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TRABAJO DE GRADO
Requisito final para optar al titulo de tecnlogo qumico
Director:
JUAN PABLO ARRUBLA VLEZ
Presentado por:
JUAN PABLO LPEZ VALENCIA
Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez realizada
la versin escrita y presenciado la sustentacin oral, decidimos otorgar:
La nota de
Con la connotacin:
________________________________
_________________________________
Director:
Juan Pablo Arrubla Vlez
_________________________________
Jurado:
Firma:
_________________________________
Jurado:
Firma:
_________________________________
AGRADECIMIENTOS
CONTENIDO
NDICE DE TABLAS
NDICE DE FIGURAS
Pg.
8
9
RESUMEN
11
JUSTIFICACIN
12
OBJETIVOS
14
1. MARCO TERICO
15
1.1 ESTANDARIZACIN
15
16
1.1.2 Precisin
17
1.1.3 Exactitud
18
19
19
20
20
20
1.1.6 Sensibilidad
20
21
1.2.1 Ventajas
21
1.2.2 Limitaciones de la CG
22
23
24
24
24
25
25
25
26
26
26
28
28
29
1.3.3 In Molecular
29
30
30
30
32
32
32
33
2. SECCIN EXPERIMENTAL
35
35
35
2.3 EXTRACCIN
35
35
2.5 ESTNDAR
35
2.5.1 Patrones
37
37
2.6.1 Scan
37
40
40
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
41
3.1 SCAN
41
3.2 CALIBRACIN
46
53
57
3.5 INTERFERENCIAS
58
59
4. CONCLUSIONES
61
5. RECOMENDACIONES
63
BIBLIOGRAFA
64
ANEXOS
66
NDICE DE TABLAS
Pg.
Tabla No. 1: Composicin del estndar de mezcla de metilesteres marca
RESTEK cdigo 35078.
36
38
39
41
44
46
54
56
58
59
NDICE DE FIGURAS
Pg.
18
23
31
31
32
33
33
38
39
Figura No. 10: Cromatgrama total de iones del patrn de 500 ppm por el
mtodo IE.
41
42
43
Figura No. 13: Cromatgrama total de iones del patrn de 500 ppm por el
mtodo de IQ.
43
Figura No. 14: Espectro de masas del metil oleato obtenido por IQ.
45
45
Figura No. 16: Espectro de masas del metil undecanoato obtenido por IQ.
Figura No. 17: Curvas de calibracin de los compuestos identificados por IE
Figura No. 18: Curvas de calibracin de los compuestos identificados por
IQ.
Figura No. 19: Cromatgrama total de iones del aceite de crislida de
gusano de seda previamente esterificado.
10
46
47
50
57
RESUMEN
11
JUSTIFICACIN
13
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Estandarizar la tcnica cromatogrfica (gas-liquido), con columna capilar y
detector de espectrometra de masas para la identificacin y cuantificacin
de metilesteres de cidos grasos.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Obtener en forma experimental y para las condiciones del laboratorio los
valores de los parmetros: precisin, linealidad, lmite de deteccin y
cuantificacin, sensibilidad y correlacin lineal que sirvan como criterio de
confianza para que una vez montado el mtodo analtico pueda empezar a
reportar datos con adecuado y comprobable grado de confianza.
Fortalecer los trabajos de investigacin en el anlisis de subproductos
obtenidos de la industria sercola y obtener o complementar la informacin
existente en lo relacionado con: interferencias, tiempo y costos del
anlisis.
14
1. MARCO TERICO
1.1
ESTANDARIZACIN
Estandarizar un mtodo de anlisis consiste en verificar y documentar, que este
conduzca con un alto grado de seguridad, a la obtencin de resultados precisos y
exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente
establecidos [1].
La estandarizacin de un mtodo analtico es un proceso riguroso que
dependiendo de la tcnica analtica a la que pertenezca el mtodo, la matriz, el
analito, la cantidad de parmetros de la estandarizacin, y de la logstica
empleada para su desarrollo, puede requerir de un tiempo mas o menos
considerable (en algunos casos puede superar los seis meses) [9].
El anlisis se considera hoy en da un proceso mediante el cual obtenemos
informacin. Se realizan millones de anlisis cada da en el mundo en los mbitos
ms variados: anlisis de productos manufacturados, naturales, anlisis
medioambientales, clnicos, forenses, qumicos y fsicos. En todos ellos se
requiere una confianza en los resultados obtenidos. La estandarizacin de las
metodologas analticas, junto con otras actividades englobadas en la gran rea
del aseguramiento de la calidad permite conseguir calidad, otorgando la confianza
necesaria a la vez que confieren un grado elevado de comparabilidad entre los
resultados de los anlisis qumicos.
Desde la vertiente econmica, los costos asociados al proceso analtico suelen
ser elevados y surgen costos adicionales ligados a las decisiones que se toman
sobre la base de los resultados obtenidos. No se puede dar el lujo, por ejemplo, de
que se devuelvan un lote de producto expedido en funcin de unos resultados
analticos que errneamente expresaban conformidad a la normatividad vigente.
Una correcta estandarizacin del mtodo debera haber detectado la presencia de
error en los resultados emitidos.
Los requisitos analticos para un uso determinado establecen los parmetros o
criterios de calidad del mtodo a utilizar para resolver el problema. Estos criterios
de calidad, llamados performance characteristics o figures of merit en ingles,
pueden ser de tipo estadstico. En estos figuran los parmetros fundamentales de
exactitud (relacionados con la trazabilidad) y precisin (relacionados con la
incertidumbre) y los secundarios de selectividad, sensibilidad, limites de deteccin
y cuantificacin.
