CARACTERIZACIN FISONMICA Y ORDENACIN DE LA VEGETACIN

EN EL REA DE INFLUENCIA DE EL SALTO, DURANGO, MXICO

Lugar de estudio: rea aledaa de El Salto, Durango
RESUMEN
De acuerdo a la caracterizacin sinecolgica de la vegetacin en el rea
aledaa de El Salto, Durango. Se reportan ocho unidades de vegetacin y
mediante perfil semirrealista y danserogramas se describen las caractersticas
fisonmicas de cada una, as como la lista florstica, estableciendo su
ordenacin y clasificacin numrica, mostrando que los gradientes latitudinales
y topogrficos influyen en la composicin florstica del rea de estudio.
OBJETIVO
El objetivo de este trabajo es caracterizar fisonmica y florsticamente la
vegetacin comprendida en el rea aledaa a la ciudad de El Salto, Durango,
poniendo nfasis en perfiles fisonmicos semirrealistas y danserogramas, as
como establecer una relacin entre la estructura de la comunidad y gradientes
ambientales de las asociaciones vegetales.
METODOLOGA
Para llevar a cabo la ordenacin de la vegetacin se utiliz el programa de
cmputo ANACOM y se llev a cabo la ordenacin indirecta: Anlisis de
Correspondencias (AC) y la ordenacin directa: Anlisis Cannico de
Correspondencias (ACC).
SITIOS DE ESTUDIO (PINUS-QUERCUS)
Sitio 1. Ro Chico. Asociacin 1, Pinus cembroides-Acacia schaffnerii
Sitio 2. Navos. Asociacin 2 de Pinus chihuahuana, P. engelmannii.
Sitio 3. La Lagunilla. Asociacin 3 de Pinus durangensis-Quercus eduardii.
Sitio 4. Chavarra Viejo. Asociacin 4 de Pinus durangensis-Abies durangensis
Sitio 5. Rancho Viejo. Asociacin 5 de Quercus eduardii-Pinus durangensis.
Sitio 6. Los Calichales. Asociacin de Quercus urbanii-Pinus lumholtzii.
Sitio 7. Tnel. Asociacin 7 de Pinus cooperi- Pinus durangensis-Quercus sideroxyla.
Sitio 8. Las Adjuntas. Asociacin 8 de Pinus cooperi-Quercus rugosa- Juniperus deppeana.
RESULTADOS

Ordenacin indirecta. El anlisis de la Figura 11 muestra la proximidad de las

asociaciones 3, 5, 7 y 8, las cuales estn ubicadas muy cerca, lo que indica
que existe un gran nmero de especies comunes entre ellas. Por otra parte, las
asociaciones 1, 2, 4 y 6 se presentan muy alejadas entre s y de los sitios
restantes, por lo que puede establecerse la presencia de cinco grupos que
podran representar unidades de vegetacin. La distribucin aleatoria de los
puntos 1, 2, 4 y 6 puede deberse a la gran variabilidad altitudinal, lo que
conlleva a que en un rea relativamente pequea se pueda encontrar una gran
variedad de microclimas que como consecuencia ofrecen una gran variedad de
tipos de vegetacin en una distancia relativamente corta. Es posible de manera
visual detectar agrupaciones muy similares y que pueden ser agrupaciones
naturales.

Clasificacin y ordenacin de la vegetacin del norte de la Sierra Nevada,

a lo largo de un gradiente altitudinal
RESUMEN
Se realiz un anlisis de la vegetacin y de los factores que influyen en su estructura y
distribucin a lo largo de un gradiente altitudinal en el norte de la Sierra Nevada,
Estado de Mxico. Se seleccionaron 21 sitios de muestreo con base en el
reconocimiento fisonmico de los tipos de vegetacin en un intervalo de 2750 a 4100
m snm. En cada sitio se establecieron dos parcelas de 1000 m2 para el muestreo de
rboles, y dentro de ellas, dos parcelas de 250 m2 para el de arbustos y seis de 9 m2
para el de herbceas. La tcnica de clasificacin utilizada fue el anlisis de
agrupamiento y para la ordenacin de la vegetacin se emplearon anlisis de
correspondencia rectificado (DCA) y anlisis de correspondencia cannica (CCA); el
atributo estructural de la vegetacin, fue el valor de importancia relativa de las
especies. El anlisis incluy datos de 202 especies y 37 variables ambientales. Las
tcnicas de clasificacin y ordenacin detectaron seis tipos de vegetacin de menor a
mayor altitud: encinar arbustivo, bosque de encino, bosque mixto, bosque de oyamel,
bosque de pino y pastizal alpino. La distribucin de las especies fue continua a lo largo
del gradiente por lo que no hay evidencia de la existencia de comunidades discretas.
En el norte de la Sierra Nevada existe un patrn en la estructura y distribucin de las
comunidades vegetales definido principalmente por el gradiente de altitud (temperatura
y precipitacin) y por las propiedades del suelo: materia orgnica, cationes y punto de
marchitez permanente en el horizonte A2 , as como los nutrimentos y la profundidad
del horizonte O, y la pendiente del terreno. Las tcnicas de clasificacin y ordenacin
probaron ser mtodos complementarios para la deteccin de los seis tipos de
vegetacin a lo largo del gradiente altitudinal estudiado
El rea de estudio: se localiza en la regin fisiogrfica conocida como Sierra Nevada, al oriente del
Estado de Mxico
ARBUSTOS Y HERBCEAS

