Espectrofotometra

Principios, Componentes,
Cuidados, Control de
Calidad y Mantenimiento

Csar O. J. Pierre

Espectrofotometra
Trmino que se refiere al uso de la Radiacin
Electromagntica (REM) para medir las
concentraciones de una sustancia.

Csar O. J. Pierre

Un poco de historia
Antes de 1940 la mayora de las determinaciones en
qumica clnica eran del tipo volumtricas y
gravimtricas. Por lo que la mayor parte de los
resultados fueron semicuantitativos.
En la dcada de 1950 se comienza a utilizar el
espectrofotmetro
(EE.UU.).
ste
elimin
el
comparador de color, logrando as que los anlisis
fuesen ms cuantitativos, confiables, reproducibles e
incrementando la precisin y la exactitud.
El espectrofotmetro es un instrumento til, por las
ventajas tales como rapidez, sencillez, especificidad y
sensibilidad.
Csar O. J. Pierre

Antecedentes tericos
Todo tomo y molcula es capaz de absorber
energa (bajo ciertas limitaciones).
La energa puede proporcionarse en forma de
REM, luz.
El tipo y la cantidad de REM absorbida por una
molcula esta relacionada con su estructura.

As mismo la cantidad de REM absorbida est

relacionada con el nmero de molculas que
interaccionan con ella.
Csar O. J. Pierre

Antecedentes Tericos

Csar O. J. Pierre

Antecedentes tericos
De la REM slo se trabaja para la
espectrofotometra en qumica clnica con la
ultravioleta y la visible.

Csar O. J. Pierre

Antecedentes tericos
mxima
absorcin (nm)

Color
absorbido

Color
observado

400-450

Violeta

Amarillo-verde

450-480

Azul

Amarillo

440-470

Verde-azul

Naranja

470-500

Azul-verde

Rojo

500-560

Verde

Prpura

560-575

Amarillo-verde

Violeta

575-590

Amarillo

Azul

590-625

Naranja

Verde-azul

625-750

Rojo

Azul-verde
Csar O. J. Pierre

Antecedentes tericos
La radicacin
electromagntica tiene un
comportamiento dual, es
decir, como onda y como
partcula.
Como onda se sabe que
presenta la propiedades
de reflexin, refraccin y
difraccin, esta ltima
explica la descomposicin
de la luz en los diferentes
colores.

Campo
elctrico

Campo magntico

Campo
magntico

Radiacin electromagntica, de
luz polarizada en un plano y que
se propaga a lo largo del eje de
las x

Espectro de luz visible

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Antecedentes tericos
La REM se desplaza describiendo una onda, mientras ms
pequea es la longitud de onda () mayor energa posee y
viceversa.
La longitud de onda () es la distancia lineal desde cualquier
punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda
adyacente y se mide comnmente en nm .
La frecuencia () es el nmero de ondas que pasan por un
punto dado en una unidad de tiempo, es decir, en s-1 = hertz
(Hz).
Longitud de
onda grande

Baja frecuencia

Alta frecuencia

Longitud de
onda pequea

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Antecedentes tericos
La ecuacin

describe esa relacin.

La velocidad de la luz (c) una constante universal de

valor = 2,997 924 58 X 108 m/s.
La potencia (P) de un haz de radiacin es la energa
del haz que llega a un rea dada por segundo.
La intensidad (I) es la potencia por ngulo slido
unitaria.

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Antecedentes tericos
Como partcula (fotn) permite explicar el
proceso energtico de la REM.
E = h donde E = energa y h = constante de
Planck (= 6,626 0755 X 10-34 Js).
c
Sustituyendo de
, en E = h .

1
hc
o E hc ,
Nos queda que E
que

recibe el nombre de nmero de onda.

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Antecedentes tericos
Todas las molculas poseen energa la cual es debida a:
a)

La translacin.

b)

La vibracin de sus constituyentes (tomos).

c)

Rotacin y.

d)

Su configuracin electrnica.
Dando como resultado que la energa total sea igual a
la suma de cada una de las anteriores.

