INTRODUO

O conceito de biossegurana visa primeiramente a sade da vida da pessoa que

est trabalhando em laboratrio, para que essa segurana ocorra, foram criados normas
de conduta em um laboratrio, que visam abordar medidas de controle de infeco para
proteo da equipe em servios de sade, preservao do meio ambiente na
manipulao e no descarte de resduos qumicos, txicos e infectantes. O tema abrange
ainda a segurana no uso de tcnicas de engenharia gentica e as possibilidades de
controles capazes de definir segurana e risco para o ambiente e para a sade humana,
associados liberao no ambiente dos organismos geneticamente modificados (OGMs)
(albuquerque, 2001). O corrente interesse em biossegurana manifestado no crescente
nmero de regulamentaes nacionais e internacionais para controle dos procedimentos
de biotecnologia. A biossegurana tem vrias normas que preconizam a diminuio da
exposio de trabalhadores a riscos e a preveno de contaminao ambiental
(Hambleton et al., 1992). Segundo Waissman; Castro (1996), os agentes biolgicos
apresentam um risco real ou potencial para o homem e para o meio ambiente, por esta
razo, fundamental montar uma estrutura laboratorial que se adapte preveno de
tais riscos.
Pipetagem
A tcnica de pipetagem, como a prpria expresso sugere, realizada com o
auxlio de pipetas, instrumentos volumtricos utilizados para a transferncia de certos
volumes, de modo preciso, sob determinadas temperaturas. A pipetagem consiste em
aplicar uma presso negativa na abertura superior da pipeta para a suco de lquidos.
expressamente proibido pipetar com a boca e tambm nem h necessidade, pois existem
no mercado vrios tipos e modelos de dispositivos auxiliares para pipetas.
Ao pipetar uma soluo sempre se enche a pipeta at seu volume mximo e ento feita
a dispensa do lquido at ao volume desejado. O operador deve olhar de frente para a
marcao, em linha reta, para verificar se o volume est na marcao. Quando um
lquido est em um recipiente cilndrico ele no fica em linha reta, h uma espcie de
curva, a parte inferior desta o menisco. Quando medimos um lquido os olhos devem
estar na altura do menisco e a pipeta deve estar verticalmente reta.

Reagentes

Os reagentes so compostos necessrios na biologia molecular para fazer

extrao, desnaturao, solubilizao entre outros tantos reaes qumicas necessrias
nas metodologias.
A seguir esto os principais reagentes utilizados na biologia molecular:
cido brico: utilizado no preparo de tampes e para ajustar o valor de pH da
soluo.
lcool etlico (PA): Um solvente orgnico, utilizado no preparo de solues e
precipitao de cidos nucleicos.
Acrilamida: utilizada para formar a poliacrilamida, um gel usado na eletroforese de
cidos nucleicos com at 1000 pares de bases.
Agarose: Utilizada para formar o gel de agarose, tambm usado na eletroforese de
protenas de cidos nuclicos.
gua destilada: gua obtida por meio de destilao, utilizado para preparo de solues.
gua livre de nucleasse: Utilizada em tcnicas que exijam gua e solues livres de
nucleasse e contaminantes, filtrada em uma membrana.
gua mili-Q ou gua ultra pura: gua sem a presena de ctions e nions, praticamente
sem condutividade, utilizada para preparo de solues e gis de agarose e acrilamida.
Azul de bromofenol: um corante de solues, utilizado em eletroforese em gel para
marcar a migrao dos cidos nuclicos.
Clorofrmio: um solvente utilizado para desnaturao de protenas.
Bis-acrilamida: Junto com a acrilamida forma o gel de poliacrilamida para eletroforese
em gel.
Brometo de etdeo: Corante de DNA, utilizado para visualizao das bandas em gis de
agarose e poliacrilamida.
Cloreto de magnsio: Estimula a Taq polimerase na reao em cadeia de polimerase
(PCR).
DNA Polimerase termoestvel (Taq polimerase): Enzima resistente ao calor utilizada na
amplificao de fragmentos de DNA por meio de PCR.

