'est--dire en fonction
du mlange de soluts : exemple PHARMACIA :
gel filtration, change d'ions, affinit, interactions
hydrophobes ...
a2 Phase mobile
rservoir : un ou deux
pompe pour pression constante
(suprieure la pression atm), gradient (?)
2008-2009
Chromatographie
180
2008-2009
Chromatographie
181
2008-2009
Chromatographie
182
2008-2009
Chromatographie
183
Chromatographie
3 1 Mthodologies
a Appareillage
a3 Dispositif dinjection
simple par une seringue
ou robinet plusieurs voies (voir schmas
appareillage PHARMACIA)
a4 - Dtection
manuelle (discontinue) ou spectrophotomtre
280 nm ou autre longueur d'onde (254 nm)
a5 - Recueil des fractions
- manuel : discontinu
- collecteur de fractions
a6 - Rsultats ; leur traitement
2008-2009
Chromatographie
184
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie
b1 - Mise en route (basse pression)

comprend :
- montage ou remise en route de l'appareillage (absence de bulles) ;
continuit liquide
- prparation de la phase mobile : qques litres ; ncessit de dgazer
pour viter la formation de bulles
- prparation de l'chantillon : changement de tampon (comment ?)
utilisation dun talon (externe (standard)
ou interne)
b2 - Injection
aiguille et seringue
b3 - lution
gradient discontinu / continu
2008-2009
Chromatographie
185
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie
b4 - Lavage
rgnration de la colonne : une colonne se garde en chambre
froide (en prsence dazoture de Na)
b5 - Traitement des rsultats

enregistreur en gnral pour obtenir le diagramme dlution
dtermination de la forme des pics : qualit de la sparation
dtermination de la position des pics (tR) : identification du
solut
dtermination de la surface des pics (intgration de A = f(V))
intgration manuelle : dcoupage du papier et pese des
pics (aspect historique)
intgration automatique
comparaison avec un talon externe

2008-2009
Chromatographie
186
Dtermination des concentrations

des diffrents soluts dun chantillon
S= . C
Abs
Diagramme dlution
dun chantillon
Dtermination de
la surface SeA
CeA = Se /
CeA = Se . CstA / SstA
Abs
tr
A
Diagramme dlution
dun standard
(solution des divers soluts
de concentration connue et
traite dans les mmes
conditions )
Dtermination de
= SstA / CstA
talon externe
tr
2008-2009
Chromatographie
187
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie
Conclusion :
long : 3 heures pour un temps de passage ;
utilis l'chelle prparative, souvent montages en chambre froide,
toujours utilis, bien que l'HPLC devienne prparative ;
mg de produit.
2008-2009
Chromatographie
188
Chromatographie
3 1 Mthodologies
3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel
a Appareillage
a1 - colonne
- beaucoup plus petites ; peuvent
tre dans une enceinte thermostate pour
augmenter la reproductibilit ; FPLC colonne
de 5 cm de haut
- taille des billes de l'ordre de 5 10
m
a2 Rservoirs et pompe
pour la phase mobile
- rservoirs : un, deux ou plus
- pompe dlivrant jusqu' 300 bars
(au dbut), actuellement de l'ordre de 100
bars ; technologies diffrentes
2008-2009
Chromatographie
189
Chromatographie
3 1 Mthodologies
a Appareillage
a3 - Injecteur
boucle d'injection de FPLC : systmes boucles : voir document
PHARMACIA
systmes en HPLC
2008-2009
Chromatographie
190
2008-2009
Chromatographie
191
2008-2009
Chromatographie
192
Schma dun appareillage FPLC
2008-2009
Chromatographie
193
Chromatographie
3 1 Mthodologies
a Appareillage
a4 Dtecteur
Mthodes optiques
spectrophotomtrie 280 nm , 203 nm ; pour substances absorbant dans l'UV
Remarque : spectrophotomtrie spectrale : spectrophotomtre avec comme
rcepteur une barrette de diodes ; permet l'obtention de chromatogrammes
tridimensionnels. traitement informatique (voir documents)
* fluorimtrie : mthode beaucoup plus sensible.