Muchos analistas consideran que un mtodo estndar o de referencia, que ha
sido estandarizado por algn organismo que posee una cierta reputacin, puede
aplicarse directamente el laboratorio. La estandarizacin de los mtodos ya
15
16
17
PRESICIN
Repetibilidad
Repetibilidad
instrumental
Precisin
Intermedia
Reproducibilidad
Repetibilidad del
mtodo
18
19
20
1.2
CROMATOGRAFA DE GASES (CG)
Es difcil imaginar un laboratorio de analtico orgnico sin un cromatgrafo de
gases. En muy poco tiempo la cromatografa de gases, se ha convertido en la
tcnica principal para la separacin y anlisis de compuestos voltiles. Ha sido
usada para analizar gases, lquidos y slidos (este ultimo usualmente se disuelven
en solventes voltiles). Tanto material orgnico como inorgnico pueden ser
analizados, y el peso molecular puede estar en un rango de 2 hasta 1.000 Daltons.
Los cromatgrafos de gases, son los instrumentos de anlisis mas usados en el
mundo. Las columnas capilares eficientes proporcionan alta resolucin, separando
ms de 450 componentes en el aroma del caf. Detectores sensibles como el
detector de ionizacin de llama el cual puede cuantificar hasta concentraciones de
50 ppb de componentes orgnicos con una desviacin estndar relativa de 5% [11].
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de
la muestra en dos fases. Una fase es el lecho estacionario de extensa superficie
empacada apretadamente dentro de una columna. Esta es la fase estacionaria y
puede ser un slido o una delgada pelcula lquida que recubre al slido. La otra
fase consiste en un gas o un lquido que percola sobre la fase estacionaria y
alrededor de la misma. Esta fase se denomina fase mvil [12]. En el caso de la
cromatografa de gases, la fase mvil es un gas inerte, su separacin se basa en
las diferencias en los puntos de ebullicin y la temperatura de la columna.
En la cromatografa de gases, la fase mvil se denomina gas transportador, ya
que es un gas inerte cuya finalidad es transportar las molculas de la muestra a
travs de la columna. Los adsorbentes, tales como carbn vegetal, gel de slice y
tamices moleculares, son las fases estacionarias en la CG de fase slida. Esta se
utiliza principalmente para la separacin de gases ligeros. Los lquidos orgnicos
de alto punto de ebullicin constituyen la fase estacionaria de la CG de fase
liquida. La fase lquida se extiende como una pelcula delgada sobre un slido
inerte llamado soporte slido. La base para la separacin es la particin de la
muestra dentro o fuera de esta pelcula lquida. Si se puede encontrar una fase
liquida que tenga solubilidad selectiva para dos compuestos, entonces estos dos
pueden separarse mediante cromatografa de gases. La CG de fase liquida es la
forma mas selectiva de la cromatografa y la que se presta a mayores usos [12].
En la cromatografa de gases se emplea el procedimiento de elusin; la muestra
se aade a la columna y el gas puro que acta de portador fluye continuamente.
Esta tcnica tiene la ventaja de que los picos de la muestra estn rodeados por un
gas transportador puro y cuando se concluye el anlisis, la columna queda lista
para otra muestra.
1.2.1 Ventajas.
Las principales ventajas de la cromatografa de gases son: alta resolucin,
velocidad, sensibilidad, sencillez y resultados cuantitativos.
Alta Resolucin: La CG puede generar miles de platos tericos en unos pocos
minutos. Los ismeros con puntos de ebullicin muy prximos que no pueden
21
22
23
24
25
26
M + e M + + 2e
Otros medios para lograr la ionizacin son la ionizacin qumica (IQ y, la
ionizacin qumica negativa (IQN). En IQ, un gas reactivo como el metano es
admitido a la cmara de iones donde es ionizado, produciendo un catin el cual
experimenta ms reacciones para producir iones secundarios.
CH 4 + e CH 4+ + 2e
CH 4+ + CH 4 CH 5+ + CH 3
( )
( )
( )
27
1.3
ESPECTROMETRIA DE MASAS MOLECULAR (EM)
De todas las herramientas analticas de que dispone un cientfico, la
espectrometra de masas es quizs la de mayor aplicacin, en el sentido de que
esta tcnica es capaz de proporcionar informacin acerca de: la composicin
elemental de las muestras; la estructura de las molculas inorgnicas, orgnicas y
biolgicas; de la composicin cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas y de
las relaciones isotpicas de tomos en las muestras [13].
Como muchas reacciones qumicas usadas para anlisis, el propsito bsico de la
espectrometra de masas es convertir la muestra en productos que son indicativos
de la molcula original. Los productos formados son bastante raros: iones
positivos gaseosos, cuya masa y abundancias relativas son mostrados en el
espectro de masa [14].
1.3.1 Impacto Electrnico (IE).
Para este mtodo de ionizacin, el reactivo que produce los productos inicos es
un haz de electrones enrgicos. Estos son calentados en un filamento
incandescente, y viajan a travs de la cmara de iones hasta un nodo (trampa de
iones) en el lado opuesto. El flujo de molculas vaporizadas de la muestra a una
28
R + e R + + 2e
R + + R RH +
RH + + M R + MH +
Esta reaccin es favorecida porque la afinidad de las molculas de la muestra es
mayor que la del reactivo [14].
1.3.3 Ion Molecular.
El in molecular, M + ; provee la mas importante informacin en el espectro de
masa. Desafortunadamente, para algunos tipos de compuestos el in molecular no
es lo suficientemente estable para ser encontrado con apreciable abundancia en el
espectro de IE. Para estos casos la espectrometra de masas proporciona la
tcnica de ionizacin qumica. Los siguientes son requerimientos necesarios pero
no suficientes para el in molecular en un espectro de masas: Debe ser el in con
mayor masa en el espectro; debe ser una especie radical, que contenga un
electrn desapareado; debe ser capaz de producir los iones importantes en la
regin de masas alta del espectro por prdidas de especies neutras lgicas [14].
