Sunteți pe pagina 1din 5

Analiza aminelor biogene din vinuri prin extractia lichid-lichid asistata

de desarare si cromatografie lichida de inalta performanta cu detectie


fluorimetrica

Rezumat
Aminele biogene sunt compusi organici azotati cu masa moleculara mica care
sunt formati sau metabolizati in celulele organismelor vii si pot fii gasite in mai
multe alimente, fiind produse in principal de decarboxilarea aminoacizilor. Cand
sunt ingerate in cantitati mari pot produce probleme de sanatate oamenilor. In
bauturile alcoolice, si in special in vinuri, ele sunt formate in timpul procesului de
vinificatie, ca rezultat al actiunii microorganismelor.
In aceasta lucrare este propusa o noua metoda pentru determinarea aminelor
biogene din vinuri, care include o abordare a prepararii probei bazata pe desarare
asistata de extractia lichid-lichid, folosirea clorurii de dansil (clorura
de dimetilamino-naftil-sulfonil) pentru derivatizarea si separarea cromatografica
prin cromatografia lichida de inalta performanta cu detectie fluorimetrica. Efectul
desararii este folosit pentru a promova separarea fazelor dintre apa si un solvent
organic miscibil in apa, in timp ce se imbunatateste extractia speciilor organice sau
anorganice. Mai multi parametrii ai extractiei au fost optimizati, cum ar fii
concentratia clorurii de dansil, pH-ul si efectele cauzate de ordinea in care extractia
si derivatizarea au loc.
Rezultatele au aratat posibilitatea de a face in acelasi timp extractia si
derivatizarea, facand prepararea probei mai usoara si mai rapida. Metodologia a
fost aplicata cu succes pentru determinarea aminelor biogene din 5 vinuri (alb, rosu
si ros). Aceasta metoda are potentialul de a fii o buna alternativa a metodelor
existente, din moment ce este mai ieftina, usoara si simplifica pasul de preparare al
probei.
1. Introducere
Aminele biogene sunt un grup foarte important de compusi organici care sunt
des intalniti intr-o larga varietate de mancaruri si bauturi cum ar fii branza, vinul,
berea, produsele din peste si carne. In general sunt formati prin decarboxilarea
aminoacizilor sau aminarea si transaminarea aldehidelor si ketonelor. Aminele
biogene sunt impartite de obicei in 3 grupuri, conform structurii lor chimice:
- alifatice: metilamina, dimetilamina, etilamina, putresceina, cadaverina,
isopentilamina, spermidina;
- aromatice: tiramina, feniletilamina;

- heterociclice: histamina, triptamina.


Aminele biogene sunt buni indicatori ai calitatii mancarii asociati gradului de
degradare si fermentare din mancare. Acesi compusi pot fii benefici sau daunatori
sanatatii oamenilor, deoarece in concentratii mici ei pot fii usor tolerati de catre
corpul uman si chiar pot ajuta cateva functii fiziologice; pe de alta parte, in
concentratii mari, ei pot produce tulburari neurologice, dureri de cap, hipo sau
hipertensiune, greata, palpitatii cardiace sau intoxicatie renala.
In vin, aminele biogene sunt formate in timpul procesului de vinificatie
datorita actiiunii a mai multor microorganisme in timpul fermentarii alcoolice si
malolactice. Fermentatia malolactica , care este catalizata de bacteriile acidului
lactic, este considerat unul dintre cei mai importanti pasi din timpul vinificatiei.
Aceasta producere este dependenta de prezenta bacteriilor, de disponibilitatea
precursorilor amino acizi, de durata fazei initiale de fermentatie, de nivelul
dioxidului de sulf, de pH si de perioada de contact dintre must si coaja strugurelui.
Din aceste motive, vinurile rosii au in general continut mai mare de amine biogene
decat vinurile albe. In cazul berii, formarea si prezenta aminelor biogene este legata
de actiunea drojdiei, bacteriile acidului lactic si calitatea precursorul materiei prime.
Determinarea simultana si rapida a aminelor biogene din vinuri necesita
metode ieftine, sigure si simple. In lucrarile de referinta am gasit cateva metode
folosite pentru determinarea aminelor biogene care sunt bazate pe electroforeza
capilara, pe cromatrografia de gaze si cea mai intalnita pe cromatografia lichida de
inalta performanta, in combinatie cu cativa detectori.
In aceasta lucrare propunem o metoda simpla si rapida pentru determinarea
a 9 amine biogene gasite in vinuri, folosind o procedura directa de prepare a probei,
bazata pe o desarare asistata de extractia lichid-lichid si derivatizarea cu clorura de
dansil pentru analiza cromatografiei lichida de inalta performanta cu detectie
fluorimetrica. Aceasta metoda foloseste efectul desararii ca baza pentru extractia
omogena lichid-lichid, si in afara de sustinerea separarii fazelor, aditia de sare
imbunatateste extractia de specii moleculare in faza organica. Aceasta metoda,
care deja s-a dovedit a fii foarte valoroasa pentru determinarea compusilor dicarbonilici, este simpla, rapida si sigura pentru determinarea aminelor biogene din
probe de vin.
2. Materiale si metode
Produse chimice si probe
Toti reactivii folositi in aceasta lucrare, exceptand cazul cand se mentioneaza
altfel, au fost de grad analitic si au fost folositi fara o purificare ulterioara. Apa
ultrapura a fost folosita pentru toate analizele chimice si spalarea sticlariei. Toti
eluentii cromatografici au fost filtrati prin filtru de nailon.