Por lo que la mecnica cuntica nos ndica que la

molcula slo puede adoptar ciertos valores de energa
y que sta se encuentra cuantizada y es diferente para
cada compuesto.
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Antecedentes tericos
La absorcin de la REM por alguna especie M se
considera en dos etapas y como un proceso
irreversible.
M + h
M*, donde M* es la partcula en estado
excitado, debido a la absorcin de un fotn la vida de
M* es del orden de 10-8-10-9 s.
La molcula regresa a su estado basal mediante la
liberacin de la energa antes adsorbida, es decir,
M*

M + calor.

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Fundamento
Cuando una muestra absorbe fotones, la
potencia del haz disminuye (P P0) donde P0
es la que sale del monocromador.

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Fundamento
La ley que explica la relacin entre la
absorcin y la concentracin de una sustancia
es conocida comnmente como ley de Beer o
Lambert-Beer.

Si T es la transmitancia, es decir la radiacin

que pasa altraves del cuerpo entonces
T=P/P0 por lo que T solo puede tener valores
que van desde cero hasta uno.

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Fundamento
Como normalmente se trabaja con %T entonces
tenemos que %T P 100 lo que nos da como resultado
P0
la ecuacin ms conocida para la relacin de la
absorbancia, esta es:

A 2 log%T

Cuando no se absorbe luz P=P0 A = 0.

Si se absorbe el 90% de la luz, 10% es lo que se
transmite, es decir, P=1/P0 dando un valor de A = 1.
Al absorberse el 99% de la luz, es decir, se transite
el 1% A = 2.
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Fundamento
La importancia de la absorbancia [A] (Densidad ptica [D.O.]
Densidad [D] o Extincin [E]) estiba en que es directamente
proporcional a la concentracin de la especie absorbente en la
muestra, y la expresin matemtica que la representa es.
A = bc que es la ley de Lambert-Beer

Donde A es la absorbancia de la muestra, (a) es el coeficiente

de extincin molar, b es la longitud de la trayectoria ptica y c la
concentracin de la solucin problema.
La relacin lineal entre A y b a una concentracin fija de
sustancia absorbente es una generalizacin para la que no se
conoce excepcin .

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Limitaciones a la ley
de Lambert-Beer
La relacin directa entre A y c si presenta desviaciones
a la linealidad medidas a una misma longitud de
trayectoria del haz.
Por lo que la ley slo se cumple con disoluciones
verdaderas y a concentraciones 0.01M o F. Puesto
que en toda solucin concentrada las molculas del
soluto interaccionan entre s por su proximidad: Lo
cual hace probablemente que cambien las propiedades
elctricas de las molculas, causando tambin una
modificacin en las propiedades pticas de stas.
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(continuacin)

Desviaciones qumicas. Debidas a la asociacin,

disociacin o reaccin de las sustancia problema con
el disolvente. V. g. soluciones mal amortiguadas, lo
cual cambia la concentracin y la desviacin es ms
aparente que real, por modificacin de los equilibrios
qumicos.

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Instrumento, sus partes

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Sus partes
a. Lmpara:

La tungsteno es una magnifica

fuente de radiacin en el intervalo
de los 320-2 500 nm y opera a T de
2 870 K.
Las ms empleadas en qumica
clnica son las de yoduro de
tungsteno que tiene una vida til de
2 a 3 000 h.
por debajo de los 360 nm es
conveniente utilizar una lmpara de
arco de deuterio la cual emite una
radiacin en el intervalo de 200-400
nm.
Menos frecuentes son las lmparas
de hidrogeno con intervalos iguales
a las de deuterio.
Las de mercurio presentan el
inconveniente de proporcionar slo
espectros discontinuos de 313, 365,
405, 436 y 546 nm.
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Sus partes
b, c y d son los
componentes del
monocromador.

b.

La rendija de entrada reduce

al mximo la luz difusa y
evita que la luz dispersa
penetre al dispersor, ste
solo lo puede hacer con un
mnimo de luz directa.

c.