29
30
Tanto el tomo de oxigeno del carbonilo como el oxigeno saturado de los esteres
pueden actuar como sitios para la reaccin inicial y dar paso a la reaccin
esperada del comportamiento separado de estas funciones, y, adems, nuevas
reacciones aparentemente debido a sus efectos combinados [14].
Los metilesteres que no contienen una funcin adicional muestran las reacciones
esperadas para el grupo carbonilo adicin (figura 3) y adicin con
reorganizacin del hidrogeno (gama) (figura 4). El in alquilo (M 59)+ y el in
CH3O+ son muy pequeos excepto metilesteres de bajo peso molecular. Adems
la descomposicin de la mitad de los alquilos produce los iones caractersticos
CnH2n+1+ y CnH2n-1+ [14].
C17H35
CO
m/z = 267
(C17H35+)
i
C17H35
CnH2n+1+, CnH2n-1+
m/z = 239
OCH3
i
m/z = 298
+OCH
3
m/z = 31
OCH3
m/z = 59
m/z = 224
C14H29
CH2
H
O
rH
C14H29
OCH3
OCH3
C14H29
H
O
+
OCH3
OCH3
m/z = 74
31
1.4
MTODOS DE EXTRACCIN
concentracion al
vacio del aceite
1.5
DERIVATIZACIN DE CIDOS GRASOS
La cromatografa de gases revolucion el estudio de los lpidos, haciendo posible
determinar la composicin completa de los cidos grasos de un lpido en muy
corto tiempo. Para este propsito, los cidos grasos son convertidos al derivado
mas simple voltil, usualmente metilster, aunque otros esteres pueden sen
preferidos para diferentes propsitos. La preparacin de tales esteres se ha vuelto
el tipo de reaccin mas comn entre los analistas de lpidos. Aunque los cidos
grasos pueden estar en la naturaleza en estado libre (no esterificado), en su
mayora se encuentran como steres unidos a glicerol, colesterol o alcoholes
alifticos de cadenas largas}; en los casos cuando los cidos grasos estn en
estado de esteres, se debe trans-esterificar el cido graso [16].
32
R1OH
OH
-H
OH2
(1)
R1
R
R1
(3)
(2)
R2OH
R
OR1
O
H
H
OR1
R1
R2O
H
(2)
(4)
O
R
-H
(6)
OR2
O
H
R2
(5)
33
Todos los cidos grasos son esterificados con aproximadamente la misma razn
de cloruro de hidrogeno y metanol, es improbable que hayan perdidas de cidos
grasos especficos durante el paso de la reaccin. En sntesis, el cloruro de
hidrogeno en metanol (o cualquier otro alcohol) puede ser usado para esterificar
cidos grasos libres o trans-esterificar cidos grasos unidos por enlace ster a
glicerol o colesterol. Probablemente puede ser el mejor reactivo disponible para
propsitos generales de esterificacin. La mayor desventaja es el largo tiempo del
reflujo para completar la reaccin [16].
El cido sulfrico en metanol H2SO4/MeOH como reactivo para la esterificacin,
en ocasiones se emplea concentraciones muy altas, una solucin del 1 al 2% tiene
casi propiedades idnticas al HCl/MeOH al 5%, y es muy sencillo de preparar. La
temperatura a la que se haga el reflujo y la concentracin del cido en la solucin
deben ser moderadas debido a que el H2SO4 es un fuerte oxidante; para cidos
libres poliinsaturados no se recomienda largo tiempo en el reflujo debido al poder
oxidativo del cido, se tienen reportes de reflujos a concentraciones altas ~20% y
temperaturas de 170 C con formaciones de productos coloreados y destruccin
de cidos polienoicos [16].
El cido de Lewis, trifloruro de boro, en la forma de su coordinacin compleja con
metanol es un poderoso catalizador cido para la esterificacin de cidos grasos.
En ocasiones la esterificacin de cidos grasos libres se complet en 2 minutos
con trifloruro de boro en metanol BF3/MeOH al 12 o 14% bajo reflujo. Este reactivo
tambin se puede usar como trans-esterificador la mayor clase de lpidos, aunque
se emplee ms tiempo que esterificando cidos libres. La reaccin se puede
acelerar con el uso de radiacin de baja frecuencia. Desafortunadamente, el
BF3/MeOH tiene una serie desventaja; se report que algunos metoxidos eran
producidos a partir de cidos grasos insaturados por la adicin de metanol por el
doble enlace cuando la concentraciones del BF3 son elevadas ~ 50%. El reactivo
tiene una vida til limitada a temperatura ambiente y debera permanecer
refrigerado. Ciertamente es muy popular, pero posiblemente porque es uno de los
pocos reactivos que se puede comprar a distribuidores comerciales. El tricloruro
de boro en metanol BCl3/MeOH puede ser usado de manera similar para preparar
metilesteres, aunque la reaccin es ms lenta que con el BF3 [16].
34
2.
SECCIN EXPERIMENTAL
2.1
MUESTRAS DE ANLISIS
Como muestra real se utiliz crislidas frescas del gusano de seda hibrido Pilamo
1, cultivado en la vereda de Santa Rosa, en el departamento del Valle del Cauca.
2.2
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Al llegar los capullos al laboratorio de la UTP se realiz el sacrificio con aire seco
caliente, con este procedimiento se secan tambin las crislidas las cuales deben
estar secas para la extraccin del aceite. Cortando los capullos se extraen las
crislidas, las cuales son secadas con aire caliente durante 5 das debido a su
cantidad.