METODO
Con los datos obtenidos se elaboraron dos matrices de datos.
La primera matriz consisti de los 21 sitios de muestreo (columnas) y del VIR de
202 especies (filas).
-

Se realiz la clasificacin numrica y la ordenacin indirecta

La clasificacin numrica de la vegetacin se realiz mediante el anlisis de
agrupamiento (CA)
Se eligi el ndice de Srensen

Para elegir las variables ambientales y edficas ms correlacionadas con la composicin

de las especies (primera matriz) se utiliz el criterio de seleccin hacia adelante del
programa CANOCO (Ter Braak y milauer,1998).
La clasificacin numrica de la vegetacin se realiz mediante el anlisis de
agrupamiento (CA), una tcnica jerrquica aglomerativa que analiza las muestras en
forma individual para fusionarlas sucesivamente en grupos de tamao creciente, hasta
que todas las muestras son sintetizadas en un slo grupo.

Se eligi el ndice de Srensen como la medida de distancia para definir la similitud

entre los grupos, por ser de los ms robustos para datos ecolgicos (McCune y Mefford,
1999) y como mtodo de unin de grupos el de promedio entre grupos (UPGMA),
ya que introduce relativamente poca distorsin en la distancia entre
agrupamientos con respecto a la matriz de distancias original (Ludwig y Reynolds,
1988) y evita el efecto de encadenamiento generado con otros mtodos de unin (Digby
y Kempton, 1987).

La segunda matriz de los mismos 21 sitios de muestreo y de 37 variables ambientales

y edficas (filas).
-

Se realiz la ordenacin directa

Para la ordenacin de la vegetacin

Se utiliz el Anlisis de Correspondencia Rectificado (DCA) y el Anlisis de
Correspondencia Cannica (CCA)
Ambas tcnicas son apropiadas cuando las especies muestran relaciones de tipo
unimodal a gradientes ambientales (Ter Braak y Prentice, 1988). Dado que los datos del
VIR de las especies fueron colectados a lo largo de un gradiente ambiental amplio de
ms de 1000 m de altitud, un modelo unimodal es apropiado (Austin, 1987; Velzquez,
1994; Palmer, 2003).
El Anlisis de Correspondencia Rectificado es una tcnica de ordenacin indirecta
en la que los gradientes ambientales son inferidos a partir de los datos de las especies
(Ludwig y Reynolds, 1988).
El Anlisis de Correspondencia Cannica es una tcnica de ordenacin directa y
representa adems un caso especial de regresin mltiple donde la composicin de
especies es directamente relacionada con las variables ambientales.
Las tcnicas de clasificacin y ordenacin permitieron definir seis tipos de vegetacin (encinar arbustivo,
bosque de encino, bosque mixto, bosque de oyamel, bosque de pino y pastizal alpino) a travs del
gradiente de altitud estudiado.

CITOMETRA DE FLUJO: VNCULO ENTRE LA

INVESTIGACIN BSICA Y LA APLICACIN CLNICA

LOURDES MARA BARRERA RAMREZ

Departamento de Biologa Molecular. INER.
MA. ELISA DRAGO SERRANO
JULIA PREZ RAMOS
Sistemas Biolgicos. Universidad Autnoma Metropolitana. Unidad Xochimilco.
ANA CECILIA ZAMORA
Hospital Universitario "Dr. Jos E. Gonzlez". Monterrey, Nuevo Len.
Servicio Clnico 1, INER.
FABIOLA GMEZ ARROYO
Departamento de Microbiologa e Inmunologa. Facultad de Veterinaria, UNAM.
TERESITA DEL ROSARIO SAINZ ESPUES
Sistemas Biolgicos. Universidad Autnoma Metropolitana. Unidad Xochimilco.
FELIPE MENDOZA PREZ
Departamento de Biologa Molecular. INER.
Sistemas Biolgicos. Universidad Autnoma Metropolitana. Unidad Xochimilco

Correspondencia:
M en C. Felipe Mendoza Prez,
Jefe del Laboratorio de Inmunoqumica.
Departemento de Biologa Molecular. Instituto Nacional de Enfermedades
Respiratorias.
Calzada de Tlalpan 4502, colonia Seccin XVI. Mxico, D.F. 14080.
Telfono: 5666-4539, extensin 270,
Fax: 5665-4623.
Email: femendo@yahoo.com
Trabajo recibido: 17-II-2004;
Aceptado: 26-III-2004

