CONTROL EN

INMUNOLOGAINMUNOFLUORESC
ENCIA
DOCENTE:
DAYANA JULCA PUENTE
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SISTEMA DE ANLISIS
DE ANA-RO POR
INMUNOFLUORESCEN
CIA HEP-2000
Se trata de una determinacin indirecta por inmunofluorescencia para la
deteccin semicuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA) en suero
humano. En este sistema de anlisis se emplean clulas HEp-2
transfectadas, lo que permite identificar los autoanticuerpos contra el
antgeno SSA/Ro. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un
patrn de tincin distintivo en las clulas transfectadas. Si se observa
este patrn, el mismo se considera como prueba confirmadora de la
presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. La ausencia de este patrn
distintivo no descarta la posible presencia de anticuerpos contra el
SSA/Ro. Este sistema de anlisis ha de emplearse como ayuda en la
deteccin de anticuerpos asociados a las enfermedades reumticas
sistmicas.

EXPLICACIN DE LA PRUEBA
Anticuerpo antinuclear (ANA) es un trmino general que se emplea
para referirse a los autoanticuerpos dirigidos contra diversas protenas
del ncleo celular. En los primeros estudios sobre estos autoanticuerpos,
realizados con tcnicas de inmunofluoresencia, se observaron
determinados detalles de unas pocas protenas del ncleo. A la vista de
la elevada correlacin entre la presencia de ANA y el lupus eritematoso
sistmico (LES), basta con que no estn presentes para descartar la
enfermedad.
Aunque los anticuerpos especficos del ADN siguen mostrando una
elevada correlacin con l LES, tambin se han detectado algunas
macromolculas nucleares y citoplsmicas asociadas a otras
enfermedades del tejido conjuntivo. Parece que algunos de estos
autoanticuerpos tienen un significado diagnstico y/o pronstico en la
esclerosis sistmica progresiva, las enfermedades mixtas del tejido
conjuntivo, el sndrome de Sjgren, la polimiositis y/o la artritis
reumatoide . Debido a estas asociaciones a enfermedades, en la
actualidad se considera que la deteccin de ANA constituye una

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herramienta general para la deteccin selectiva de las enfermedades del

tejido conjuntivo.
La sensibilidad de la prueba vara con el tipo de sustratos utilizado, el
procedimiento de fijacin y los tipos de ANA presentes en los sueros. Por
lo general, los sustratos de cultivos celulares muestran mayor
sensibilidad que los cortes de tejido. La deteccin de autoanticuerpos
contra el antgeno SSA/Ro es especialmente variable. Los tejidos de
roedores no contienen niveles detectables del antgeno SSA/Ro, y la
sensibilidad de deteccin de anticuerpos contra el SSA/Ro en sustratos
de cultivos celulares vara, segn los informes, del 50 al 90%.
El sistema de anlisis de ANA HEp-2000 de Immuno Concepts con
clulas epitelioides humanas (HEp-2) mitticas representa un avanzado
sistema de inmunofluorescencia para la deteccin de ANA. Se ha
demostrado que las clulas HEp-2 con figuras mitticas son ms
sensibles y proporcionan un modelo de reconocimiento ms preciso que
el clsico sustrato de rin de ratn para detectar anticuerpos en la
esclerosis sistmica progresiva (ESP). Las figuras mitticas mejoran el
reconocimiento diferencial del modelo y ayudan a detectar antgenos
nucleares no notificados anteriormente, que alcanzan concentraciones
superiores en las clulas que se encuentran en mitosis. Las clulas HEp2 de este sistema de anlisis han sido transfectadas con varias copias de
la secuencia de ADN especfica que transporta la informacin del
autoantgeno SSA/Ro. Aproximadamente el 10-20% de las clulas
transfectadas expresan este antgeno en exceso, por lo que la deteccin
de autoanticuerpos contra el SSA/Ro es ms homognea que en clulas
HEp-2 no transfectadas. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden
mostrar un patrn de tincin distintivo en las clulas transfectadas. Si se
observa este patrn, el mismo se considera como prueba confirmadora
de la presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. La ausencia de este
patrn distintivo no descarta la posible presencia de anticuerpos contra
el SSA/Ro.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El sistema de anlisis de ANA por inmunofluorescencia de IC emplea la
tcnica indirecta de anticuerpos fluorescentes descrita por primera vez
por Weller y Coons. Las muestras de pacientes se incuban con un
sustrato antignico que permite la unin especfica de los
autoanticuerpos a los ncleos de las clulas. Si hay ANA, se forma un
complejo antgeno-anticuerpo estable. Tras el lavado para retirar los
anticuerpos unidos de forma inespecfica, se incuba el sustrato con
anticuerpos antihumanos conjugados con fluorescena. Si los resultados
son positivos, se forma un complejo estable con tres partes: el
anticuerpo fluorescente unido al anticuerpo antinuclear humano, unido a
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su vez al antgeno nuclear. Este complejo se puede visualizar con la

ayuda de un microscopio de fluorescencia. En las muestras positivas, los
ncleos celulares mostrarn una fluorescencia de color verde manzana,
con un patrn de tincin caracterstico de la particular distribucin del
antgeno nuclear en las clulas. Si no hay ANA en las muestras, el ncleo
no presentar un patrn de fluorescencia nuclear claramente
discernible.