Marcador de peso molecular: utilizado como padro de peso molecular em

eletroforese em gel.
Nitrato de prata: Colorao de protenas.
Persulfato de amnio: Na presena de TEMED, oxida e libera radicais livres para o
incio do processo de polimerizao da acrilamida.
Proteinase K: Cliva protenas, utilizada na extrao de cidos nuclicos.
Sal dihidratado dissdico (ETDA): Inibe as DNAses impedindo a degradao do DNA.
SDS (Docedil sulfato de sdio): Causa a lise das clulas, solubiliza lipdios, desnatura
protenas e inibe a atividade enzimtica.
TEMED: Utilizado na catalisao e liberao de radicais livres de persulfato de amnio.
Tris base: utilizado no preparo de TAE, TBE e TE.
Tris-HCl: Utilizado no preparo de solues tampo.
Oligonocleotdeo Iniciador (primer): um segmento de DNA ou RNA, utilizado na
PCR.
Preparo de solues
Solues so misturas de duas ou mais substncias que apresentam um aspecto
uniforme, ou seja, so misturas homogneas. Os componentes de uma soluo so o
solvente e o soluto. Normalmente dissolve-se o soluto no solvente. A quantidade de
soluto a ser dissolvido depende da temperatura em que ocorre a soluo, da natureza do
soluto e do solvente, e da concentrao, que a grandeza que relaciona a massa de
soluto com o volume total da soluo.

1 Prtica:
Noes de Biossegurana em Laboratrios de Biologia Molecular
OBJETIVOS:
Proporcionar ao aluno noes bsicas de Biossegurana em laboratrio de
biologia molecular.
MATERIAIS:

Capela;
Fluxo laminar;
Jaleco;
Luvas;
Mscaras;
culos;
Toucas.

PROCEDIMENTO:
Observou-se atentamente a explicao da professora referente a todos os
equipamentos de proteo coletiva (EPC) e os equipamentos de proteo individual
(EPI) disponveis no laboratrio de biologia molecular.
DISCUSSO
difcil praticar rigorosamente a boa conduta em laboratrio, porque da
natureza do ser humano querer facilitar as coisas, de modo a burlar a boa prtica. Um
exemplo simples, na hora de preparar uma soluo que envolva um cido, o trabalhador
manipula o mesmo fora da capela, pois leva menos tempo, mas que pode deixar marcas
permanentes. Outros fatores contribuem para dificuldade de praticar as normas de
biossegurana, como a pressa, a inexperincia, ou at mesmo o excesso de experincia,
pois alguns profissionais sentem tanta confiana em si mesmo que agem como se a
rotina fosse um clich e por um pequeno deslize, um grave acidente pode ocorrer. Vale
ressaltar a importncia de sempre utilizar em laboratrio, os EPIs e EPCs
recomendados, pois a utilizao dos mesmos, evitam acidentes, preservando a
integridade fsica dos trabalhadores.

2 Prtica:
OBJETIVOS:
Preparo de solues para os procedimentos tcnicos de extrao de DNA e
anlise por eletroforese que sero utilizadas nas prximas aulas.

MATERIAIS:

Acetato de Potssio;
cido Brico;
cido actico glacial;
gua destilada;
Balana analtica;
Basto de vidro;
Becker;
EDTA;
Equipamento de proteo individual;
Equipamento de proteo coletiva;
Erlenmeyer;
Micropipetas;
Proveta;
SDS;
Tris Base (Trizma).

PROCEDIMENTO:
Com todos os alunos devidamente equipados com EPIs, iniciaram-se os
clculos para preparo das solues. Determinaes de massas e volumes dos solutos e
reagentes definidos pela professora.