RESUMEN
La citometra de flujo es un mtodo analtico que permite la medicin rpida de
ciertas caractersticas fsicas y qumicas de clulas o partculas suspendidas en
lquido que producen una seal de forma individual al interferir con una fuente de
luz. Una de las caractersticas analticas ms importantes de los citmetros de flujo
es su capacidad de medir mltiples parmetros celulares, como el tamao, forma y
complejidad y, por supuesto, cualquier componente celular o funcin que pueda ser
marcada con un fluorocromo. Las aplicaciones ms relevantes de la citometra de
flujo en la prctica mdica se relacionan con la hematologa e inmunologa clnicas,
midiendo parmetros como nmero y clasificacin de clulas sanguneas. Esta

tcnica es empleada tambin en el conteo de subpoblaciones de linfocitos en

pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana, as como la caracterizacin
de leucemias agudas y sndromes linfoproliferativos crnicos, entre otros
padecimientos. En los ltimos 20 aos, el anlisis de enfermedades pulmonares de
origen inmunolgico por citometra de flujo ha jugado un papel importante en el
entendimiento y diagnstico de enfermedades como sarcoidosis, neumona
eosinoflica o neumonitis por hipersensibilidad. Las aplicaciones de la citometra de
flujo son numerosas, lo cual ha permitido el empleo de estos instrumentos de
manera amplia en los campos, tanto de la investigacin biolgica como mdica.
Esta revisin brinda un panorama general de los principios bsicos de la citometra
de flujo y la muestra como una herramienta reproducible y aplicable a una gran
variedad de campos mdicos, as como su empleo en el campo de las
enfermedades pulmonares.
PALABRAS CLAVE: Citometra de flujo, inmunofenotipificacin, lavado
bronquioalveolar, enfermedades pulmonares, VIH.
ABSTRACT
Flow cytometry is an analytical method that allows the rapid measurement of
certain physical and chemical characteristics of cells or particles suspended in liquid
and produce signals when they pass individually through a beam of light. An
important analytical feature of flow cytometers is their ability to measure multiple
cellular parameters such as cell size, shape and internal complexity and, of course
any cell component or function that can be detected by a fluorescent dye. The most
prominent uses of flow cytometry in medical practice are in the related fields of
laboratory hematology and clinical immunology, for a variety of tasks involving
blood cell counting and classification. This technique is also used for counting
lymphocyte subpopulations in patients with HIV, characterization of acute
leukemias and chronic lymphomas between other diseases. Over the last 20 years,
analysis of immunologica lung diseases by flow cytometry has played a major role
in the understanding and as tool of diagnosis, such as sarcoidosis, eosinophilic
pneumonia or hypersensitivity pneumonitis. So the applications of flow cytometry
are numerous, and this has lead to the widespread use of this instruments in
biological research and medical fields. Overall this review shows a brief overview of
basic principles of and shows this as a reproducible tool applicable to a wide range
of medical approaches as well as its use in lung diseases field.
KEY WORDS: Flow cytometry, immunophenotyping, bronchoalveolar lavage, lung
diseases, HIV.

INTRODUCCIN
En los ltimos aos, el diagnstico clnico ha experimentado profundas
modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos por los nuevos
mtodos cuantitativos de anlisis celular. De entre ellos destaca la citometra de
flujo, que ha alcanzado gran relevancia, adems de la que ya tena en la
investigacin bsica.
La citometra constituye un complemento valioso de las tcnicas clsicas utilizadas
para el estudio de la morfologa, biologa y bioqumica celular. Aunque, desde el
punto de vista cronolgico, la citometra de flujo es una tecnologa relativamente
reciente, sus caractersticas especiales como tcnica de anlisis celular han hecho

que en la ltima dcada su uso se haya extendido de forma rpida, desde los
laboratorios de investigacin bsica hasta los laboratorios clnicos 1.
La citometra de flujo ha encontrado amplia utilidad en ciencias como la
inmunologa, hematologa, oncologa, anatoma patolgica y biologa celular 2 . La
conjugacin de marcadores fluorescentes con anticuerpos monoclonales o
policlonales ha hecho posible los estudios de la densidad y la distribucin de
determinantes y receptores de la superficie y del citoplasma celular, permitiendo
identificar subpoblaciones celulares 3.
Por otra parte, en comparacin con los mtodos bioqumicos de anlisis celular, en
los que se obtiene un resultado promedio para toda la muestra, la citometra de
flujo es capaz de proporcionar una informacin cuantitativa sobre cada clula en
particular y permite identificar en una muestra subpoblaciones de clulas
diferentes, incluso cuando estn escasamente representadas.
QU ES LA CITOMETRA DE FLUJO?
La citometra de flujo representa un mtodo rpido objetivo y cuantitativo de
anlisis de clulas, ncleos, cromosomas, mitocondrias u otras partculas en
suspensin.
El principio en el que se basa esta tecnologa es simple: hacer pasar clulas u otras
partculas en suspensin alineadas y de una en una por delante de un haz
luminoso. La informacin producida puede agruparse en dos tipos fundamentales:
la generada por la dispersin de la luz y la relacionada con la emisin de luz por los
fluorocromos presentes en la clula o partcula al ser excitados por el rayo
luminoso. Las seales luminosas detectadas se transforman en impulsos elctricos
que se amplifican y se convierten en seales digitales que son procesadas por una
computadora (Figura 1) 4.