COMPONENTES DEL SISTEMA

Utilizacin: Todos los componentes se entregan listos para su
empleo, sin necesidad de fragmentarlos ni prepararlos (excepto el
tampn PBS, que debe ser disuelto en agua desionizada o
destilada antes de utilizarlo).
Conservacin: Todos los componentes se pueden conservar en
refrigerador entre 2 y 10C. Una vez preparado, el tampn PBS
debe conservarse en envases con tapn de rosca, y se conserva
entre 2 y 25C.
Estabilidad: Todos los componentes son estables al menos durante
12 meses a partir de la fecha de fabricacin. No utilice los
componentes pasada la fecha de caducidad.
REACTIVOS
Portaobjetos de sustrato SLIDE: Portaobjetos con sustrato para
ANA con clulas HEp-2000 (con figuras mitticas) cultivadas y
estabilizadas directamente en los pocillos del anlisis. Son clulas
HEp-2 transfectadas de manera estable con el autoantgeno
SSA/Ro. El exclusivo diseo de los fosos del portaobjetos reduce al
mnimo la contaminacin cruzada de los pocillos durante la
prueba. La bolsa que contiene el portaobjetos se rellena con un
gas inerte no txico que contribuye a la estabilidad de las clulas.
Control positivo de SSA/Ro CONTROL +: N de catlogo 2035-Ro.
Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero
de control humano positivo con anticuerpo especfico contra los
antgenos SSA/Ro. Este suero da una reaccin de tincin moteada
fina, tpica del anti-SSA/Ro que se observa en el sustrato de clulas
HEp-2000 de Immuno Concepts. La expresin se localiza
predominantemente en el ncleo, con destacada tincin nucleolar.
Tambin se puede observar una dbil tincin citoplsmica en las
clulas que expresan el antgeno en exceso. La regin
cromosmica de las clulas mitticas muestra una reaccin de
tincin negativa.
Control positivo homogneo CONTROL +: N de catlogo 2021.
Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero
de control humano positivo con anticuerpo especfico contra el
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ADN y/o los antgenos nucleares DNP. Este suero da una reaccin
de tincin homognea con el sustrato de clulas HEp-2000 de
Immuno Concepts. La regin cromosmica de las clulas mitticas
muestra la misma reaccin de tincin homognea.
Control positivo moteado CONTROL +: N de catlogo 2022. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de
control humano positivo con anticuerpo especfico contra el Sm y/o
los antgenos nucleares DNP. Este suero da una de las reacciones
de tincin moteada ms habituales que se observan con el
sustrato de clulas HEp- 2000 de Immuno Concepts. La regin
cromosmica de las clulas mitticas muestra una reaccin de
tincin negativa.
Control positivo nucleolar CONTROL +: N de catlogo 2023. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de
control humano positivo con anticuerpo especfico contra los
antgenos del nuclolo. Este suero da una reaccin de tincin
nucleolar con el sustrato de clulas HEp-2000 de Immuno
Concepts.
Control positivo del centromere CONTROL +: N de catlogo 2025.
Vial con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero
de control humano positivo con anticuerpo especfico contra los
centrmeros cromosmicos (cinetocentro). Este suero da una
reaccin de tincin moteada discreta con el sustrato de clulas
HEp-2000 de Immuno Concepts. La regin cromosmica de las
clulas mitticas muestra la misma reaccin discreta de tincin
moteada.
Suero de control titulable TC: N de catlogo 2026. Vial listo para
usar, que contiene 0,5 ml de suero de control humano positivo que
ser tratado como si fuera una muestra de paciente sin diluir.
Suero de control negative CONTROL| - : N de catlogo 2031. Vial
con cuentagotas listo para usar, que contiene 1,0 ml de suero de
control humano negativo. Aunque el suero de control negativo
puede dar cierta fluorescencia del citoplasma al teirse de forma
ms brillante la regin no cromosmica de la clula mittica, no
presenta un patrn de tincin nuclear discernible.
Reactivo con anticuerpos fluorescents CONJ FITC: N de catlogo
2009-Ro (9,0 ml), 2075-Ro (23 ml). IgG de cabra antihumana
(cadenas pesadas y ligeras) conjugada con fluorescena
isotiocianato (FITC). El reactivo se presenta listo para usar en
frascos con cuentagotas de precisin, con 9,0 ml por cada 10
portaobjetos, en kits de anlisiscompletos.

ELEMENTOS NO REACTIVOS

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 Polvo tampn PBS PWDR PBS: N de catlogo 1011. Polvo salino

tamponado con fosfato (0,01 M, pH 7,4 0,2). Cada bolsa
contiene polvo tampn suficiente para formar 1 litro. (Los kits de
anlisis completos llevan una bolsa de polvo tampn por cada
cinco portaobjetos).
Preparacin: Disuelva una bolsa de polvo tampn en 1 litro de
agua desionizada o destilada, tpelo el recipiente y almacenar
entre 2 y 25C durante 4 semanas como mximo, o hasta que
aparezcan signos de contaminacin u otros cambios visibles.
Medio para preparaciones microscpicas semipermanentes
SOLN MM: N de catlogo 1111. Vial con cuentagotas listo para
usar, que contiene 5,0 ml de medio para preparaciones
microscpicas a base de glicerol.
Cubreobjetos CVSLP: N de catlogo 1042. Cada envase
contiene diez cubreobjetos de vidrio n 1 de 24 x 64 mm.