Remarque : drivatisation pr ou post-colonne
* rfractomtrie : sucres ; peu sensible

Mthodes lectrochimiques : raction d'oxydorduction des composs
lus, produit un courant lectrique mis en vidence
Mthodes physiques : spectromtrie de masse
2008-2009
Chromatographie
194
Chromatographie
3 1 Mthodologies
a Appareillage
a5 - Traitement des rsultats (Moyenne et haute pression)

enregistreur / intgrateur en gnral
enregistrement graphique ou visualisation sur cran
intgration de la courbe dlution
stockage des donnes
2008-2009
Chromatographie
195
Chromatographie
3 1 Mthodologies
a Appareillage
a5 - Traitement des rsultats (Moyenne et haute pression)

informatisation pousse : sortie des % mais rglage :
la machine peut faire n'importe quoi.
relie des banques de donnes pour, par exemple,
identification des impurets prsentes (cas d'un
mdicament)
2008-2009
Chromatographie
196
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie
chelle analytique, prparative et industrielle

en analytique : jamais premire tape de sparation
en prparatif et industriel : peut maintenant tre premire (et unique)
tape
b1 - Mise en route
- remise en route de l'appareillage (allumer les diverses parties de l'appareillage
dans lordre dfini)
- prparation de la phase mobile : ncessit de filtrer et de dgazer les diffrentes
phases mobiles (tampons) pour viter le formation de bulles et la prsence de poussires qui
encrasseraient (colmateraient la colonne)
- contrle de l'appareillage : contrle de la pression et contrle de la ligne de base
en particulier
2008-2009
Chromatographie
197
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie
b2 - Injection (Moyenne et haute pression)

faible volume d'chantillon dans un tampon dtermin (problmes de
nature du tampon, de force ionique)
passeurs d'chantillons
2008-2009
Chromatographie
198
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie
b3 - lution
gradient continu de phase mobile : 2 3 (ou plus phases mobiles)
mlanges selon un gradient programm ; recueil des fractions
b4 - Lavage (Moyenne et haute pression)
nettoyage de la colonne
2008-2009
Chromatographie
199
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie

- enregistrement graphique des valeurs sur enregistreur et/ou
visualisation sur cran ; stockage sous forme de fichier
-calcul de la surface des pics selon divers modes de calculs : prise en
compte des caractres de la ligne de base, du chevauchement, du
bruit de fond, ....
- certification BPL norme ISO 9002 assurance-qualit
2008-2009
Chromatographie
200
Chromatographie
3 1 Mthodologies
b Mthodologie

dtermination de la forme des pics : qualit de la sparation
dtermination de la position des pics (tR) : identification du solut
dtermination de la surface des pics (intgration de A = f(V))

intgration automatique
comparaison avec un talon : talon externe / talon interne
2008-2009
Chromatographie
201

Abs
Diagramme dlution
dun chantillon
tr
Abs
talon interne
talon externe
Abs
tr
Diagramme dlution
dun standard
(solution des divers soluts de
concentration connue et traite dans les
mmes conditions )
2008-2009
Chromatographie
tr
Diagramme dlution
dun chantillon
avec talon interne
202

A
Abs
Diagramme dlution
dun chantillon
Dtermination de
la surface SdA
Cd = Sd /
Cd = Sd . SstA / CstA
Abs
tr
A
Diagramme dlution
dun standard
(solution des divers soluts
de concentration connue et
traite dans les mmes
conditions )
Dtermination de
= SstA / CstA
talon externe
tr
2008-2009
Chromatographie
203
2008-2009
Chromatographie
204
2008-2009
Chromatographie
205
2008-2009
Chromatographie
206
Chromatographie
3 1 Mthodologies
- phase mobile gazeuse : importance de la temprature dbullition
- mthode utilisable pour la sparation de mlanges gazeux (azote,
mthane, thylne), de substances spontanment volatiles ou rendues
volatiles par chauffage
- ncessite, de ce fait, une mthodologie particulire
- historiquement, amlioration de la mthodologie basse pression :
possibilit de modifier les divers paramtres, donc doptimiser la
technique
2008-2009
Chromatographie
207
1 - Appareillage
2008-2009
Chromatographie
208
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage : les diffrentes parties
a - Rservoir de gaz vecteur