Dispersor de luz (selector de

longitud
de
onda,
o
monocromador propiamente
dicho). Pueden ser prismas
o rejillas de difraccin.
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c Prismas y rejillas de difraccin

En caso de los prismas. Para la luz visible un prisma de
vidrio es bueno, sin embargo, este material no es
conveniente para las mediciones en la regin del
ultravioleta, pues el vidrio absorbe la radicacin a
estas .
La dispersin producida por un prisma ni es lineal, y se
hace mucho menor cuando >550 nm.

c
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d
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(continuacin)
Las rejillas de difraccin, estas se preparan a partir de una rejilla
patrn la en la cual se graban surcos las que se emplean para
las regiones visible-uv poseen 2 325 surcos por cm2- sobre una
superficie metlica.
La dispersin de la luz en las rejillas de difraccin es lineal. Como
los surcos estn muy prximos entre s cuando la luz es reflejada
por la rejilla, cada estra se comporta como una fuente de
radiacin. Si los rayos de luz adyacentes estn en fase, se
refuerzan unos a otros. Cuando no lo estn, se cancelan parcial o
totalmente.

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d Ranura o rendija de salida

sta determina el ancho del espectro de
dispersin que sale del sistema monocromador.
Puede enfocarse una lnea particular sobre
dicha ranura haciendo girar la rejilla. Si las
ranuras de entrada y salida son del mismo
tamao, la imagen de rendija de entrada
tericamente encajar exactamente en la
abertura de la ranura de salida cuando al
montaje del monocromador corresponde a la
longitud de onda de la radicacin. Moviendo el
montaje del monocromador en una u otra
direccin produce una continua disminucin de
la intensidad emitida, llegado a cero cuando la
imagen de la ranura de entrada ha sido
desplazada en todo su ancho.

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Como la luz obtenida que sale del sistema

monocromador no es verdaderamente de una sola ,
sino que comprende un intervalo de . El grado de
monocromaticidad se define como el Ancho de
Banda. Es el intervalo de que pasan a travs de la
rendija de salida.

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e Celdas o portamuestras
Existen de todos tamaos
y formas. Las
ms
comunes
para
medir
espectros visibles y de
ultravioleta
son
de
cuarzo, tienen un espesor
de 1,00 cm (o trayectoria
ptica).
Las
ms
fciles
de
conseguir
son
las
redondas (tipo tubo de
ensayo) las mejores son
las cbicas.
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Celdas

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f Detectores, fotomultiplicadores y
fototubos
Poseen la capacidad de
producir una seal elctrica
cuando son bombardeados
por fotones.
Se basan en el efecto
fotoelctrico.
El ms sensible es el
fotomultiplicador. En ste los
electrones emitidos por una
superficie
fotosensible
inciden en una segunda
superficie, llamada dnodo, la
cual
se
mantiene
(+)
respecto
al
emisor
fotosensible.

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Fundamento del
Fotomultiplicador

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g Registrador
De aguja o digital.
Incorporado a un sistema de impresin.
Conectado a una computadora.

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Errores en espectrofotometra
Para el anlisis cuantitativo se debe tomar en cuenta:
1.
La absorbancia no debe ser demasiado grande.
2.
La absorbancia debe medirse en un pico o en una meseta
donde dA/d sea pequea.
3.
El ancho de banda del monocromador debe ser lo ms grande
posible, mas pequea comparada con la banda que va a
medirse.
Los errores instrumentales
Las mediciones ms exactas suelen hacerse cuando la
absorbancia se encuentra entre 0,4 y 0,9.
Para mayor precisin, las muestras deben estar libres de
polvo, las celdas de huellas digitales, o cualquier otra
contaminacin o dao fsico que modifique o altere la ptica
en general.

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Control de calidad
Es
necesario
realizar
peridicamente
pruebas para verificar que el instrumento esta
trabajando adecuadamente: exactitud de
longitud de onda, linealidad de la respuesta del
detector, radiacin errtica, y exactitud
fotomtrica.

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Disco de Newton
800 400
620

Rojo

Violeta

430

Azul

Naranja

Verde

580

490

560
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Colores complementarios
para leer en el
espectrofotmetro
Intervalo de longitud de
onda (nm)

Color de la luz
absorbida

Color complementario
trasmitido

400 435

Violeta

Amarillo verdoso

435 480

Azul

Amarillo

480 490

Azul verdoso

Anaranjado

490 500

Verde azulado

Rojo

500 560

Verde

Prpura

560 580

Amarillo verdoso

Violeta

580 595

Amarillo

Azul

595 650

Anaranjado

Azul verdoso

650 750

Rojo

Verde azulado

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Exactitud de longitud de onda