OTROS MATERIALES

Pipetas volumtricas para dispensar volmenes de 20-25 l

Jarras Coplin o platillos de tincin
Frasco para exprimir o pipetas de Pasteur
Pipetas serolgicas
Envases de un litro (para el tampn PBS)
Agua desionizada o destilada
Probetas para preparar las diluciones de suero
Placa de Petri u otra cmara de incubacin
Papel secante o toallas de papel
Guantes desechables
Cronmetro
Microscopio de fluorescencia equipado con un filtro excitador de
495 nm y un filtro de barrera de 515 nm

PRECAUCIONES
1. Todos los materiales de procedencia humana utilizados en este
producto han sido analizados en busca de anticuerpos con el virus
de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de la
inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de la hepatitis C
(VHC) y el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAG) con
mtodos homologados por la FDA, obteniendo resultados
negativos (no reactivos en varias ocasiones) en todos los casos.
Pero no existe ningn mtodo de anlisis que pueda garantizar por
completo la ausencia de VIH-1, VIH-2, hepatitis C, hepatitis B u

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otros agentes infecciosos. Por eso, todos los materiales del kit
deben ser manipulados como si fueran infecciosos.
2. Todas las muestras de paciente deben ser manipuladas segn el
nivel 2 de bioseguridad, segn se recomienda en el manual de los
Centers for Disease Control/National Institutes of Health para toda
muestra de suero o sangre humana potencialmente infecciosa:
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1999
Edition.
3. La disolucin de los componentes o su sustitucin por otros
distintos de los suministrados con el sistema puede arrojar
resultados incoherentes.
4. Se emplea azida sdica (0,09%) como conservante. La azida
sdica puede reaccionar con el plomo o con las conducciones de
cobre y formar sales de azidas metlicas explosivas. Al eliminar los
reactivos, lavar con grandes volmenes de agua del grifo para
evitar que queden residuos en las tuberas. La azida sdica es
venenosa y puede ser txica en caso de ingestin.
5. Este kit es para uso diagnstico in vitro.
6. Si fuera necesario utilizar sueros hemolizados o lipmicos,
calintelos para inactivarlos a 56C durante 30 minutos para
obtener resultados ptimos. No utilice sueros con contaminacin
microbiana.
7. El suero de control titulable debe utilizarse para controlar la
reproductibilidad entre lotes y entre ciclos. No est concebido para
medir la sensibilidad o la especificidad generales del ensayo.
8. Est prohibido fumar, comer o beber en las zonas de manipulacin
de las muestras o los reactivos del kit.
9. Evite salpicaduras y la generacin de aerosoles en todo momento.
10.
Si los tiempos de incubacin y las temperaturas no son los
especificados, los resultados pueden ser errneos.
11.
La contaminacin cruzada de los reactivos o de las muestras
puede dar resultados falsos.
12.
Los elementos de vidrio reutilizables deben ser lavados y
enjuagados a fondo para eliminar los detergentes antes de su uso.
Todos los elementos de vidrio deben estar limpios y secos antes de
su uso.
13.
Todos los reactivos, portaobjetos y muestras deben estar a
temperatura ambiente (18-25C) antes de su uso.
14.
Para manipular las muestras y los reactivos debe utilizar
guantes desechables, y cuando acabe deber lavarse bien las
manos.
15.
La contaminacin microbiana de los reactivos o de las
muestras puede dar resultados falsos.
16.
No pipetee nunca con la boca y evite el contacto de los
reactivos y las muestras con la piel y las mucosas. En caso de
contacto, lvese con un jabn germicida y agua abundante.
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OBTENCIN DE MUESTRAS
Obtencin: La muestra ideal es suero. Se obtendrn
aproximadamente 5 ml de sangre por venipuncin asptica, con
un tubo de vaco estril u otro sistema de obtencin adecuado.
Deje que la sangre coagule a temperatura ambiente (18-25C). Se
separar el suero del cogulo por centrifugado cuanto antes, para
que la hemlisis sea mnima.
Sustancias que interfieren: No se utilizarn sueros que muestren
grados elevados de hemlisis, ictericia, lipemia o crecimiento
microbiano, pues en todas esas circunstancias se pueden producir
resultados aberrantes. Si la muestra presenta partculas visibles,
stas deben ser eliminadas por centrifugado antes de la prueba.
Conservacin: Los sueros se pueden conservar entre 2 y 10C
durante una semana como mximo. Si el anlisis se posterga, los
sueros deben conservarse congelados a una temperatura de 20C
o menos. No se utilizarn refrigeradores ni congeladores con
sistema auto-frost (eliminacin automtica de la escarcha).
PRECAUCIN: Si las muestras son sucesivamente congeladas
descongeladas, se pueden obtener resultados falsos positivos
negativos.

y
o

INTERPRETACIN DE LOS
RESULTADOS
CONTROL DE CALIDAD
Para el control de calidad se dispondrn los controles positivo, negativo
y de PBS en los pocillos al efecto que se encuentran en todos los
portaobjetos. El control positivo debe dar una fluorescencia de color
verde manzana en los ncleos de las clulas, con un patrn claramente
discernible caracterstico del suero de control utilizado. El control
negativo debe dar una fluorescencia inespecfica de color verde mate en
el citoplasma y en el ncleo, pero sin un patrn discernible de tincin
nuclear. El control PBS se emplea para observar la tincin inespecfica
del reactivo de anticuerpos, y no debe dar fluorescencia verde. Si los
controles no se ven como se ha descrito, la prueba no es vlida y debe
repetirse. Si se emplea el anlisis de ANA-Ro HEp-2000 para confirmar
la presencia de anticuerpos anti-SSA/Ro, el control positivo de SSA/Ro,
nmero de catlogo 2035-Ro, debe realizarse en al menos un
portaobjetos de los utilizados ese da.