Figura 1. Principio general de la citometra de flujo

CONCEPTOS SOBRE INMUNOFLUORESCENCIA

El trmino inmunofluorescencia se usa para describir las tcnicas en que se emplea

un fluorocromo para marcar un anticuerpo. Ya en 1941, Coons 5 inform de la
aplicacin de esta tcnica para localizar antgenos y anticuerpos en secciones de
tejido. El descubrimiento de los anticuerpos monoclonales por Kohler y Milstein en
1975 6 , increment dramticamente el uso de la inmunofluorescencia para la
identificacin de antgenos de superficie celular.
La fluorescencia ha sido usada para visualizar ciertas molculas y estructuras por
medio de la microscopia ptica durante muchos aos. Esta ha encontrado una
extensa rea de aplicacin en la citometra de flujo. La capacidad para detectar
simultneamente la fluorescencia de dos, tres, cuatro o actualmente hasta 13
fluorocromos de diferentes longitudes de onda, abre completamente el campo del
anlisis multiparamtrico.
Cuando una molcula absorbe luz, y por tanto energa, algunos de sus electrones
pueden alcanzar una rbita de mayor energa. Se dice entonces que la molcula ha
alcanzado un estado de excitacin, y puede volver a su estado basal cuando estos
electrones vuelven a su rbita de menor energa. En algunos compuestos el
electrn excitado cae rpidamente, usualmente en nanosegundos, al estado basal,
emitiendo un cuanto de luz o fotn y desprendiendo energa. Esta transicin
radiante se denomina fluorescencia 7 . A este tipo de compuestos se les denomina
fluorescentes o fluorocromos.
El objetivo del anlisis por inmunofluorescencia en citometra de flujo es asignar a
cada clula a un grupo especfico de clulas que compartan propiedades comunes.
El primer paso es identificar las clulas de inters. Por ejemplo, para el anlisis de
subpoblaciones linfocitarias se requiere seleccionar un rea de trabajo distinguiendo
los leucocitos por sus propiedades de dispersin de luz (tamao contra complejidad
celular). Una vez que las clulas de inters han sido distinguidas de los otros tipos
celulares, se puede usar la inmunofluorescencia para determinar la proporcin o el
nmero de clulas que poseen un determinado marcador, por ejemplo, del
marcador CD4 para monitorear el progreso de la enfermedad por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) 8 , entre muchas otras aplicaciones clnicas.

PARMETROS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRA DE FLUJO

La citometra de flujo permite medir diferentes parmetros de una clula. stos se
dividen en (Figura 2):

Figura2. Parmetros medibles por citometra de flujo

Parmetros nucleares

Parmetros citoplsmicos

Parmetros de superficie

Parmetros extracelulares

En la Tabla I se resumen los parmetros que pueden ser medidos por medio de esta
tcnica. Un aspecto importante y que representa una ventaja de ella, es la
posibilidad de medir tantos parmetros como anticuerpos se dispongan para ello,
marcados con distintos fluorocromos. As, es posible caracterizar una clula por su
fenotipo de superficie (Figura 3) y, al mismo tiempo, conocer el estado intracelular
que guarda la clula como su patrn de secrecin de citocinas, o bien, la etapa del
ciclo celular en la que se encuentra.

Figura 3. Procedimiento regular de marcaje o tincin fenotpica para clulas

humanas

Tabla I. Parmetros que se pueden analizar por citometra de flujo.

APLICACIONES CLNICAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Inmunofenotipificacin
La citometra de flujo es una tcnica que permite un anlisis celular
multiparamtrico de forma rpida, sensible y especfica. La disponibilidad de
amplios paneles de reactivos de gran calidad facilita la aplicacin de este mtodo
analtico en el diagnstico, clasificacin, evaluacin pronstica y valoracin de
enfermedad mnima residual. La citometra de flujo permite el anlisis de un gran
nmero de clulas (habitualmente entre 10,000 clulas por muestra y, ms de un
milln en los estudios de enfermedad mnima residual). La aplicacin de la
citometra de flujo al anlisis celular permite conocer aspectos fsicos de la clula
(tamao y complejidad) y determinar la presencia o ausencia de determinados
antgenos (habitualmente entre 3 y 4) en los diferentes compartimentos celulares
(superficie celular, citoplasma, mitocondria y ncleo) lo que contribuye a aumentar,
tanto la especificidad como la sensibilidad de la prueba. En otras reas como en el
diagnstico y clasificacin de las inmunodeficiencias primarias, en el monitoreo de
enfermedades autoinmunes como la esclerosis mltiple 9 , el lupus eritematoso
sistmico 10 y la artritis reumatoide 11 , la citometra de flujo ha demostrado su
utilidad. Tambin se ha demostrado til en el seguimiento de la recuperacin
inmune tras el trasplante de mdula sea12 , en la identificacin precoz del rechazo
en pacientes que han recibido un trasplante alognico 13 , o en el monitoreo
teraputico de los enfermos con anemia aplsica 14 . En la Tabla II se condensan
algunas de las aplicaciones clnicas ms importantes y con mayor empleo en la
actualidad.

