FLOURESCENCIA

FOSFORECENCIA

La fluorescencia es la propiedad de una

sustancia para emitir luz cuando son expuestas a
radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catdicos
o rayos X

La Fosforescencia es el fenmeno en el cual

ciertas sustancias tienen la propiedad de
absorber energa y almacenarla, para
emitirla posteriormente en forma de luz.

El proceso de fluorescencia tarda slo unas .Un material fosforescente puede durar
milsimas de segundo emitiendo luz.
emitiendo luz durante varios minutos.
En el proceso, una molcula absorbe un fotn de
alta energa, el cual es emitido como un fotn de
baja energa (mayor longitud de onda). La
diferencia de energa entre la absorcin y la
emisin, es disipada como calor (vibraciones
moleculares). Todo el proceso es muy corto
(millonsimas de segundo) y este tiempo es la
principal diferencia con otro conocido fenmeno
luminoso,
Son materiales semiconductores que producen
luz visible como resultado de su activacin con
luz UV. El efecto cesa tan pronto como
desaparece la fuente de excitacin. Los
pigmentos fluorescentes a la luz del da son
blancos o de color claro mientras que cuando
estn expuestos a radiacin UV irradian un
intenso color fluorescente

El mecanismo fsico que rige este

comportamiento es el mismo que para la
fluorescencia, no obstante la principal
diferencia con sta es que hay un retraso
temporal entre la absorcin y la reemisin
de los fotones de energa.

Materiales semiconductores que convierten

la energa absorbida en luz emitida slo
detectable en la oscuridad, despus de que
la fuente de excitacin ha sido eliminada.
Esta emisin de luz puede durar desde
minutos hasta horas. La fuente de excitacin
ms efectiva es la radiacin UV.

ALGUNOS MATERIALES FLUORESCENTES

Minerales: fluorita (algunas variedades), calcita (algunas variedades), uranio, etc

Materiales de uso diario: papel blanco, azulete, camisetas blancas, octavillas de
anuncios, etc.
Mtodos de clasificacin: rayas en sobres, etc.
Billetes de banco
Materiales orgnicos: hongos en la piel, clorofila, fluoresceina, etc.
Bebidas: Tnica (quinina), etc.

ALGUNOS MATERIALES FOSFORESCENTES

Minerales: calcita y aragonito (algunas variedades), etc.

Instrumentos de sealizacin nocturna: bandas, pintura, etc.
Materiales de regalo: pegatinas, estrellas, etc.

ANLISIS DE PPTIDOS

RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR:

La Resonancia magntica nuclear (RMN) constituye una tcnica de vital importancia en
la investigacin cientfica. La RMN es, junto con la difraccin de rayos X, la nica
metodologa que puede usarse para determinar la estructura molecular de
macromolculas con alta resolucin. Frente a la difraccin de rayos X, no obstante, la
RMN presenta varias ventajas:

Permite determinar la estructura molecular en solucin.

La RMN permite, adems, estudiar de manera eficaz y sencilla las interacciones

entre biomolculas.
Tambin es la nica metodologa que permite el estudio de la dinmica de
macromolculas con resolucin atmica en varias escalas de tiempos.

La produccin de cada protena es distinta, y cada una requiere la seleccin de los

distintos sistemas de expresin (vectores) y de las distintas tcnicas de purificacin
(intercambio inico, cromatografa de afinidad, etc.)
PREPARACIN DE MUESTRAS:
Una vez que se consigue la produccin y la purificacin de la muestra, es necesario
evaluar las condiciones en las cuales se llevarn a cabo los experimentos
(amortiguadores). Es preciso seleccionar condiciones que preserven la estructura
correcta y la estabilidad de la muestra por el mayor tiempo posible y que permitan, al
mismo tiempo, obtener la mayor seal posible. Algunas protenas requieren elevadas
concentraciones de iones para mantenerse estables en altas concentraciones. Sin
embargo, el uso de estas altas concentraciones de sal y amortiguadores con alta
conductividad degrada la relacin seal-ruido en la RMN.