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CONTROL TITULABLE OPCIONAL

Para interpretar los ttulos, muchos laboratorio empiezan por el pocillo
que contiene la muestra ms diluida, y van retrocediendo hasta la
dilucin 1:40. El primer pocillo en el que se aprecie un patrn discernible
de tincin nuclear corresponde al ttulo que se considera como criterio
de valoracin. Recomendamos utilizar esta tcnica para determinar los
criterios de valoracin de los ttulos.
El ttulo medio y el rango de ttulos ( una dilucin a cada lado de la
media) determinados para este nmero de lote han sido establecidos en
nuestro laboratorio, y se consideran la norma. Este control se facilita
para que cada laboratorio pueda evaluar la reproductibilidad (precisin)
de sus anlisis de ANA. Como quiera que este control no ha sido
diseado como indicador de la exactitud de la titulacin, cada
laboratorio deber establecer su propio criterio de valoracin del ttulo
medio para cada muestra, utilizando esta informacin para evaluar la
reproductibilidad (precisin) de unos ciclos a otros.
Mediante la reiterada evaluacin de este control titulable utilizando el
sistema de anlisis de ANA por inmunofluorescencia de Immuno
Concepts, se ha establecido un ttulo medio para cada nmero de lote. El
nmero de lote, el ttulo medio y el rango de ttulos ( una dilucin
doble a cada lado de la media) figuran en la etiqueta del vial y deben
servir como gua para el funcionamiento del sistema de anlisis.
Es importante no confundir la intensidad de la fluorescencia con la
presencia o ausencia de anticuerpos antinucleares.
La clave para determinar si una dilucin de suero es positiva radica en la
aparicin de un patrn claramente discernible, sea cual sea la intensidad
de la tincin fluorescente.
Este control titulable mostrar el tpico patrn moteado que se asocia al
anticuerpo RNP. Tambin puede aparecer un segundo patrn de NSp I
(varias manchas aisladas en el ncleo de las clulas que se encuentran
en la interfase); pero el patrn que se emplear como criterio de
valoracin ser el tpico moteado correspondiente a RNP.
Puede que los valores obtenidos en nuestro laboratorio difieran de los
suyos. He aqu algunos de los muchos factores que pueden afectar a sus
resultados:
1. El tipo de luz utilizada. Las fuentes de luz de mercurio producen
una energa de excitacin a 495 nm mayor que las de
cuarzo/halgenas. Las fuentes de luz de mercurio de 50, 100 y 200
vatios difieren poco en la energa de excitacin a 495 nm. Las
fuentes de luz de cuarzo/halgenas de 100 vatios producen una

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energa de excitacin a 495 nm superior a la proporcionada por las

de cuarzo/halgenas de 50 vatios.
El estado de la fuente de luz y su edad. Esto es especialmente
cierto para las fuentes de luz de mercurio, que suelen
experimentar una reduccin gradual de la energa de excitacin a
495 nm antes de agotarse. Esta gradual reduccin de la energa de
excitacin puede producir una prdida significativa de la
sensibilidad en un plazo de semanas. El problema se puede evitar
con un registro cronolgico. Para que los resultados sean ptimos,
cambie las bombillas de mercurio de 500 vatios cada 100 horas, y
las de 100 200 vatios cada 200 horas. Por lo general, las fuentes
de luz de cuarzo/halgenas no experimentan una reduccin
gradual de la energa de excitacin antes de agotarse.
El tipo de filtro excitador utilizado. Los filtros excitadores por
interferencia proporcionan mayor sensibilidad en una longitud de
onda mucho menor que los filtros excitadores por absorcin. Si
desea ms informacin, consulte el manual de su microscopio de
fluorescencia, o con su delegado de ventas.
Correcta alineacin del haz de luz del microscopio. Consulte las
instrucciones del manual del microscopio de fluorescencia.
La apertura numrica del objetivo. Si se emplea fluorescencia por
luz incidente (Epi), la fluorescencia aumenta exponencialmente
con la apertura numrica (NA) del objetivo. As, puede que un
objetivo de 40X con una NA de 0,65 interprete una o ms
diluciones como inferiores a las determinadas con un objetivo de
40X con una NA de 0,85. La apertura numrica va impresa a un
lado del objetivo. La NA no afecta a la sensibilidad del
microcosopio de luz fluorescente transmitida.
Filtros de supresin. Los filtros de supresin reducen longitudes de
onda de excitacin concretas, y se pueden utilizar para reducir la
sensibilidad. Si desea ms informacin, consulte el manual de su
microscopio de fluorescencia, o con su delegado de ventas.
Precisin y exactitud de la tcnica de dilucin, del equipo y de la
realizacin de los procedimientos de anlisis.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL PACIENTE

Se recomienda un aumento total de 200X para la deteccin selectiva de
positivos y negativos, y de 400X para el reconocimiento de patrones y la
visualizacin de clulas mitticas.
Negativos: Se considera que un suero es negativo para la
presencia de anticuerpos antinucleares si la tincin es igual o
inferior a la del pocillo de control negativo, sin patrn claramente
discernible. Puede que el citoplasma muestre una tincin dbil,