Se han sugerido varios estndares para verificarla en las
regiones visible y uv.
Las lmparas de mercurio producen como ya se ha
mencionado lneas de emisin.
Las lneas de emisin del hidrgeno (o deuterio) con lneas
de emisin tiles a 486 y 656 nm.
El espectro de absorcin del xido de holmio como vidrio o
en solucin posee fuertes lneas de absorcin a
aproximadamente 241, 279, 287, 333, 361, 418, 453, 536 y
636 nm.
El didimio tiene bandas de absorcin mucho ms amplias
573, 586, 685, 741 y 803.
Espectro de absorcin del benceno.
Solucin alcalina de cromato de potasio.
Puntos isosbsticos.
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Puntos isosbsticos
Cuando una sustancia presenta varias formas (como los colorantes
cido-base), stas pueden presentar un mismo punto donde se cruzan
los espectros de absorbancia, stos son fijos por lo que permiten
verificar la exactitud de la longitud de onda.
La limitacin que este procedimiento tiene es que se debe hacer el
barrido espectrofotomtrico para cada una de las formas de dicha
sustancia (v. g. rojo de metilo) y realizar la grfica tal como lo muestra
la figura siguiente.

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Linealidad
Un espectrofotmetro que trabaje adecuadamente debe
mostrar una relacin lineal entre la cantidad de energa
radiante absorbida y la lectura del indicador.
sta es un requisito para la exactitud tanto instrumental
como analtica.
Filtros de vidrio pueden emplearse.
El empleo de soluciones a distintas concentraciones
de un compuesto que siga la ley de Lambert-Beer por
ejemplo:
La oxihemoglobina a 415 nm.
p-nitrofenol a 405 nm.
Sulfato de amonio y cobalto a 512 nm.
Sulfato de cobre a 650 nm.
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Mantenimiento
Preventivo. ste se realiza tomando en cuenta
los datos vertidos en la bitcora.

Registrar el tiempo que permanece encendida la

lmpara
Verificar el la vida til de la lmpara y solicitar a
compras un repuesto con tiempo suficiente para su
cambio.
Anotar fecha, hora, y personal que realiz el cambio
de lmpara.
Anotar fecha, hora y operador que hizo la
verificacin de linealidad, y exactitud de .
Anotar hora y da que se realiz la limpieza,
engrasado y revisin de partes del instrumento.
Anotar el ltimo mantenimiento correctivo que se le
realiz al instrumento.
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Turbidimetra y
nefelometra

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Definicin
Son dos Procedimientos relacionados que

se basan en la dispersin de la radiacin

causada por las partculas de materia
Cuando la luz pasa a travs de un medio

en el que existe una suspensin de

partculas slidas, parte de la radiacin se
dispersa
en
todas
direcciones,
confirindole aspecto turbio a la mezcla.
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Fundamentos
El mtodo Turbidimtrico se basa en la
disminucin de un haz colimado como
consecuencia de la dispersin de la luz por las
partculas (estas medidas se hacen mediante
la luz transmitida).
El mtodo Nefelomtrico se basa en la medida
de la radiacin dispersada (generalmente a un
ngulo de 90 con respecto al haz incidente,
estas mediciones se hacen por la luz dispersa)
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La eleccin entre una medicin nefelomtrica o

turbidimtrica depende de la fraccin de luz
dispersada. Cuando es ms extensa (debida a
la presencia de abundantes partculas), la
turbidimetra es el mtodo ms idneo.
En contraparte cuando la dispersin es mnima
y la disminucin de haz de potencia pequea,
la medicin por Nefelometra es la mejor.

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La dispersin asociada con ellos no supone prdida

neta de potencia radiante, solo es afectada la
direccin de la propagacin.
La intensidad de la radiacin depende de la:
Nmero de partculas
Tamao de partcula y forma
ndices de Refraccin relativos de las partculas y
del medio
Longitud de Onda de la Radiacin

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Efecto de la longitud de
onda en la dispersin
El coeficiente de turbidez , vara con la longitud de onda
tal como lo establece la ecuacin:
= S-t
Donde S es una constante para el sistema dado, t depende
del tamao de partcula, tiene valor de 4 cuando las
partculas dispersas son menores que la de la radiacin.
Comnmente en el anlisis se emplea luz blanca. Pero si la
solucin presenta color, es necesario escoger una porcin
del espectro en el que la absorcin por el medio se reduzca
lo ms posible.

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