Estructura

protenas:

de

las

Las protenas se presentan comnmente como estructura secundaria, la cual las formas
ms comunes de ella son la doble hlice y la hoja plegada. Otro elemento importante de
estructura secundaria es el bucle (-turn), ya que le permite a la cadena cambiar de
direccin:

La

estructura terciaria es como todo se acomoda (o

no) en solucin, o como los distintos elementos de estructura secundaria se organizan
espacialmente entre ellos. Lo primero que tenemos que saber es donde aparecen los
picos de los 1Hs de los aminocidos en el espectro:

Como dijimos antes, no hay conexin entre los distintos AAs: No podemos determinar
cul es cual. Para poder determinar la estructura de una protena por RMN necesitamos
saber la estructura primaria de la protena.

5. ANLISIS Y SECUENCIACIN
ESPECTROMETRA DE MASAS

DE

PPTIDOS

MEDIANTE

Se utilizar un espectrmetro de masas de ltima generacin (cuadrupolo de trampa

inica), cuyas principales caractersticas son las de poder realizar espectros de masas en
un rango pequeo a muy alta resolucin (modo Zoomscan) y fragmentacin sucesiva de
especies inicas determinadas presentes en mezclas complejas (modo MS n ). La sonda
electrospray ha sido modificada en nuestro laboratorio para permitir realizar
nanoelectrospray, que permite un anlisis muy exhaustivo de cantidades muy pequeas
de muestra (1 ul) durante tiempos muy largos (el flujo es de 20-40 nl/min).
El procedimiento a seguir es el siguiente:
Escoger las fracciones de HPLC que se quieran analizar [al contrario que para la
microsecuenciacin automtica, en este caso conviene escoger fracciones que sugieran
la presencia de especies mltiples, con objeto de obtener ms informacin de una misma
muestra]. Secar totalmente las fracciones elegidas en la centrfuga de vaco.
Resuspender la fraccin que se vaya a analizar en 5 ul de medio MHF (metanol/agua
50:50 (v/v) con 0.1% de cido frmico). Agitar fuertemente.
Coger lentamente 1 ul de la fraccin utilizando una P10 con una punta tipo gel loader
y a continuacin coger un poco de aire ajustando el volumen de la pipeta a 3-4 ul.
Introducir la punta en una de las sondas de vidrio de nanoelectrospray recubiertas de oro
y verter el contenido de la punta lo ms cerca posible del extremo recubierto de la
sonda. Centrifugar con un pulso en la micrfuga para que el lquido se site en el
extremo de la sonda.
Colocar la punta en el soporte porta sondas. Colocar el porta sondas en el soporte
posicionador x-y-z y conectar a la toma externa de presurizacin a una presin
alrededor de 1000 hPa (1 bar 15 psi). Acercar muy lentamente la punta de la sonda al
capilar, sin centrar en el orificio, y romper la punta. En cuanto empiece a salir lquido,
situar el extremo de la punta cerca del orificio del capilar, y conectar el voltaje del
espectrmetro de masas.
Identificar el in ms abundante y determinar su carga y su peso molecular
monoisotpico realizando un Zoomscan. Escoger un in de carga +2 +1, si es posible.
Fragmentar el in seleccionado aumentando gradualmente la energa de colisin hasta
que la intensidad del in original disminuya a un 30% aproximadamente.
Determinar manualmente la secuencia de aminocidos del pptido a partir del espectro
de fragmentacin calculando sucesivamente las diferencias entre picos contiguos y no
contiguos, o bien realizando una bsqueda automtica con el programa Pepsearch.
Determinacin de la carga y peso molecular monoisotpico de un in a partir del
espectro Zoomscan : Identificar las series de picos que corresponden a la envoltura

isotpica del in seleccionado. Identificar el primer pico de la serie (el de menor masa),
y tomar nota de su masa (m). Calcular la diferencia de masa existente entre los picos de
la serie: la inversa de este nmero es la carga del in (z) (0.5 corresponde a carga +2,
0.3 corresponde a carga +3, etc.). Calcular el peso molecular monoisotpico exacto del
pptido utilizando la frmula: M = mz - z.
Reglas fundamentales para la interpretacin de espectros de fragmentacin:
1.- Los iones se deshidratan (pierden 18 amu) o desaminan (pierden 17 amu) con mucha
facilidad.
2.- La prdida de 28 amu corresponde a una prdida neutra de CO e identifica al in
como perteneciente a la serie b.
3.- La masa de los iones de la serie y corresponde a MR i + 19, siendo MRila masa
incremental del aminocido i.
4.- La masa de los iones de la serie b corresponde a MR i+ 1.
5.- El peso molecular de un pptido corresponde a MR i + 18.