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ms brillante en la regin no cromosmica de las clulas mitticas,

pero sin patrn nuclear claramente discernible.
Positivos: Se considera que un suero es positivo si el ncleo
muestra un patrn de tincin claramente discernible en una
mayora de las clulas que se encuentran en la interfase.
SSA/Ro: Se considera que un suero es positivo para los anticuerpos
SSA/Ro si el 10-20% de los ncleos en interfase muestra el patrn
de tincin distintivo de SSA/Ro, que aparece como un patrn
moteado brillante distintivo con una llamativa tincin de los
nuclolos. Son clulas transfectadas que expresan el antgeno en
exceso. El restante 80-90% de los ncleos en interfase puede
presentar una fina tincin moteada del ncleo, con o sin tincin
fluorescente de los nuclolos.
Ttulos: Para interpretar los ttulos, muchos laboratorio empiezan
por el pocillo que contiene la muestra ms diluida, y van
retrocediendo hasta la dilucin 1:40. El primer pocillo en el que
se aprecia un patrn discernible corresponde al ttulo que se
considera como criterio de valoracin. Recomendamos utilizar esta
tcnica para determinar los criterios de valoracin de los ttulos. Es
importante no confundir la intensidad de la tincin con la
presencia o ausencia de anticuerpos antinucleares. La clave para
determinar si una determinada dilucin de suero es positiva radica
en la aparicin de un patrn claramente discernible, sea cual sea
la intensidad de la tincin. Debido al aumento de la concentracin
del antgeno SSA/Ro en las clulas que lo expresan en exceso, no
es raro ver que estas clulas se tien con ttulos muy elevados. Se
desconoce la importancia clnica de estos ttulos elevados.
PRECAUCIN: Algunos sueros pueden presentar tincin en ncleos y
citoplasmas sin patrn nuclear evidente. Este fenmeno suele deberse a
los anticuerpos heterfilos, y se considerar resultado negativo.

INTENSIDAD DE LA
FLUORESCENCIA
Es posible semicuantificar la intensidad de la fluorescencia con arreglo a
las directrices sobre reactivos con anticuerpos fluorescentes
establecidas por los Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,
Georgia (CDC).
4+ Verde manzana brillante (fluorescencia mxima): perfil celular
claramente definido; centro celular claramente definido.
3+ Fluorescencia de color verde manzana menos brillante: perfil
celular claramente definido; centro celular claramente definido.

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 2+ Patrn celular definido, pero fluorescencia tenue: perfil celular

menos definido.
1+ Fluorescencia muy leve: perfil celular prcticamente
indistinguible del centro celular en la mayor parte de los casos.
Immuno Concepts, N.A. Ltd. facilita un portaobjetos estndar para la
determinacin de la intensidad de la fluorescencia, FITC QC Slide,
nmero de catlogo 1900.

NOTIFICACIN DE LOS
RESULTADOS
Seleccin: Los resultados deben ser notificados como muy
positivos o positivos en la dilucin 1:40; y hay que informar del
patrn de tincin del ncleo.
Titulacin: El resultado que se notifica es el de la ltima dilucin en
la que se observa una tincin claramente discernible. Si el
resultado se observa con la dilucin 1:2560, se notificar como
superior a 1:2560. Los ttulos de 1:40 a 1:80 se consideran bajos;
de 1:160 a 1:320, medios; y de 1:640 en adelante, elevados.
DETECCIN DEL PATRN
Homogneo: Tincin slida del ncleo, con o sin enmascaramiento
evidente de los nuclolos. La regin cromosmica de las clulas
mitticas en metafase es claramente positiva, con una intensidad
de la tincin suave o perifrica superior o igual a la de los ncleos
en interfase.
Sinnimos: Difuso; slido.
Antgenos nucleares: ADNbc; ADNn; DNP; histona.
Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados sugieren LES.
Los ttulos bajos sugieren LES u otras enfermedades del tejido
conjuntivo.
Perifrico: Tincin slida, sobre todo alrededor de la regin externa
del ncleo, con tincin ms dbil del centro de ste. La regin
cromosmica de las clulas mitticas en metafase es claramente
positiva, con una intensidad de la tincin suave o perifrica
superior o igual a la de los ncleos en interfase.
Sinnimos: Borde, spero, membranoso.
Antgenos nucleares: ADNbc, ADNmc, ADNn, DNP, histona.

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Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados sugieren LES;

los ttulos bajos sugieren LES u otras enfermedades del tejido
conjuntivo.
Moteado: Tincin granular spera o fina del ncleo, generalmente
sin tincin fluorescente de los nuclolos. La regin no
cromosmica de las clulas mitticas en metafase se tie,
mientras que la regin cromosmica no lo hace.
Antgenos nucleares: Sm; RNP; Scl-70; SSA/Ro; SSB/La; y otros
sistemas de antgenos/anticuerpos an no caracterizados.
Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados sugieren LES
(antgeno Sm), enfermedades mixtas del tejido conjuntivo
(antgeno RNP), esclerodermia (antgeno Scl-70) o sndrome de
Sjgren-complejo seco (antgeno SSA/Ro o SSB/La). Los ttulos
bajos sugieren otras enfermedades del tejido conjuntivo.
Nucleolar: Tincin moteada grosera de grandes dimensiones,
generalmente menos de 6 manchas por clula, con o sin manchas
finas ocasionales, entre 5 y 10. La regin no cromosmica de las
clulas mitticas en metafase se tie mucho, mientras que la
regin cromosmica lo hace dbilmente. Las clulas en anafase y
en telofase pueden teirse de forma similar a como lo hacen los
ncleos en interfase.
Antgenos nucleares: Se suelen denominar ARN 4-6s, y otros
antgenos nucleares como fibrilarina, polimerasa I de ARN, NOR
90 y PM/Scl.
Asociacin a enfermedades: Los ttulos elevados prevalecen en
la esclerodermia y el sndrome de Sjgren.
Centrmero: Un patrn de tincin discretamente moteado es muy
sugerente de la variante de la esclerosis sistmica progresiva que
se conoce como sndrome CREST. Las manchas nucleares son
muy discretas y su nmero suele ser mltiplo de 46
(habitualmente 23-46 manchas por ncleo). Dado que los
centrmeros son constricciones en las que la fibras fusiformes se
unen a los cromosomas, las clulas mitticas mostrarn la misma
reaccin de moteado en la regin cromosmica.
Sinnimos: ACA; moteado discreto.
Antgenos nucleares: Centrmero cromosmico (cinetocoro).
Asociacin a enfermedades: Muy sugerentes de la variante de
la esclerosis sistmica progresiva que se conoce como sndrome
CREST. CREST es una forma de ESP con calcinosis importante,
fenmeno de Raynaud, disfuncin esofgica, esclerodactilia y
telangiectasias.
SSA/Ro: Patrn moteado brillante evidente con tincin destacada
de los nuclolos en el 10-20% de los ncleos en interfase. Son
clulas transfectadas que expresan el antgeno en exceso. El
restante 80-90% de los ncleos en interfase puede presentar una