a1 - Le gaz vecteur ; proprits et nature
- grande puret,
- inertie par rapport aux substances chromatographier,
- trs faible viscosit (la viscosit des gaz augmentant avec la temprature, il y
aurait d'importantes diminutions de dbit) ;
-conductibilit thermique compatible avec le systme de dtection
- les plus employs : azote, argon, hlium et hydrogne.
2008-2009
Chromatographie
209
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage : les diffrentes parties
a - Rservoir de gaz vecteur

a2 Conservation et dtendeur
- conserv dans des bouteilles mtalliques sous forte pression ; introduit aprs
passage dans des dtendeurs dans le systme chromatographique sous des pressions
allant de 1 4 bars
a3 Dbit ; sa rgulation
.- qualit de la chromatographie lie au dbit du gaz vecteur ; rgulateurs permettent
de contrler et de choisir la vitesse dsire ; varie suivant le diamtre des colonnes :
colonnes de 1/4 de pouce 50 - 70 ml /min,
colonne 1/8 de pouce 25 - 30 ml/min.
2008-2009
Chromatographie
210
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
b - Chambre d'injection
* chantillon analyser gazeux ou pralablement mis en solution dans un
solvant trs volatil

* injection l'aide d'une micro seringue Hamilton sous des volumes
allant de 1 10 l, travers une membrane d'lastomre qui obture la chambre
d'injection ; solutions ne doivent pas trop concentres et injection rapide pour viter les
largissements de pics
* double fonction de la chambre d'injection :
- volatilisation instantane de l'chantillon introduit

- mlange homogne de la vapeur ainsi forme et du gaz vecteur
* volume et gomtrie soigneusement tudis ; maintenue des
tempratures leves, en gnral de 20 30 C suprieures celles de la colonne ;
attention la dcomposition thermique des substances de l'chantillon.
2008-2009
Chromatographie
211
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
c - Le four
- Temprature entre 150 et 300 C.

- dispositif de programmation de la temprature permettant de
l'augmenter progressivement (acclre la sparation) : gradient de temprature
2008-2009
Chromatographie
212
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
d La colonne
acier inoxydable ou verre au Cu -Al ou plastique
1 4 m spirale (pour n'occuper que des espaces restreints).
- phase stationnaire liquide
* fixe sur une phase solide constitue de particules solides
* dpose sur la paroi de la colonne
polyesters ou polythers de glycol, silicones, carbures saturs
- phase stationnaire solide :
petites particules solides ;
greffage possible
remplissage est dlicat , d'o utilisation de colonnes prtes l'emploi.
2008-2009
Chromatographie
213
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
e - Le dtecteur
-substances dtecter dans un tat physique particulier, d'o des dtecteurs
particuliers
- modification des proprits physiques et chimiques du gaz vecteur du fait de la
prsence des soluts : transformation de ces diffrences de proprits en signaux
lectriques, amplifis, enregistrs et, ventuellement, transcrits sous forme
graphique par un enregistreur.
- observation de pics saillants par rapport une ligne de base.
2008-2009
Chromatographie
214
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
e - Le dtecteur
e1 - F I D (flame ionisation detector)
- flamme de dihydrogne brlant

entre 2 lectrodes polarises
- production dions du fait de la
combustion des molcules
organiques
- production dun courant lectrique
recueilli par les lectrodes et
transmis, aprs amplification,
l'enregistreur ; courant de base, en
gnral, peu important.
2008-2009
Chromatographie
215
Insensible aux molcules minrales prsentant un potentiel dionisation lev :

H20, CO, CO2, N2.
Sensibilit variable selon les molcules : maximale pour hydrocarbures saturs ou
non, diminue avec la prsence de groupements halogne, amine, hydroxyle et surtout
carbonyle et acide.
Permet de dceler des quantits de lordre du nanogramme.
Inconvnient : destructif
2008-2009
Chromatographie
216
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
e - Le dtecteur
e2 - Catharomtre
- Utilisation de la conductibilit thermique.