Solutiile stoc standard individuale ale fiecarei amine biogene au fost


preparate diluand sau dizolvand cantitatea asemanatoare de reactiv comercial in
apa de mare puritate si stocate la 4 C. Solutiile de lucru au fost preparate zilnic
prin dilutia solutiilor stoc.
Solutia de clorura de dansil a fost preparata dizolvand 80 mg de reactiv in 25
ml de acetonitril; a fost stocat la 4 C pana la folosire.
Probele de vin folosite in aceasta lucrare au fost cumparate de la
supermarket-uri locale.
Procedura de extractie adoptata
Metoda experimentala folosita s-a bazat pe o metoda descrisa de I.M.
Valente, cu modificarile adecvate. 2 ml de proda de vin au fost amestecati cu 1 ml
de acetonitril si 1 ml de clorura de dansil obtinand un raport de 1:1 intre faza
apoasa si cea organica. Pentru a asigura un pas corect de derivatizare, probele de
vin au fost in prealabil cu tampon fosfat in raport de 1:1, pentru a mari pH-ul
mediului. Dupa 25 minute de derivatizare, 0.13 g de NaCl au fost cantarite si
adaugate in amestec; tuburile au fost centrifugate la 6000 rpm timp de 2 minute
pentru separarea fazelor. Faza superioara a fost colectata pentru analiza.

Fig. 2 - Schema procedurii experimentale pentru extractia aminelor biogene


Analiza HPLC-FLD (analiza cromatografica lichida de inalta performanta cu
detectie fluorimetrica)
Sistemul HPLC a fost compus dintr-o unitate gradienta cuaternara de presiune
scazuta cu un degazificator in linie, un detector fluorimetric si un injector manual.
Controlul sistemului si analiza datelor au fost facute de Jasco ChromPass
Chromatography Data software. Separarea derivatilor clorurii de dansil a fost facuta
cu o coloana Phenomenex Gemini. Faza mobila a constat in tampon de acetonitril si
acetat. In primele 8 minute acetonitrilul a crescut liniar de la 35% la 65%; in
urmatoarele 17 minute acetonitrilul a crescut la 80% , iar in urmatoarele 10 minute
la 100%; de la 35 la 40 minute compozitia fazei mobile s-a intors la 35% acetonitril;

un pas suplimentar de 5 minute a fost folosit pentru conditionare inainte de


urmatoarea injectie.
3. Rezultate si discutii
Aminele biogene nu au proprietati cromofore, asa ca pentru o detectie
corespunzatoare trebuie efectuata o reactie de derivatizare. Clorura de dansil
reactioneaza cu aminele pentru a forma sulfonamide stabile covalente legate, care
au proprietati fluorescente.

Fig. 1 - Reprezentarea reactiei dintre aminele biogene si clorura de dansil


In afara de optimizarea conditiilor cromatografice, mai multi parametrii au
trebuit optimizati, cum ar fii influenta timpului de extractie, influenta pH-ului si
concentratia clorurii de dansil.
Pasii de extractie si derivatizare sunt in general considerati independenti de
cand, in majoritatea cazurilor, extractia este efectuata prima, urmata de
derivatizare. De cand clorura de dansil a fost preparata in acetonitril, care este de
asemenea solventul organic folosit la extractie, a fost studiata integrarea reactivului
in procedura de extractie. Pe aceasta cale au fost testate 3 proceduri diferite de
extractie/derivatizare:
-

A. derivatizare urmata de extractie;


B. derivatizare si extractie simultana;
C. extractie urmata de derivatizare.

Analiza probelor de vin


Metoda propusa a fost aplicata pentru determinarea continutului de amine
biogene din 5 vinuri. Vinurile erau de origini si sortimente diferite: 3 vinuri albe, 1
vin rosu si 1 vin ros. Extractia si derivatizarea s-au efectuat in conformitate cu
procedurile descrise anterior. Probele de vin au fost diluate 1:1 cu tampon fosfat
pentru a controla pH-ul si a scadea continutul de etanol. Vinul rosu a avut cel mai
mare numar de amine biogene, cum era de asteptat tinand cond de procesul sau de
vinificatie.
Cat despre stabilitatea aminelor derivate, dupa un interval de 12 ore, nu am
constatat o pierdere semnificativa a intensitatii semnalului.
4. Concluzii
In aceasta lucrare am propus o metoda simpla si rapida de determinare a
aminelor biogene din vinuri. Metoda propusa foloseste un solvent organic mai putin
riscant pentru extractie (acetonitril) si procedura de extractie este foarte directa.
Acesta este principalul avantaj al metodei propuse din moment ce extractia poate fi
realizata simultan cu derivatizarea. Mai multi parametrii ai extractiei au fost
optimizati, cum ar fii derivatizarea concentratiei reactivului, pH-ul si timpul
extractiei. A fost aratata inlfuenta pH-ului si importanta controlarii lui inainte de
extractie.
Aceasta metoda a fost aplicata cu succes analizei a 9 amine biogene
prezente in mancare si bautura. Se prezinta ca fiind o metoda usoara, rapida si
ieftina pentru analiza acestei clase de compusi si care poate fii usor implementata
in experimentele pentru controlul calitatii.