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fina tincin moteada del ncleo, con o sin tincin fluorescente de

los nuclolos. La regin no cromosmica de las clulas mitticas
en metafase se tie, mientras que la regin cromosmica no lo
hace.
Antgenos nucleares: SSA/Ro (60kD).
Asociacin a enfermedades: Se observa en el 60-70% de los pacientes
con sndrome de Sjgren primario, en el 30-40% de los pacientes con
LES y en ms del 95% con lupus cutneo subagudo.

PATRONES BSICOS DE
TINCIN
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CLULAS MITTICAS
DETECCIN

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Las clulas mitticas deben ser visibles en todos los campos con una
ampliacin de 200X o inferior. Para comprobar si una clula se encuentra
en mitosis debe utilizarse la ampliacin de 400X. Las clulas mitticas
muestran una forma redondeada caracterstica, sin membrana nuclear
detectable. Por lo general, la regin cromosmica de las clulas
mitticas muestra una forma irregular en el seno de la clula debido a la
ausencia de membrana nuclear, y una extrema constriccin de los
cromosomas.
Los sueros positivos para ADN y/o DNP y/o histona (como el control
positivo homogneo de Immuno Concepts) presentarn una tincin
brillante de la regin cromosmica de estas clulas. En las muestras
negativas para ADN y/o DNP y/o histona (como el control positivo
homogneo de Immuno Concepts), los cromosomas de las clulas
mitticas no se teirn y ser difcil verlos.

USO DE CLULAS MITTICAS

Distincin entre anticuerpos moteados y homogneos: En
ocasiones es difcil distinguir un patrn de tincin moteado fino de
otro homogneo. Si el patrn es homogneo, habr una tincin
slida de los cromosomas de las clulas mitticas. Si el patrn es
estrictamente moteado, la regin situada fuera de los cromosomas
presentar una reaccin de moteado fino.
NOTA: Si se presenta un moteado fino de toda la clula mittica junto
con la tincin slida de la regin cromosmica, es muy probable que
haya dos o ms anticuerpos. Designe la dilucin de seleccin como
moteada/homognea, y titule cada anticuerpo hasta el criterio de
valoracin.
Anticuerpo perifrico frente a anticuerpo contra la membrana
nuclear: En general, los anticuerpos que muestran un patrn
perifrico se asocian a antgenos nucleares de ADN/DNP. Los ttulos

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elevados de estos anticuerpos sugieren LES. En sustratos que no

incluyen clulas mitticas puede ser difcil distinguir el patrn
perifrico del de los anticuerpos contra la membrana nuclear. Con
las clulas mitticas de Immuno Concepts es posible distinguir
estos patrones, pues la regin cromosmica de las clulas
mitticas se teir intensamente con un patrn perifrico, pero no
ser teida por el anticuerpo contra la membrana nuclear. Esta
distincin es importante desde el punto de vista clnico, pues los
anticuerpos contra la membrana nuclear carecen de especificidad
ADN/DNP y no se asocian al LES.
Anticuerpo anticentrmero (ACA) frente a centrmero atpico con
aspecto de anticuerpo moteado: Para verificar la presencia de
ACA, la regin cromosmica de las clulas mitticas debe teirse
brillantemente con manchas discretas. Si la regin cromosmica
no se tie, el anticuerpo no es ACA y debe designarse como
moteado atpico.
SSA/Ro frente a patrones que se pueden parecer a la tincin por
SSA/Ro: La tincin distintiva de SSA/Ro adopta un patrn moteado
brillante y delimitado con tincin destacada de los nuclolos en el
10-20% de los ncleos en interfase. El restante 80-90% de los
ncleos en interfase puede presentar una fina tincin moteada del
ncleo, con o sin tincin fluorescente de los nuclolos. La regin
cromosmica de las clulas mitticas en metafase no se tie. El
patrn nucleolar se distingue por la tincin moteada grosera y
grande de todos los ncleos, por lo general menos de 6 por clula.
El patrn de Scl-70 corresponde a una tincin moteada fina y una
tincin nucleolar de todos los ncleos en interfase, y la tincin de
la regin cromosmica de las clulas mitticas en metafase. Los
anticuerpos contra el antgeno nuclear de clulas en proliferacin
(PCNA) muestra un moteado variable grosero y fino en el 30-50%
de los ncleos en interfase.