2.3
EXTRACCIN
Se realizaron extracciones, segn procedimientos en estudios preliminares, por
medio de la tcnica soxhlet, con una relacin de crislida-hexano de 1:10, durante
4 horas. El resultado de la extraccin se llev a concentracin al vaco.
2.4
ESTERIFICACIN DE LA MUESTRA
La esterificacin del aceite se realiz utilizando una mezcla de H2SO4/MeOH al
2% (el procedimiento del libro no especifica la concentracin, se toma esta por
otras investigaciones), tanto el cido como el metanol deben ser anhidros, para
evitar desplazamientos en el equilibrio.
A 40-50 mg del extracto lipdico en un tubo con tapa rosca se agreg 1 mL de
benceno (se cambio por hexano por disponibilidad). Se adicion 2 mL de la
mezcla H2SO4/MeOH al 2% posteriormente de que la muestra se disolvi.
Despus de tapar el tubo con la tapa rosca, se llev a un bao Mara a 90 C
durante dos horas [17].
Despus de el tubo estar a temperatura ambiente, se adicion 0,5 mL de agua y
se mezcl. Se hicieron extracciones de la mezcla tres veces con porciones de 3
mL de pentano (se utiliz hexano grado cromatogrfico para eliminar interferencias
en el anlisis cromatogrfico de gases). Se combinaron los tres extractos de
hexano y reducir el volumen hasta del volumen inicial por calentamiento. Para el
anlisis en CG la muestra fue totalmente anhidra [17].
2.5
ESTNDAR
Se compr un estndar comercial de mezcla de metilesteres de cidos grasos
marca RESTEK, con cdigo de catalogo 35078 (en el anexo 1, se muestra el
certificado del estndar), el cual contiene la 28 metilesteres de cidos grasos. La
35
Metil butirato
PORCENTAJE
(% PESO)
1,5%
6:0
Metil hexanoato
1,5%
8:0
Metil octanoato
2,0%
10:0
Metil decanoato
2,5%
11:0
Metil undecanoato
2,5%
12:0
Metil laurato
5,0%
13:0
Metil tridecanoato
2,5%
14:0
Metil miristato
2,5%
14:1
1,5%
15:0
Metil pentadecanoato
1,5%
16:0
Metil palmitato
10,0%
16:1
5,0%
17:0
Metil heptadecanoato
2,5%
18:0
Metil estearato
5,0%
18:1
15,0%
18:1
2,5%
18:2
10,0%
18:2
2,5%
18:3
5,0%
20:0
Metil araquidato
2,5%
20:1
1,5%
22:0
Metil behenato
2,5%
22:1
1,5%
23:0
Metil tricosanoato
1,5%
24:0
Metil lignocerato
2,5%
20:5
2,5%
24:1
2,5%
COMPUESTO
22:6
Metil docosahexaenoato (cis-4,7,10,13,16,19)
2,5%
Tabla 1. Composicin del estndar de mezcla de metilesteres marca RESTEK
cdigo 35078.
36
Las condiciones en las que fue eluid el estndar para el certificado de anlisis
fueron las siguientes:
Columna Famewax (cat # 12498). 30 m, 0,32 mm, 0,25 m.
Gas transportador: hidrogeno con flujo de 40 cm seg
Programacin de la temperatura: 100 C por 4 minutos. Se lleva hasta 240 C
con una rata de 3 C min , se mantiene esta temperatura por 10 minutos
Temperatura del inyector: 200 C
Temperatura del detector: 250 C
Tipo de detector: DIL
2.5.1 Patrones.
A partir del estndar 35078 el cual esta a una concentracin de 30 mg mL , se
realizaron las respectivas diluciones para obtener varios patrones. Estos patrones
cubren concentraciones que van desde 2,5 hasta 500 ppm de la mezcla de
metilesteres.
2.6
ANLISIS CROMATOGRFICO
El anlisis cromatogrfico se realiz en un cromatgrafo de gases acoplado a
espectrometra de masas marca Shimadzu GC-MS QP-2010. Sistema equipado
con autoinyector AOC-20i, automuestreador AOC-20s, inyeccin Split-splitless,
modo de ionizacin EI/SCI/NCI y un sistema de insercin directa controlado por un
software GCMS solution. Con una columna de 30 m de largo, 0,25 mm DI, 0,25
m de partcula Rtx-CLPesticides Restek. Base de datos de espectros de masas
Wiley, 7 edicin, 2003.
2.6.1 Scan.
Se realiz un scan (anlisis total de iones) tanto por impacto electrnico (IE) como
por ionizacin qumica positiva (IQ), para el patrn de concentracin ms alta, el
cual era de 500 ppm de mezcla de metilesteres; con el objetivo de realizar la
identificacin de los compuestos que eluyeron, debido a que las condiciones del
cromatgrafo, columna y detector cambiaron con respecto a como fue analizado el
estndar para el certificado de anlisis.
Las condiciones para el scan por IE fueron las siguientes:
Temperatura del inyector: 250 C
Modo de inyeccin: Split
Volumen de inyeccin: 2 L
Razn de split: 4
Presin: 73,7 kPa
Flujo total: 6,0 mL min
Flujo en la columna: 1,0 mL min
Velocidad lineal del gas: 37,2 cm seg
37
teperatura (C)
10
20
30
40
tiem po (m in)
38
mL
Flujo total: 6,0 min
mL
Flujo en la columna: 1,0 min
Velocidad lineal del gas: 37,2 cm seg
Programacin de la temperatura del horno: se muestra en la tabla 3.
RAZN DE
TEMPERATURA
TIEMPO DE
CALENTAMIENTO
(C)
ESPERA (min.)
c
min
-100
2
7
300
5
Tabla 3. Programacin del horno para el mtodo de ionizacin qumica positiva
(IQ).
teperatura (C)
10
20
30
40
tiem po (m in)
39
40
3.
RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1
SCAN
La realizacin del scan del estndar tanto para el mtodo de IE como para IQ, se
hizo con el patrn de concentracin de 500 ppm.
Por el mtodo de impacto electrnico (IE), se identificaron 24 picos pertenecientes
al estndar, en la figura 10 se muestra el cromatgrama obtenido en el scan por
IE.
Figura 10. Cromatgrama total de iones del patrn de 500 ppm por el mtodo IE.
Los picos se identificaron por comparacin de sus espectros (anexo 2) con la
base de datos del espectrmetro de masas Wiley 7 edicin, 2003; y comparando
con la informacin del estndar. Los nombres de los picos que eluyeron se
muestran en la tabla 4.
N DE ID
TIEMPO DE
RETENCIN (s)
NOMBRE
m/z
REA
3,479
Metil hexanoato
74
669.223
6,529
Metil octanoato
74
1.810.605
10,345
Metil decanoato
74
2.740.213
12,228
Metil undecanoato
74
2.936.660
14,038
Metil laurato
74
6.160.043
15,765
Metil tridecanoato
74
2.942.963
17,223
Metil miristoleato
74
388.389
17,406
Metil miristato
74
3.148.515
18,970
Metil pentadecanoato
74
1.926.640
41
10
20,171
Metil palmitoleato
74
1.200.941
11
20,458
Metil palmitato
74
11.698.265
12
21,875
Metil heptadecanoato
74
2.920.370
13
22,832
Metil linolenato
81
3.025.677
14
22,919
Metil oleato
74
3.821.317
15
23,232
Metil estearato
74
5.210.291
16
25,060
Metil eicosapentanoato
79
544.735
17
25,480
Metil eicosanoato
69
301.629
18
25,772
Metil araquidato
74
2.286.912
19
27,296
Metil docosahexanoato
79
457.109
20
27,848
Metil erucato
69
309.515
21
28,109
Metil behenato
74
2.108.875
22
29,211
Metil tricosanoato
74
1.180.219
23
30,044
Metil nervonato
69
486.656
24
30,272
Metil lignocerato
74
1.821.811
Tabla 4. Compuestos identificados por el scan con mtodo IE.
En los espectros de masas por IE (anexo 2), se ven iones [M 31] + los cuales
son producidos por la perdida de CH3O del [M ] + (figura 3). Se puede ver en las
figura 11 el espectro de masas de metil estearato (18:0), con un peso molecular de
298 umas.
42
Figura 13. Cromatgrama total de iones del patrn de 500 ppm por el mtodo de
IQ.
Los nombres y el orden de elusin de los compuestos identificados por IQ, se
muestran en la tabla 5.
43
N DE ID
TIEMPO DE
RETENCIN
(s)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
3,461
6,508
10,321
12,205
14,015
15,741
17,200
17,382
18,945
20,147
20,434
21,849
22,808
22,895
23,207
25,451
25,745
28,080
29,181
30,014
30,242
NOMBRE
m/z
PESO
MOLECULAR
Metil hexanoato
131
Metil octanoato
159
Metil decanoato
187
Metil undecanoato
201
Metil laurato
215
Metil tridecanoato
229
Metil miristoleato
209
Metil miristato
243
Metil pentadecanoato 257
Metil palmitoleato
237
Metil palmitato
271
Metil heptadecanoato 285
Metil linolenato
263
Metil oleato
265
Metil estearato
299
Metil eicosanoato
293
Metil araquidato
327
Metil behenato
355
Metil tricosanoato
369
Metil nervonato
381
Metil lignocerato
383
Tabla 5. Compuestos identificados por IQ
130
158
186
200
214
228
240
242
256
268
270
284
292
296
298
324
326
354
368
380
382
REA
19.666
16.086
15.087
14.639
30.194
13.090
1.830
11.612
5.563
6.482
39.301
7.309
7.161
18.214
15.755
955
4.551
3.801
1.955
906
2.754
44
Figura 14. Espectro de masas del metil oleato obtenido por IQ.
En la figura 15, se muestra el esquema de fragmentacin por IQ de metilesteres
de cidos grasos.
H
CH5
H3CO
H3CO
[M+H]
O
-CH3OH
45
Figura 16. Espectro de masas del metil undecanoato obtenido por IQ.
Tanto el mtodo de ionizacin por impacto electrnico, como el de ionizacin
qumica, tienen sus pros y sus contras. Para IE, la sensibilidad es mayor, su
escala es de 18.000.000 mientras que para IQ es de tan solo 120.000, usando el
mismo patrn en la inyeccin. Por otro lado, al momento de hacer las curvas de
calibracin los m del mtodo por ionizacin qumica son ms selectivos que por
z
el mtodo IE, provocando menos errores al momento de identificar los picos de
cada compuesto; debido a que por el mtodo de IQ se pueden identificar m
z
como el [M + 1] mientras que por el modo de IE se muestran m comunes como
z
el 74, y 87.
3.2
CALIBRACIN
Para la calibracin del mtodo cromatogrfico se usaron diluciones del estndar
de mezcla de metilesteres de cidos grasos en concentraciones que van desde
7,5 hasta las 500 ppm. Despus de inyectados se seleccionaron los niveles de
cada compuesto que mejor correlacionaban con en una lnea recta.
NIVEL
1
2
3
4
5
6
7
CONCENTRACIN
(ppm)
2,5
5
7,6
25
50
76
100
46
8
250
9
500
Tabla 6. Concentraciones de cada nivel inyectado.
Cada compuesto tenia una concentracin diferentes en el estndar comercial, por
tal motivo se realiz la calibracin, individual para cada uno, usando los dos
mtodos de ionizacin.