Tabla II. Aplicaciones clnicas generales de la citometra de flujo.

APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO A LA INVESTIGACIN

BSICA
Son innumerables las aplicaciones de la citometra de flujo a la investigacin bsica,
desde campos como la microbiologa, hematologa, inmunologa, citologa,
patologa, biologa celular y molecular, entre otros. Sin embargo, es posible intentar
clasificar dichas aplicaciones segn el rea especfica en la que es posible utilizar la
citometra de flujo como herramienta de investigacin (Tabla III). La citometra de
flujo ha sido utilizada en el monitoreo del contenido de ADN 15 , expresin
fenotpica, transporte de drogas, flujo de calcio 16 , proliferacin y apoptosis 17 .
Virtualmente es posible marcar cualquier molcula que sea de inters siempre que
se disponga de un anticuerpo acoplado a un fluorocromo que pueda ser detectado
por el citmetro de flujo, esto hace posible que las aplicaciones del citmetro de
flujo se adapten prcticamente a cualquier necesidad de investigacin.
Actualmente, la relacin entre la aplicacin bsica y clnica es cada vez ms
estrecha dando la oportunidad a su vez a la aplicacin diagnstica, pronstica y de
tratamiento en mltiples enfermedades.

Tabla III. Aplicaciones generales de la citometra de flujo a la investigacin bsica

CITOMETRA DE FLUJO Y LA INVESTIGACIN EN ENFERMEDADES

PULMONARES
En los ltimos 20 aos, la citometra de flujo ha jugado un papel primordial en el
avance del entendimiento y habilidad para diagnosticar una variedad de desrdenes
linfoproliferativos 18 . Una de las aplicaciones nuevas ms interesantes es en la
evaluacin de pacientes con enfermedades inmunolgicas del pulmn 19 . Una
muestra tpica es aquella que es recolectada a partir de lavados bronquioalveolares
(LBA), cuya utilidad diagnstica ha quedado ampliamente demostrada 20-25 . Cuando
el lavado es realizado en pulmones normales, la clula presente ms predominante
es el macrfago, el cual est en un porcentaje de aproximadamente 90% o ms de
celularidad. Los linfocitos usualmente representan menos del 10% de la poblacin
celular, los granulocitos representan la poblacin celular minoritaria con el 1-2%26.
En fumadores, el porcentaje de linfocitos es an menor 27 . En muchos pacientes
con enfermedades pulmonares inmunolgicas, el LBA puede estar acompaado por
un incremento en linfocitos o eosinfilos. Cuando las clulas que estn
incrementadas son los linfocitos, resulta importante saber qu subpoblacin se
encuentra elevada. La citometra de flujo es ideal para esta evaluacin. La
proporcin relativa de linfocitos, macrfagos y granulocitos se determina fcilmente
a partir de grficas de tamao (Forward scatter FSC) contra complejidad celular
(Side scatter SSC). Los estudios de fluorescencia empleando diferentes
fluorocromos permiten determinar fcilmente la composicin de subconjuntos de
linfocitos (CD4+ y CD8+). De esta manera, es posible ensayar hasta siete colores,
con citmetros modernos, que representan siete marcadores diferentes sobre
poblaciones celulares, requirindose slo una pequea cantidad de muestra
(250,000 clulas en 50uL) a partir de un LBA.
Por ejemplo, un incremento en el nmero de clulas inflamatorias en un LBA
sugiere una alveolitis 28 . El tipo de clulas en el lavado puede correlacionar con el
tipo de inflamacin visto en las paredes alveolares de la biopsia. Aunque esas
correlaciones no son diagnsticas, pueden ayudar en el diagnstico cuando son
combinadas con otros datos.
En otro ejemplo, un nmero elevado de eosinfilos sugiere una neumona
eosinoflica 29 , asma 30,31 , toxicidad por drogas o aspergiliosis broncopulmonar
alrgica. Los nmeros ms altos de cuentas de eosinfilos son vistas en una
neumona eosinoflica. Esos pacientes tienen tpicamente tambin un incremento
moderado de linfocitos con clulas plasmticas ocasionales. El cuadro tpico del
lavado insertado en el contexto clnico adecuado es altamente sugerente de
neumona eosinoflica y podra evitar que al paciente se le practicara una biopsia a
cielo abierto. La linfocitosis en un LBA se puede asociar con varias enfermedades
pulmonares inflamatorias. La distribucin relativa de subpoblaciones de clulas T
puede suministrar informacin adicional til. Un nmero elevado de linfocitos T
CD4+ da como resultado que la relacin CD4/CD8 sea mayor que uno, y esto es
visto en pacientes con sarcoidosis 32 y otras enfermedades que producen
granulomas, entre las que se encuentran la tuberculosis 33 , asbestosis 34 y artritis
reumatoide 35 . En general, una enfermedad pulmonar activa est asociada con una
relacin CD4/CD8 elevada. Aproximadamente un 90% de los pacientes con
sarcoidosis tienen una alveolitis linfocitaria. En el caso de la sarcoidosis,
aproximadamente el 60% de los pacientes tienen una relacin CD4/CD8 mayor de