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FLUORESCENCIA
CITOPLSMICA
Aunque los anticuerpos contra antgenos citoplsmicos no suelen
asociarse a enfermedades del tejido conjuntivo, se pueden detectar con
sustratos de cultivos de clulas epiteliales (40). Los anticuerpos que se
detectan con ms frecuencia son los dirigidos contra las mitocondrias y
el msculo liso; suelen asociarse a la mononucleosis, la hepatitis activa
crnica y las hepatopatas. Con el sustrato de clulas HEp-2 tambin se
han demostrado anticuerpos contra el msculo liso en pacientes con
verrugas.
Anticuerpos anti-mitocondriales (AMA): Manchas discretas,
concentradas en la regin perinuclear de la clula y que se
extienden, con menor intensidad, a las regiones exteriores del
citoplasma. Hay que distinguirlo de los anticuerpos anti-Golgi, que
suelen teir slo un lado de la regin perinuclear, y de los
anticuerpos anti-ribosomas, que muestran manchas ms finas con
aspecto filamentoso compatible con la localizacin del retculo
endoplsmico en el interior de la clula.
NOTA: La forma ms fcil de distinguir las manchas perinucleares de la
tincin perifrica del ncleo consiste en observar que las manchas
mitocondriales forman una tincin moteada discontinua en torno al
exterior de la membrana nuclear, mientras que en los sueros perifricos
se forma una tincin lisa slida en el interior de dicha membrana.

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DESIGNE LOS SUEROS COMO NEGATIVOS PARA

ANTINUCLEARES, Y VERIFIQUE LA PRESENCIA DE
ANTIMITOCONDRIALES
EN
EL
SUSTRATO
CORRESPONDIENTE.

ANTICUERPOS
ANTICUERPOS
ESPECFICO

Anticuerpos anti-msculo liso (ASMA): Tincin fibrosa muy fina en

todo el citoplasma, con aspecto de tela de araa. Al contrario que
los anticuerpos antimitocondriales, la tincin de los anticuerpos
anti-msculo liso es uniforme en todo el citoplasma, y puede llegar
al ncleo. Por lo general, las clulas mitticas muestran grandes
manchas discretas en el exterior de la regin cromosmica. Se ha
demostrado que los anticuerpos anti-msculo liso son muy
especficos de la actina.
DESIGNE LOS SUEROS COMO NEGATIVOS PARA ANTICUERPOS
ANTINUCLEARES, Y VERIFIQUE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTIMSCULO LISO EN EL SUSTRATO ESPECFICO CORRESPONDIENTE.

LIMITACIONES DEL ANLISIS

1. No es posible hacer un diagnstico basndose slo en la deteccin
de anticuerpos antinucleares. El mdico debe interpretar estos
resultados en el contexto de la historia y los sntomas del
paciente, los hallazgos fsicos y otros procedimientos diagnsticos.
2. No se debe iniciar un tratamiento basndose exclusivamente en
un resultado positivo del anlisis de anticuerpos antinucleares.
Antes de iniciar un tratamiento hay que tener en cuenta las
indicaciones clnicas, otros hallazgos de laboratorio y la impresin
clnica del mdico.
3. Determinados frmacos, como procainamida e hidralazina, pueden
inducir un trastorno similar al lupus eritematoso. Los pacientes con
LE inducido por frmacos pueden dar positivo para los ANA
homogneos u homogneos/perifricos que suelen ir dirigidos
contra las histonas nucleares.
4. Un pequeo porcentaje de pacientes con LES puede no presentar
ANA en el anlisis por inmunofluorescencia indirecta, pero s
empleando otras tcnicas.
5. Aunque una titulacin elevada de ANA puede ser muy sugerente
de enfermedad del tejido conjuntivo, no debe considerarse
diagnstica, sino parte de la historia clnica general de un
paciente.
6. A menudo, los patrones de tincin cambian con la progresiva
titulacin de los sueros. Este fenmeno suele deberse a la
presencia de ms de un anticuerpo antinuclear.
7. Como quiera que existen muchas opciones en los microscopios de
fluorescencia, se recomienda estandarizar las fuentes de luz, los
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filtros y los medios pticos para comparar los ttulos de los

pacientes obtenidos en diferentes laboratorios.
8. Tambin se observan ANA en un pequeo porcentaje de pacientes
con enfermedades infecciosas y/o neoplsicas.
9. Los autoanticuerpos contra SSA/Ro pueden mostrar un patrn de
tincin distintivo en las clulas transfectadas. Si se observa este
patrn, el mismo se considera como prueba confirmadora de la
presencia de anticuerpos contra el SSA/Ro. La ausencia de este
patrn distintivo no descarta la posible presencia de anticuerpos
contra el SSA/Ro.
10.
Debido al exceso de expresin del autoantgeno SSA/Ro en
las clulas HEp-2000, las muestras que contienen anticuerpos
anti-SSA/Ro muestran ttulos superiores en estas clulas que los
que se obtienen en las clulas HEp-2 no transfectadas. Como
quiera que ninguno de los dems autoantgenos de las clulas
HEp-2000 se ve afectado por el proceso de transfeccin, los
sueros con otras especificidades de autoanticuerpos no muestran
diferencias significativas en los ttulos entre la lnea de clulas
HEp-2000 y las clulas HEp-2 no transfectadas.

VALORES ESPERADOS
En un gran centro mdico universitario se obtuvieron los siguientes
datos en un perodo de 2 aos, utilizando el sustrato de clulas HEp-2
para ANA.