- fil mtallique chauff lectriquement ; perd une quantit de chaleur
constante dans le temps s'il est plac dans un gaz pur ; dans un mlange
variation de la perte calorique do variation de la rsistance ; variation est
dtermine par un pont de Wheatstone.
2008-2009
Chromatographie
217
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
e - Le dtecteur
e3 Capture dlectrons
- source d'lectrons pour transformer les molcules sortant de la colonne en

ions qui sont attirs par une anode.
- Enregistrement de la variation de courant.
- utilisable uniquement pour les molcules capables de capter des lectrons.
2008-2009
Chromatographie
218
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Appareillage
e - Le dtecteur
e4 Spectromtrie de masse
Mthode trs sensible ; permet d'lucider des structures.
2008-2009
Chromatographie
219
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2 - Mthodologie
a - Caractristiques gnrales
* Avantages de la CPG, par rapport la chromatographie basse

pression :
- grand nombre de facteurs sur lesquels on peut agir pour
amliorer la sparation : temprature, nature et caractristiques de passage
de la phase mobile, nature de la phase stationnaire
- utilisation d'une phase mobile gazeuse, inerte par rapport au
solut et permettant une utilisation de mthode de dtection trs sensibles
- automatisation possible
- rapidit des sparations ralises ; encore amliore avec des
colonnes de microdiamtre
* Traitement de lchantillon
* Droulement de la chromatographie
2008-2009
Chromatographie
220
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2 - Mthodologie
b - Traitement de lchantillon
rendre l'chantillon volatil ; chantillons rarement d'emble volatils.

chantillons rendus plus volatils par introduction de groupement hydrophobes :
sparation des molcules les unes des autres par absence de liaisons polaires
entre elles....
b1 - Raction de silylation : utilisation du trimthylsilane
(TMS) -Si-(CH3)3
Le groupement se substitue un H mobile (par exemple alcoolique)
R-OH + Cl-Si-(CH3)3 ---------> R-O-Si-(CH3)3 + H Cl
chlorure de TMS
fonction alcool polaire, responsable des interactions entre molcules :
volatilit lie l'absence d'interactions ; on diminue la possibilit de raliser des
liaisons hydrogne
2008-2009
Chromatographie
221
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2 - Mthodologie
b - Traitement de lchantillon
b2 - Raction d'alcoylation
- remplacement d'un H mobile par une radical R alcoyl (chane hydrocarbone)
b3 - Raction d'acylation
- remplacement d'un H mobile par une radical R acyl (chane hydrocarbone d'un
acide organique)
Remarque : Utilisable pour de petites molcules, pas d'application aux
macromolcules ; utilisation pour les alcools, ce qui sort d'un fermenteur
2008-2009
Chromatographie
222
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2 - Mthodologie
c - Droulement de la chromatographie
- technique la
plus simple : maintien de la pression et la temprature

constantes dans la colonne : chromatographie isotherme et isobare.
- pour viter de trop long temps de migration d'augmenter progressivement

la temprature de la colonne selon un programme prtabli (gradient de
temprature) : chromatographie temprature programme ; l'augmentation
de temprature modifie le dbit gazeux ce qui conduit l'emploi d' un
systme de rgulation automatique de dbit en fonction de la temprature.
Les tempratures les plus utilises : 80 300 C
2008-2009
Chromatographie
223
Chromatographie
3 1 Mthodologies
B Diffrences
2008-2009
Chromatographie
224
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Prparation de la phase mobile (simple ou complexe) monophasique
ou biphasique
chromatographie de partage : systme monophasique ou biphasique
Systme monophasique
N-butanol
Acide actique
Eau
2008-2009
Systme biphasique
N-butanol
3
Acide actique
1
Eau
4
3
1
1
Chromatographie
225
Chromatographie
3 1 Mthodologies
2 - Prparation du support ; en particulier dcoupage
- ciseaux
- traits au crayon de papier
- ligne de dpt
3 Dpts
- quidistants
2008-2009
Chromatographie
226
Chromatographie
3 1 Mthodologies
4 Migration : ascendante / descendante
2008-2009
Chromatographie
227
Chromatographie
3 1 Mthodologies
5 Rvlation
raction colore permettant de mettre en vidence les soluts sous
forme de taches = spots
nature chimique des ractifs utiliss (corrosivit)
6 - Rsultats et leur valuation