3.5. Para relaciones CD4/CD8 mayores de 5 y cercanas a 10 la especificidad de un

diagnstico de sarcoidosis es mayor 36 . Es caracterstico de la alveolitis alrgica
extrnseca un incremento importante en la proporcin de linfocitos, siendo sta de
al menos el 50% del total de las clulas presentes en el LBA 37,38 . En algunos casos
los neutrfilos y eosinfilos pueden verse incrementados. Dicha linfocitosis es
predominantemente CD8 (+) dando como resultado una disminucin de la relacin
CD4/CD8 39 . Los trabajos publicados al respecto son contradictorios 40-43 y en
nuestro laboratorio hemos observado que pacientes alveolticos a diferentes etapas
de la enfermedad (subagudos y crnicos), muestran diferentes relaciones de
CD4/CD8 (datos no publicados). Las clulas NK pueden tambin estar presentes y
se observa asimismo evidencia clara de activacin de clulas T por medio de
marcadores como CD69 y HLA-DR 44-46 . En este mismo sentido, cabe aclarar que la
evaluacin de las muestras de LBA de los diferentes tipos de alveolitis no permite
distinguir entre los diferentes cuadros clnicos, pero puede ayudar a excluir otros.
Las aplicaciones en el rea de las enfermedades pulmonares de origen
inmunolgico se extienden an ms, se ha estudiado con el auxilio de la citometra
de flujo el papel que juegan ciertas citocinas en enfermedades como neumonitis por
hipersensibilidad 47 . O la expresin de ciertos receptores de quimiocinas y sus
ligandos asociados con algunos padecimientos como rechazo a trasplantes
pulmonares 48 , asma 49 , alveolitis 50 o sarcoidosis 51 , as como la incidencia y
funcin de las clulas NK 52,53 en estas mismas enfermedades intersticiales.
Asimismo, la prevalencia de las subpoblaciones de linfocitos T gamma-delta ha
mostrado ser importante para algunas enfermedades como la sarcoidosis 54 ,
neumonitis por hipersensibilidad 55 o fibrosis pulmonar idioptica 56.
Actualmente, estn en proceso protocolos de investigacin en el Instituto Nacional
de Enfermedades Respiratorias (INER) que contemplan la determinacin de un
amplio perfil fenotpico que proporciona informacin fundamental sobre el estado
celular de la neumonitis por hipersensibilidad inducida por antgeno aviario, la de
mayor incidencia en Mxico, en sus diversas etapas clnicas, as como en la fibrosis
pulmonar idioptica. Mediante esta tcnica hemos realizado tambin mediciones de
carcter funcional sobre la actividad celular, como deteccin intracelular y secrecin
de citocinas (datos no publicados). La caracterizacin de estas enfermedades
intersticiales en Mxico, permitir visualizar los mecanismos inmunes que se
establecen y que como consecuencia determinan los distintos estados de dichas
enfermedades pulmonares.
CITOMETRA DE FLUJO Y VIH
El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el sndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA), fundamentalmente la cuantificacin en sangre perifrica de las
clulas CD4+ y los linfocitos CD8+ aporta un valor diagnstico y pronstico en esta
patologa 57 . En la actualidad, representa una tcnica de rutina en muchos
laboratorios, ante la necesidad de establecer controles peridicos del nmero de
clulas CD4+ en estos pacientes 58 . El antgeno CD4 es el receptor para el VIH.
Cuando ste infecta humanos, las clulas que con ms frecuencia infecta son las
CD4+, que se multiplican para combatir infecciones y producir ms copias del VIH.
El nmero absoluto de linfocitos T CD4+ es el parmetro celular asociado ms
estrechamente a la progresin de la enfermedad causada por el VIH y al pronstico
del paciente 59 . La relacin entre los linfocitos T CD4+ y CD8+ (CD4/CD8), se
conoce como la relacin cooperador/supresor. En personas sanas esta relacin se
encuentra entre 0.9 y 1.9, lo que significa que hay una a dos clulas CD4 por cada
clula CD8 60 . A partir de 1992, en los pases desarrollados, se ha establecido una
serie de lineamientos para la realizacin correcta del conteo de clulas CD4/CD8.
Se propone el uso de citometra de flujo y un panel de 12 anticuerpos monoclonales
combinados: CD45/CD14 (para enmarcar una ventana); CD3/CD4 (para medir
linfocitos T cooperadores); CD3/CD8 (para medir linfocitos T supresores);