Abreviaturas: S=Moteado, H=Homogneo, P=Perifrico, N=Nucleolar,

ACA=anti-Centrmero

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CARACTERSTICAS DEL
RENDIMIENTO
MUESTRAS NORMALES
Se evaluaron sueros de 500 donantes de sangre sanos, 242 mujeres y
258 varones, ninguno de los cuales presentaba antecedentes de
enfermedades reumticas, en paralelo con clulas HEp-2 no
transfectadas comercializadas y el sistema de anlisis de ANA-Ro HEp2000 Colorzyme. En esta poblacin, 36 muestras (7,2 %) dieron
positivo en el anlisis de anticuerpos antinucleares con una dilucin
srica de 1:40. Los patrones de tincin fueron idnticos con los dos
sustratos en 34 de las 36 muestras que dieron positivo. Las dos
muestras que ofrecieron diferencias correspondieron a mujeres, y en
ambas se confirm que contenan anticuerpos anti-SSA/Ro. Una de estas
muestras mostr una dbil reaccin moteada fina en las clulas HEp-2
no transfectadas y la tpica tincin SSA/Ro en el sistema de anlisis de
ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000 Colorzyme. La otra
muestra dio negativo en las clulas HEp-2 no transfectadas, pero mostr
la tpica tincin SSA/Ro en el sistema de anlisis de ANA-Ro por
inmunoflurescencia HEp-2000. La especificidad de estas dos muestras
por el SSA/Ro fue confirmada por ELISA e inmunotransferencia de
Western. Las muestras que dieron negativo en las pruebas de ANA
tambin lo dieron en las de ELISA.

SUEROS DE PACIENTES CON ANTICUERPOS SSA/Ro EXCLUSIVAMENTE

Se evaluaron sueros de 46 pacientes con LES o sndrome de Sjgren con
clulas HEp-2 no transfectadas comercializadas y el sistema de anlisis
de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000. Mediante ELISA e
inmunotransferencia de Western se confirm que todos los sueros
contenan anticuerpos contra el autoantgeno SSA/Ro. No se detectaron
otros autoanticuerpos en ninguna de estas muestras. Treinta y seis de
estas muestras (78%) fueron positivas (patrn moteado) con las clulas
HEp-2 no transfectadas, y las 46 (100%) fueron positivas (patrn de
tincin distintivo de SSA/Ro) con el sistema de anlisis de ANA-Ro por
inmunofluorescencia HEp-2000.

SUEROS DE PACIENTES CON AUTOANTICUERPOS DISTINTOS DE SSA/Ro

Se evaluaron sueros de 230 pacientes con diversas enfermedades
(reumticas y no reumticas) en paralelo con clulas HEp-2 no
transfectadas comercializadas y el sistema de anlisis de ANA-Ro por

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inmunofluorescencia HEp-2000. Se observ un patrn de tincin

aislado en 120 muestras, y patrones mixtos en 110 muestras. En la
poblacin total de 230 muestras, 333 patrones de tincin fueron
idnticos en los dos sustratos. Veintinueve muestras presentaron el
patrn de tincin distintivo de SSA/Ro en el sistema de anlisis de
ANA-Ro HEp-2000. Veintitrs de estas muestras mostraron patrones
moteados en las clulas HEp-2 no transfectadas. Las seis muestras
discrepantes (positivas en HEp-2000, pero negativas en clulas HEp-2
no transfectadas) tenan anticuerpos contra SSA/Ro, como se demostr
mediante el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro, pruebas ELISA y
confirmacin por inmunotransferencia de Western.

COMPARACIONES DE LOS TTULOS

Debido al exceso de expresin del autoantgeno SSA/Ro en las clulas
HEp-2000, las muestras que contienen anticuerpos anti-SSA/Ro
muestran ttulos superiores en estas clulas que los que se obtienen en
las clulas HEp-2 no transfectadas. Como quiera que ninguno de los
dems autoantgenos de las clulas HEp-2000 se ve afectado por el
proceso de transfeccin, los sueros con otras especificidades de
autoanticuerpos no muestran diferencias significativas en los ttulos
entre la lnea de clulas HEp-2000 y las clulas HEp-2 no
transfectadas.
REPRODUCTIBILIDAD DE LOS TTULOS
Diez muestras elegidas entre los controles de los CDC y otros sueros
locales bien caracterizados, fueron sometidas a tres nmeros de lote
diferentes de portaobjetos HEp-2000, en tres ocasiones diferentes. No
se dio ningn caso de que una muestra negativa diera resultados
positivos. Todos los ttulos fueron inferiores al doble de dilucin del ttulo
medio establecido para todas las muestras evaluadas.

CONFIRMACIN DE ANTICUERPOS SSA/Ro

En un gran laboratorio de reumatologa de referencia, se analizaron con
el sistema de anlisis de ANA-Ro por inmunofluorescencia HEp-2000
muestras de suero de 349 pacientes que haban dado positivo en la
deteccin de ANA. En esta poblacin seleccionada, 239 muestras
presentaron el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro. Se obtuvieron
resultados ELISA positivos para anticuerpos SSA/Ro en 238 (99,6%) de
estas muestras. Otras 79 muestras presentaron intensos patrones
moteados y/o homogneos, y dieron positivo en las pruebas ELISA para
anticuerpos SSA/Ro. Por consiguiente, si se observa el patrn distintivo
de SSA/Ro, el mismo confirma la presencia de anticuerpos SSA/Ro, pero

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la ausencia de dicho patrn no descarta la presencia de esos

anticuerpos. En los estudios que hemos descrito, hemos examinado un
total de 429 sueros que contenan anticuerpos SSA/Ro confirmado por
ELISA y/o inmunotransferencia de Western, y que presentaron el patrn
de tincin distintivo de SSA/Ro en la lnea de clulas HEp-2000
transfectadas. Tambin hemos visto muestras que contienen anticuerpos
SSA/Ro pero no que muestren el patrn de tincin distintivo de SSA/Ro,
porque los elevados niveles de otros autoanticuerpos (habitualmente
anticuerpos anti-ADN o anti-Sm/RNP) enmascaran el patrn SSA/Ro. Por
consiguiente, si se observa el patrn distintivo de SSA/Ro, el mismo
confirma la presencia de anticuerpos SSA/Ro, pero la ausencia de dicho
patrn no descarta la presencia de esos anticuerpos.

ANEXOS

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