noter le front du solvant :
calcul du Rf
ou valeur relative une substance de rfrence
reproductibilit
2008-2009
Chromatographie
228
Front du solvant
Dpt
Rf = d / D
Exemple de la CCM aprs rvlation
2008-2009
Chromatographie
229
Dpart du front solvant
Dref
Dpt
Rf = d / DRef
2008-2009
Chromatographie
230
Dpart du front
solvant
Dref
Dpt
Rf = d / DRef
2008-2009
Chromatographie
231
Chromatographie
3 1 Mthodologies
B - Diffrences
1 - Chromatographie sur papier (1944)
- papier servant de support inerte
- fixation de l'eau (en gnral)
d'o une chromatographie de
partage
- 80 cm : chromatographie
descendante
- Rvlation par des ractifs non
corrosifs (ex : phtalate daniline
pour les sucres)
2008-2009
Chromatographie
232
Chromatographie sur papier
2008-2009
Chromatographie
233
Systme biphasique
Cas de la chromatographie
sur papier
Phase organique
Phase aqueuse
2008-2009
Chromatographie
234
Chromatographie
3 1 Mthodologies
B - Diffrences
2 - Chromatographie sur couches minces (Stahl 1956)
- chromatographie sur couche mince :
partage ou/et adsorption
- plaques 20 X 20 cm maximum :
souvent plus petites
- Ascendante
- rvlation par des ractifs corrosifs
(acides forts)
2008-2009
Chromatographie
235
Chromatographie
3 1 Mthodologies
B - Diffrences
2 - Chromatographie sur couches minces (Stahl 1956)
- automatisation possible : Rhne
Poulenc
- CCM avec couche de concentration
utilis pour tapes prparatoires de
HPLC : mise au point de systmes
de solvants optimisant la sparation.
2008-2009
Chromatographie
236
Chromatographie
3 1 Mthodologies
3 1 3 Mise en uvre en batch
A Mode opratoire
- addition de phase stationnaire au mlange sparer =
solide
- mise en suspension par agitation
2008-2009
Chromatographie
237
Chromatographie
3 1 Mthodologies
3 1 3 Mise en uvre en batch
A Mode opratoire
- dcantation : sparation des deux phases

recueil de la phase intressante
soit
soit
phase liquide
phase stationnaire
lution en batch ou sur
colonne
Traitement ultrieur
2008-2009
Chromatographie
238
Chromatographie
3 1 Mthodologies
3 1 4 Mise en uvre en lit fluidis
Mode opratoire
Charge en lit fluidis
puis
soit
soit
lution en batch
2008-2009
lution en colonne
Chromatographie
239
Chromatographie
3 2 Applications : quelques exemples

3 2 1 Sparation des acides amins
3 2 2 Sparation de mdicaments par HPLC
3 2 3 Sparation des protines par FPLC
2008-2009
Chromatographie
240
Chromatographie

A Sparation et dosage des acides amins dun hydrolysat
de protines = dtermination de la composition totale en acides mains
- purification de la protine squencer : isolement dune chane

polypeptidique
- hydrolyse chimique acide et basique ; temps dhydrolyse
- sparation des mlanges obtenus par chromatographie
- change dions historiquement, actuellement interactions hydrophobes
- automatis
2008-2009
Chromatographie
241
Chromatographie