CD3/CD19 (para separar la poblacin de linfocitos T y B); CD3/CD56 (para separar

las clulas NK); y, el control de anticuerpos de isotipo. Asimismo, en Mxico se han
publicado trabajos donde se sugiere la conveniencia de utilizar un panel semejante
para el conteo de clulas CD4+, considerando un mnimo de seis anticuerpos 61 . En
el INER, el SIDA es la principal causa de mortalidad hospitalaria en personas de 18
a 45 aos de edad y ocupa, desde hace varios aos, una de las cinco primeras
causas de mortalidad general de los pacientes hospitalizados. Desde hace cinco
aos la citometra de flujo se utiliza en el INER para realizar el conteo de linfocitos
T, tanto en los pacientes internados en el hospital como a los que se presta este
servicio de manera extrahospitalaria como seguimiento de la enfermedad (Figura
4). Se atienden un promedio de 300 pacientes mensuales, lo cual muestra la
importancia clnica, tanto diagnstica como pronstica que la citometra de flujo
tiene en este rengln dentro del INER.

Figura 4. Estudio de conteo total de linfocitos T CD4/CD8 en un paciente con VIH

en estado temprano de la infeccin (A) con una cuenta de linfocitos T CD4+ de 17%
y en estado tardo,
(B) con una cuenta de linfocitos T CD4+ de 3%. Estudio de rutina realizado en el
laboratorio de VIH del INER.

LA CITOMETRA DE FLUJO A LA VANGUARDIA EN EL INER: FACSAria

Actualmente se cuenta ya con el citmetro de flujo que ha revolucionado la era
moderna de la citometra, el FACSAria de Beckton Dickinson. Gracias a la fundacin
Gonzalo Ro Arronte, IAP, el INER adquiri el primer FACSAria que llega a nuestro
pas y, el primero tambin en Amrica Latina y que se pone al servicio del Instituto
en el rea de investigacin bsica. Se trata de un separador celular de alta
velocidad y desempeo, capaz de medir hasta 11 parmetros de manera

simultnea. Este instrumento cuenta con alineacin automtica de lser y una

nueva plataforma de anlisis en sistema Windows. Cuenta con un sistema de
limpieza automtico entre muestras, as como limpieza general del instrumento.
Gracias a su sistema totalmente digital es capaz de adquirir 70,000 eventos (clulas
o partculas) por segundo y es posible separar 25,000 clulas con una pureza al
menos del 98%.
Las aplicaciones en investigacin bsica del FACSAria son innumerables, van desde
la caracterizacin fenotpica de siete colores, hasta anlisis de parmetros
intracelulares, anlisis de cromosomas, organelos celulares, apoptosis, estudios
funcionales, as como separacin celular altamente especfica con fines de
clonacin. As, el INER se encuentra ya a la vanguardia en citometra de flujo a
nivel mundial y con la capacidad cientfica para desarrollar investigacin bsica en
enfermedades pulmonares con calidad internacional.
Agradecimientos
A la qumica Edna Hannia Rodrguez Aguirre por facilitarnos la imagen caracterstica
de un paciente con VIH en estado avanzado y tardo tratado en el INER.

CUENTA DE LEUCOCITOS
OBJETIVO
Aprender a realizar y aplicar la metodologa para un recuento de Leucocitos por
milmetro cbico de sangre e interpretar el resultado.
FUNDAMENTO
Para el conteo de leucocitos, se usan mtodos sistemticos que son ms rpidos y
precisos, y los mtodos manuales.
Todo mtodo manual de recuento celular incluye 3 fases:
Dilucin de la sangre
Muestreo de la sangre diluida en un volumen
Recuento de clulas en ese volumen
Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que
corresponden a los campos 1, 3,7 y 9.
Para su dilucin, se hace lo mismo que para los hemates pero empleando la pipeta de
blancos, de modo que la solucin que obtenemos es de 1/20. Se utiliza como diluyente
el lquido de Turk. El lquido de Turk es hipotnico de modo que se destruyen los
hemates y as no entorpecen en el recuento.
El lquido de Turk consta de cido actico glaciar 2ml, violeta de genciana disolucin
de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deber filtrarse a
menudo para evitar levaduras y hongos.
En un principio es un poco difcil distinguir los leucocitos de los restos de membranas
de los hemates hemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son ms
refringentes (ms brillantes) al moverlo con el microscopio que los restos de hemates.
Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmtica y de la membrana

nuclear (a veces ms) como lneas finas y brillantes. Esto se observa fcilmente
moviendo el microscopio hacia delante y hacia atrs

MATERIAL
Pipeta de Thoma para glbulos blancos (perla blanca)
Equipo para venopuncion (Tubo lila)
Boquilla blanca
Tubo de goma
Tubos de ensayo
Papel parafilm
Cmara de Neubauer
Cubrehematimetro
Microscopio
Gasas
SUSTANCIAS
Alcohol al 70%
Sangre venosa
Liquido de Turk

PROCEDIMIENTO

1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica

puncin venosa. La sangre es recogida en un tubo lila con EDTA
2. Colocar el tubo de plstico y la boquilla para aspirar en la pipeta

3. Llenar la pipeta de glbulos blancos con sangre hasta la marca 0.5 para
realizar una dilucin de 1/20. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si
la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente

4. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito que contiene el diluyente (liquido de

Turk) y absorber hasta la marca 11, no deben quedar burbujas.