Las curvas de calibracin de los 24 compuestos identificados por el modo de
ionizacin de IE se muestran en la figura 17.
y = 31754,6257x
Metil Hexanoato
100000
Area
Area
150000
50000
0
0
1
2
3
concentracion (ppm)
y = 32890,0542x
2
R = 0,998593
450000
300000
150000
300000
150000
0
0
0
10
15
y = 38328,7516x
Metil laurato
R = 0,999227
10
15
y = 35698,9845x
Metil tridecanoato
R = 0,999176
600000
Area
1100000
Concentracion (ppm)
Concentracion (ppm)
Area
4
8
12
Concentracion (ppm)
Metil undecanoato
Area
Area
R = 0,999634
450000
R = 0,998181
400000
300000
200000
100000
0
y = 29334,4457x
Metil decanoato
y = 29794,7106x
Metil Octanoato
R = 0,999871
550000
0
400000
200000
0
10
20
30
Concentracion (ppm)
10
Concentracion (ppm)
47
15
y = 8285,0543x
2
R = 0,999645
80000
60000
40000
20000
0
0
800000
600000
400000
200000
0
10
y = 39478,0653x
400000
300000
200000
100000
0
12
15
y = 8482,7202x
Metil palmitoleato
R = 0,996539
300000
Area
Area
200000
100000
0
10
Concentracion (ppm)
Area
2400000
1200000
0
0 10 20 30 40 50 60
800000
600000
400000
200000
0
0
12
18
24
12
15
Area
6
y = 11742,9754x
Metil oleato
R = 0,999307
Concentracion (ppm)
y = 34289,9814x
1000000
750000
500000
250000
0
R = 0,998340
Concentracion (ppm)
Metil linolenato
y = 51771,3069x
Metil heptadecanoato
R = 0,998627
3600000
10 15 20 25 30
Concentracion (ppm)
y = 59322,3794x
Metil palmitato
Area
Concentracion (ppm)
R = 0,996535
Area
R = 0,997822
Concentracion (ppm)
Metil pentadecanoato
y = 47957,7496x
Metil miristato
Area
Area
Metil miristoleato
30
Concentracion (ppm)
R = 0,999123
1000000
750000
500000
250000
0
0
20 40
60 80 100
Concentracion (ppm)
48
y = 58546,7106x
2
R = 0,999326
2000000
1500000
1000000
500000
0
Metil
eicosapentanoato
12
18
24
40000
0
30
y = 12142,7690x
Metil eicosanoato
105000
Area
70000
35000
0
0
10
R = 0,998724
12
15
Concentracion (ppm)
y = 4445,3519x
y = 14148,6363x
Metil erucato
R = 0,999808
R = 0,999484
150000
Area
70000
52500
35000
17500
0
y = 53210,0646x
800000
600000
400000
200000
0
Concentracion (ppm)
Metil docohexanoato
3
6
9 12 15
Concentracion (ppm)
Metil araquidato
R = 0,997994
Area
R = 0,998723
80000
Concentracion (ppm)
Area
y = 7241,2204x
120000
Area
Area
Metil estearato
100000
50000
0
10
15
Concentracion (ppm)
Concentracion (ppm)
49
10
y = 55855,3116x
Metil behenato
R = 0,996372
600000
300000
0
0
12
15
Concentracion (ppm)
Area
Metil lignocerato
12
10
y = 51254,7926x
2
R = 0,997467
800000
600000
400000
200000
0
Area
3
R = 0,999074
250000
187500
125000
62500
0
0
Concentracion (ppm)
y = 150524369x
Metil nervonato
R = 0,998512
500000
375000
250000
125000
0
Area
Area
900000
y = 50054,4212x
Metil tricosanoato
15
Concentracion (ppm)
12
15
Concentracion (ppm)
y = 28147,6990x
R = 0,999884
Area
Area
40000
5000
0
0
0,5
1
1,5
2
Concentracion (ppm)
15000
y = 4979,9789x
2
Metil undecanoato
R = 0,977351
10000
5000
0
0,5
1,5
2,5
Concentracion (ppm)
y = 3535,3187x
2
R = 0,998852
12000
Area
Area
10000
20000
Metil decanoato
R = 0,998347
15000
60000
y = 6406,5270x
Metil octanoato
8000
4000
0
0,5 1
1,5 2
2,5 3
Concentracion (ppm)
0,5 1
1,5 2
2,5 3
Concentracion (ppm)
50
y = 2847,76741x
2
3000
8000
4000
0
1 2 3 4 5
Concentracion (ppm)
1000
0
y = 449,7848x
500
250
0
0
0,5
1,5
Area
2000
1500
1000
500
0
y = 3769,3204x
2
1,5 2
2,5
y = 374,0207x
2
R = 0,997317
1250
625
0
1
Metil heptadecanoato
Area
4
Concentracion (ppm)
25000
12500
0
2
0,5
2500
1875
0,5
1
1,5
2
Concentracion (ppm)
R = 0,985639
R = 0,991973
Metil palmitoleato
R = 0,999467
50000
37500
Concentracion (ppm)
y = 1190,0197x
Metil palmitato
2,5
1750
875
0
1,5 2
y = 1208,8096x
3500
2625
Concentracion (ppm)
Metil pentadecanoato
Metil miristato
R = 0,979873
1000
750
0,5
Concentracion (ppm)
Area
Area
2000
Metil miristoleato
Area
R = 0,997963
R = 0,995265
16000
12000
Area
y = 1082,5623x
Metil tridecanoato
Area
Area
Metil laurato
10 12
Concentracion (ppm)
y = 1350,3377x
2
R = 0,994479
4000
3000
2000
1000
0
0
0,5 1
1,5
2,5
Concentracion (ppm)
51
y = 406,8320x
Metil linolenato
R = 0,998852
1400
Area
Area
2100
700
0
0
12000
6000
0
R = 0,981981
Area
Area
4000
0
1
12 15 18
y = 188,8438x
2
320
240
160
80
0
0,5
1,5
Concentracion (ppm)
y = 460,5697x
R = 0,987915
1500
800
1000
600
400
500
y = 280,7398x
Metil behenato
Area
Area
R =1
Concentracion (ppm)
Metil araquidato
Metil eicosanoato
8000
Concentracion (ppm)
y = 1893,2250x
12000
R = 0,993766
24000
18000
Concentracion (ppm)
Metil estearato
y = 1301,3304x
Metil oleato
R = 0,995324
200
0
0
0
0,5 1
1,5
2,5
0,5
1,5
2,5
Concentracion (ppm)
Concentracion (ppm)
52
y = 198,4241x
y = 65,5804x
Metil nervonato
R = 0,998092
400
200
300
200
150
100
Area
Area
Metil tricosanoato
R = 0,994589
50
0
100
0
0
0,5
1
1,5
Concentracion (ppm)
0,5
1,5
2,5
Concentracion (ppm)
y = 148,1900x
Metil lignocerato
R = 0,999724
Area
500
375
250
125
0
0
0,5
1,5
2,5
Concentracion (ppm)
53
NOMBRE
R2
SD (ppm)
RSD
(ppmil)
LD (ppm)
LC (ppm)
SENSIBILIDAD
(rea/ppm)
LOL
(ppm)
M. hexanoato
M. octanoato
M. decanoato
M. undecanoato
M. laurato
M. tridecanoato
M. miristoleato
M. miristato
M.