B - Dtermination de la structure primaire des protines
- purification de la protine squencer : isolement dune chane

polypeptidique
- hydrolyse enzymatique de la chane
- sparation et purification des divers fragments
- travail sur un fragment donn : utilisation du ractif dEDMAN , cest
dire dtachement rcurrente dacides amins partir de lextrmit
NH2 (PHT aas)
- sparation des acides amins par chromatographie dinteractions
hydrophobes
- automatis
2008-2009
Chromatographie
242
2008-2009
Chromatographie
243
2008-2009
Chromatographie
244
Charge + des
protines (cations) :
sparation sur
changeur - (sur
changeur de
cations)
CM
Charge - des
protines (anions) :
sparation sur
changeur + (sur
changeur danions)
2008-2009
DEAE
Chromatographie
245
2008-2009
Chromatographie
246
Chromatographie

3 2 2 Sparation de mdicaments par HPLC
2008-2009
Chromatographie
247
Copie2008-2009
Chromatographie
248
Copie2008-2009
Chromatographie
249
2008-2009
Chromatographie
250
2008-2009
Chromatographie
251
2008-2009
Chromatographie
252
Chromatographie

3 2 3 Sparation des protines par FPLC
2008-2009
Chromatographie
253
Chromatographie
3 2 Applications
2008-2009
Chromatographie
254
2008-2009
Chromatographie
255
2008-2009
Chromatographie
256
Chromatographie
3 1 Mthodologies
1 - Prparation de la phase mobile (simple ou complexe) monophasique
ou biphasique
2 - Prparation du support ; en particulier dcoupage
3 - Dpts
4 Migration : ascendante / descendante
5 Rvlation
6 - Rsultats et leur valuation
2008-2009
Chromatographie
257
2008-2009
Chromatographie
258

Chromatograhie Methodes Et Principe

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Chromatographie

1 4 Divers temps dune

2 Principe et utilisation des

1 2 1 - Classification selon ltat des

3 2 1 Sparation des acides

1 1 Dfinition de la chromatographie : principes

1 1 Dfinition de la chromatographie : principes

* une phase mobile qui entrane les divers soluts

- en fait, les soluts se partagent entre la phase stationnaire et la phase

1 1 Dfinition de la chromatographie : principes

- les soluts restent ou non dans la phase stationnaire

1 1 Dfinition de la chromatographie : principes

1 2 - Diffrents types de chromatographies

1 2 - Diffrents types de chromatographies

chromatographie liquide - liquide

1 2 - Diffrents types de chromatographies

1 2 - Diffrents types de chromatographies

- soit tendue sur une surface plane : chromatographie de surface

- soit l'intrieur d'une colonne : chromatographie sur colonne .

1 2 - Diffrents types de chromatographies

B - Chromatographie par dplacement

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 2 Le pic de chromatographie idal

1 3 3 - Efficacit de la colonne et rsolution

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 - tude thorique et modlisation

les barques attaches

libres en mme temps, au temps zro

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 - tude thorique et modlisation

- temps pass naviguer tO identique pour toutes les barques

1 3 - tude thorique et modlisation

barques = les diffrents soluts ;

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 - tude thorique et modlisation

Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 - tude thorique et modlisation

avec L, longueur de la colonne (en cm)

1 3 - tude thorique et modlisation

Neff peut galement tre calcul partir

Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 m et une

1 3 - tude thorique et modlisation

: hauteur dun plateau thorique

1 3 - tude thorique et modlisation

: diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins

1 3 - tude thorique et modlisation

1 3 - tude thorique et modlisation

Hauteur dun plateau

1 3 - tude thorique et modlisation

La rsolution est, pour une

1 4 Divers temps dune chromatographie sur

1 5 Divers types de mise en uvre dune

2 4 Chromatographie par gel filtration

2 5 Chromatographie par interactions

2 6 Chromatographie par interactions

3 2 1 Sparation des acides

- non polaire : carbone actif

Utilisation de gradients de solvants organiques polaires

infrieure 1000 g.mol-1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire :

Solide insoluble, finement divis,

- Cas des liaisons polaires :