5. Se tapan ambos extremos de la pipeta con papel parafilm y se coloca en un

rotador automtico o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos

6. Montar la laminilla de vidrio en la cmara para recuento. Debe estar limpia y

seca.
7. Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota
pequea cerca de un extremo de la cmara para que por capilaridad se llene
exactamente.

8. Dejar 3 minutos que los leucocitos se sedimenten

9. Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar en

los 4 cuadrados angulares.
10. En el recuento se incluyen las clulas que cubren o tocan por dentro o por
fuera las lneas limitantes superior e izquierda en el cuadro pequeo de
recuento y no se consideran los que estn en los lmites inferior y derecho.
OBSERVACIONES

Cmara de Neubauer, 40x

Enfocando uno de los cuadros laterales, se aprecian claramente los 16 cuadros pequeos
donde se tienen que contar los leucocitos que hay en ellos. Se debe de tener cuidado de no
confundir los restos de eritrocitos hemolizados con los leucocitos, que deben de aparecer
como puntos purpuras o negros, como los que estn a las 9

RESULTADOS
Los recuentos de leucocitos, al igual que los eritrocitos, se expresan como
concentraciones, que en este caso seran nmero de clulas por unidad de volumen
de sangre, que es 1mm3
Despus de contar los glbulos blancos de los 4 cuadrados angulares, se suman el
total de ellos y con dicha cantidad de hace el siguiente clculo:
N de leucocitos x mm3 = altura x dilucin x rea
N de leucocitos x mm3 = 1/10 x 1/20 x 4 = 1/10 000
N de leucocitos x mm3 = 4/200 = 1/50
N de leucocitos x mm3 = N de leucocitos contados x 50
En el anlisis hecho, los resultados de la cuenta de clulas quedaron as por casilla:

El nmero de leucocitos fue de 111, que al multiplicarse por 50 daba como resultado
5 550/mm3, lo que indica un ndice normal, sin embargo apenas y supera el mnimo,

pues el paciente era un hombre, de 41 aos de edad.

VALORES DE REFERENCIA
(Millones de clulas/mm3)
Hombres y Mujeres:..5 000-10 000

CONCLUSIN
Los leucocitos son las clulas sanguneas que dentro del organismo participan
desarrollando diferentes funciones como son: fagocitosis, defensa inmunolgica
especfica o inespecfica.
Existen dos grandes tipos de estos glbulos:
Polimorfonucleares:
Basfilos
Eosinfilos
Neutrfilos
Mononucleares:
Linfocitos (clulas T y clulas B)
Monocitos
El recuento leucocitario representa el nmero de leucocitos en un litro de sangre
completa. La cuantificacin o recuento de leucocitos es muy importante para el
diagnstico de enfermedades.
Un bajo nmero de glbulos blancos se denomina leucopenia y puede deberse a:
Insuficiencia de la mdula sea (por ejemplo: debido a infeccin, tumor o cicatrizacin
anormal).
Enfermedades vasculares del colgeno (como el lupus eritematoso sistmico).
Enfermedad del hgado o el bazo.
Radioterapia o exposicin a la radiacin.
Un alto nmero de glbulos blancos se denomina leucocitosis y puede deberse a:
Anemia.

Tumores de la mdula sea.

Enfermedades infecciosas.

Enfermedad inflamatoria (como artritis reumatoide o alergia).

Leucemia.

Estrs emocional o fsico intensos.

Dao tisular (por ejemplo, quemaduras).

Es muy importante comentarle al mdico acerca de cualquier medicamento que se
est tomando, incluyendo productos de venta libre. Ciertos frmacos pueden interferir
con los resultados del examen, como Sulfonamidas, Alopurinol, cido acetilsaliclico
(aspirina), cloroformo, corticosteroides, epinefrina, heparina, quinina o triamtereno
La cmara de Neubauer o hemocitmetro es una lmina portaobjeto gruesa, en cuyo
centro se hayan dos superficies cuadriculadas iguales, separadas del resto de la
lmina por surcos y dos barras transversales algo ms elevadas.
Una laminilla cubreobjetos pticamente plan, que al colocarse sobre las barras
elevadas de la lmina forma una cmara entre el cubreobjetos y la superficie
cuadriculada, teniendo una altura de 0.1mm

En la cmara de Neubauer las reas de recuento de eritrocitos y leucocitos son

diferentes, como se muestra en la imagen.
.