pentadecanoato
M. palmitoleato
M. palmitato
M.
heptadecanoato
M. linolenato
M. oleato
M. estearato
M.
eicosapentanoato
M. eicosanoato
M. araquidato
M.
docosahexanoato
M. erucato
M. behenato
M. tricosanoato
M. nervonato
M. lignocerato
0,9999
0,9982
0,9996
0,9986
0,9992
0,9992
0,9997
0,9978
6,363E+03
7,410E+03
1,080E+04
8,639E+03
1,143E+04
8,147E+03
2,497E+03
1,464E+04
2,243E+01
3,250E+01
5,428E+01
3,485E+01
4,330E+01
3,032E+01
3,709E+01
4,621E+01
5,520E-03
5,880E-03
5,970E-03
5,330E-03
4,570E-03
4,910E-03
2,115E-02
3,650E-03
1,839E-02
1,960E-02
1,991E-02
1,776E-02
1,524E-02
1,636E-02
7,049E-02
1,218E-02
3,175E+04
2,979E+04
2,933E+04
3,289E+04
3,833E+04
3,570E+04
8,285E+03
4,796E+04
3,750
10,00
12,50
12,50
25,00
12,50
7,500
12,50
0,9965
3,948E+04
7,500
0,9965
0,9986
8,483E+03
5,932E+04
25,00
50,00
0,9983
5,177E+04
12,50
0,9993
0,9991
0,9993
3,429E+04
1,174E+04
5,855E+04
25,00
75,00
25,00
0,9987
7,241E+03
12,50
0,9980
0,9987
1,214E+04
5,321E+04
7,500
12,50
0,9998
4,445E+03
12,50
0,9995
0,9964
0,9985
0,9991
0,9975
3,382E+03
1,212E+04
1,267E+04
4,044E+03
1,216E+04
1,415E+04
5,586E+04
5,005E+04
1,505E+04
5,125E+04
7,500
12,50
7,500
12,50
12,50
3,195E+01
3,000E+01
3,547E+01
3,776E+01
3,351E+01
1,238E-02
3,140E-03
3,500E-03
1,164E-02
3,420E-03
4,128E-02
1,046E-02
1,167E-02
3,880E-02
1,139E-02
54
55
N de
ID
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
SENSIBILIDAD
(rea/ppm)
2,075E-02
2,815E+04
9,116E-02
6407
0,1173
4980
0,1652
3535
0,2051
2848
0,5395
1083
1,298
449,8
0,4831
1209
LOL
(ppm)
1,500
2,000
2,500
2,500
5,000
2,500
1,500
2,500
NOMBRE
R2
SD (ppm)
M. hexanoato
M. octanoato
M. decanoato
M. undecanoato
M. laurato
M. tridecanoato
M. miristoleato
M. miristato
M.
pentadecanoato
M. palmitoleato
M. palmitato
M.
heptadecanoato
M. linolenato
M. oleato
M. estearato
M. eicosanoato
M. araquidato
M. behenato
M. tricosanoato
M. nervonato
M. lignocerato
0,9999
0,9984
0,9774
0,9989
0,9953
0,9980
0,9799
0,9920
1,848E+03
6,505E+02
5,277E+02
4,386E+02
2,460E+02
6,768E+01
2,427E+01
8,561E+01
6,889
10,67
11,33
13,23
9,093
6,468
5,468
7,362
6,220E-03
2,735E-02
3,518E-02
4,956E-02
6,152E-02
0,1618
0,3895
0,1449
0,9995
6,005E+01
5,153
0,1472
0,4908
1190
1,500
0,9973
0,9856
2,609E+01
7,143E+02
7,257
21,36
0,4684
4,648E-02
1,561
0,1549
374,0
3769
5,000
10,00
0,9945
1,189E+02
9,281
0,1298
0,4325
1350
2,500
0,9989
0,9938
0,9820
1,000
0,9879
0,9953
0,9981
0,9946
0,9997
1,207E+02
3,707E+02
3,138E+02
2,233
3,402E+01
1,741E+01
4,442
4,415
1,796
35,36
34,10
18,35
1,185
7,455
6,325
2,216
6,646
1,216
0,4306
0,1346
9,254E-02
0,9278
0,3804
0,6241
0,8830
2,672
1,182
1,435
0,4488
0,3085
3,093
1,268
2,080
2,943
8,905
3,941
406,8
1301
1893
188,8
460,6
280,7
198,4
65,58
148,2
3,800
15,00
5,000
1,500
2,500
2,500
1,500
2,500
2,500
LC (ppm)
56
Figura 19. Cromatgrama total de iones del aceite de crislida de gusano de seda
previamente esterificado.
En la tabla 9, se muestra los porcentajes de los cidos grasos pertenecientes al
aceite de la crislida del gusano de seda.
57
ACIDO
PORCENTAJE (%)
GRASO
Palmitoleico
0,851
Palmitico
26,300
Linolenico
5,656
Oleico
43,752
Esterico
6,655
Tabla 9. Porcentaje de cidos grasos en la muestra real (aceite de crislida).
3.5 INTERFERENCIAS
Las interferencias se pueden originar en la fase pre-analtica y en la fase analtica
de las pruebas [18].
Las interferencias pre-analticas se pueden producir en cualquiera de estas fases:
al momento de la toma de la muestra; cuando la conservacin de la muestra no
se hace a temperaturas adecuadas; lapsos largos de tiempo entre extraccin del
aceite de la muestra, derivatizacin de la muestra y el momento del anlisis
cromatogrfico, y al momento mismo de la extraccin del aceite (si la muestra lo
amerita) y la derivatizacin debida a la calidad de los reactivos utilizados.
Estas interferencias se pueden controlar, primero capacitando al personal que
toma la muestra, minimizando el tiempo entre la toma y el anlisis y
mantenindola refrigerada. El analista debe recibir la muestra y mantenerla
refrigerada, si a la muestra se le debe practicar la extraccin del aceite por el
mtodo soxhlet hacerlo en el menor tiempo despus de recibida la muestra, si la
muestra ya es una materia oleosa, se debe conservar protegida de la luz y a
temperaturas adecuadas, evitando la degradacin que puede ser fotoqumica,
causada por hongos o por la temperatura.
Al momento de la extraccin, el reactivo debe cumplir con una calidad
previamente establecido, en caso de ser solvente reutilizado, debe ser procesado
para eliminar contaminaciones. Los reactivos de la derivatizacin deben ser
anhidros, por este motivo se utiliza la mezcla de H2SO4/MeOH por su fcil
preparacin en comparacin con la mezcla HCl/MeOH al 5%, minimizando la
probabilidad de que la mezcla quede con trazas de agua [16]. La concentracin de
la mezcla tambin debe ser baja, porque a concentraciones de 20% el cido
graso sufre oxidaciones en sus dobles enlaces, formando compuestos que
podran interferir posteriormente. El hexano utilizado para realizar la extraccin del
metilster, despus de ser derivatizado, debe ser calidad cromatogrfica porque
es el paso inmediatamente anterior al anlisis cromatogrfico.
Las inferencias analticas se pueden clasificar en: interferas que cambian la
concentracin del analito e interferencias que afectan el equipo o sus
componentes.
58
Equipo soxhlet
Hexano
Rotavaporador
Plancha de calentamiento
Mechero
Balanza
cido sulfrico concentrado
Metanol absoluto
Hexano calidad cromatogrfica
Pipetas Pasteur (2 unid)
Centrifuga
Tubo centrifuga
Vial de 2 mL
Cromatgrafo
Analista
$ 46,60
$ 6.394,50
$ 500,00
$ 21.000,00
$ 4.800,00
$ 694,00
$ 20,00
$ 50,11
$ 2.020,00
$ 500,00
$ 45.000,00
$ 2.000,00
$ 2.300,00
$ 23.300,00
$ 12.000,00
59
Direccin tcnica
$ 20.000,00
Estandarizacin (100 muestras)
$ 3.417,91
Porcentaje para gastos
$ 28.808,62
administrativos de la UTP (20%)
TOTAL
$ 172.851,74
Tabla 10. Presupuesto para el anlisis de una muestra.
Despus de que la tcnica fue estandarizada, el laboratorio de olequmica tiene
una herramienta moderna, eficaz y econmica para realizar anlisis de cidos
grasos usando sus derivados, obteniendo resultados confiables y repetibles.
Comparando este valor con precios de laboratorios pertenecientes a
universidades prestigiosas de la regin el cual esta entre $144.608 a $240.000
para semi-cuantificaciones o solo perfiles cromatogrficos, el primero con detector
de EM y el segundo con detector de ionizacin en llama. Si se desea una
cuantificacin se debe mandar el estndar y su precio aumenta a $173.068 con
detector de EM.
A nivel internacional en pases como Argentina y Mxico los precios de estos
anlisis (perfiles cromatogrficos) oscilan entre USD 77 y USD 123, que pasando
estos valores a pesos colombianos es de $141.804 y $226.549 sin tener en
cuenta el valor del envi,
Comparando el valor obtenido para la estandarizacin con los costos de
laboratorios en otras universidades, el precio es competitivo sabiendo que en
estos ltimos solo hacen perfiles cromatogrficos, mientras que si se prestara el
servicio a la comunidad seria una cuantificacin.
60
4.
CONCLUSIONES
61
62
5.
RECOMENDACIONES
Se recomienda utilizar una columna polar, especifica para FAMES como por
ejemplo FAMEWAX con el objeto de analizar y cuantificar ismeros de cidos
insaturados cis y trans; para totalizar los analitos del estndar comercial de la
identificacin.
63
BIBLIOGRAFA
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13.
14.
15.
16.
17.
18.
65
ANEXOS
66
gghhhfghfg
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84