A) Para o preparo da soluo TE:

Preparou-se 5 mL de Tris-HCL 2 M;
Em seguida preparou-se 5 mL de EDTA 0,5 M;
Posteriormente preparou-se 10 ml de TE 1X, conforme a tabela 1.

Tris- HCL 2M

EDTA

TE (1X) 10mM Tris/1

nM EDTA
50 Tris- HCL 2M

0,6075g de Tris base

(TRIZMA)
3mL de gua destilada (dest.)
0,3 mL de HCL
Completou-se para 5 mL de
gua dest.

0,930g de EDTA
80 mL de gua dest.

20 EDTA 0,5M
9,93 mL de gua destilada
O pH deveria ser ajustado
pH: 7,2-7,4

Tabela 1- Tabela com a quantidade de produtos e reagentes com seus volumes e massas j
convertidos, seguindo padres determinados em aula.

B) Para o preparo da soluo TBE:

Preparou-se 100 mL de TBE 10 X;
Preparou-se 500 mL de TBE 1 X, conforme a tabela 2.
TBE 10X

TBE 1X

10,8 g de Tris base (Trizma)

5,5g cido Brico
0,744g EDTA

500 mL de TBE 10 X
50mL de TBE 10 X

Completou-se com 100 mL de gua

destilada
Tabela 2- Tabela com a quantidade de produtos e reagentes com seus volumes e massas j
convertidos, tambm seguindo os padres determinados em aula.

C) Para o preparo das solues SDS e precipitao proteica:

Preparou-se 10 mL de SDS 20%;

Preparou-se 10 mL de acetato de potssio;
Preparou-se 10 mL de soluo de precipitao proteica, conforme a tabela 3.

SDS 20%

Acetato de potssio (5M)

10g de SDS

0,493g de acetato de potssio

50 mL de gua dest.

10 mL de gua dest.
Adicionou-se a gua aos
poucos

Soluo de precipitao
proteica
6 mL de acetato de potssio
5M
1,1 mL de cido actico
glacial P.A
2,0 mL de gua dest.

Tabela 3- Quantidade de produtos e reagentes com seus volumes e massas j convertidos,

tambm seguindo os padres determinados em aula.

DISCUSSO

1.

Quais os procedimentos em biologia molecular que utilizam as solues

TE, TBE, SDS e Soluo de precipitao proteica e quais so suas funes?

O Tampo de Eluio (TE) um tampo utilizado nos processos de purificao
e armazenamento, ideal para ressuspender precipitados de DNA. Testada para ausncia
de nuclease, essa soluo de pH 8,0 diminui a hidrlise das bases, inibindo a ao de
DNases e RNases.
O Tris-Borato-EDTA (TBE) um tampo amplamente utilizado para
aplicaes de eletroforese em gis de alta resoluo que exigem a separao de
fragmentos de alto peso molecular (>12kb). ideal para manipulaes in gel e para
recuperao de DNA. De baixa fora inica e baixa capacidade tamponante, pode exigir
recirculao para corridas eletroforticas longas (>6h).
O Dodecil Sulfato de Sdio (SDS) um detergente aninico utilizado na
extrao de DNA e na confeco de gis SDS-Page. Promove a lise da maior parte das
clulas, solubiliza lipdios, desnatura protenas e inibe a atividade enzimtica.
A Soluo de precipitao proteica utilizada na purificao de protenas
devido sua capacidade de precipit-las irreversivelmente sem causar um aumento
considervel de temperatura.
2.

Quais os cuidados necessrios o manipulador deve tomar para o melhor

desempenho na pipetagem? Qual a importncia desses cuidados?

A pipetagem consiste em aplicar uma presso negativa na abertura superior da
pipeta para a suco de lquidos. expressamente proibido pipetar com a boca e
tambm nem h necessidade, pois existem no mercado vrios tipos e modelos de
dispositivos auxiliares para pipetas. Ao pipetar uma soluo sempre se enche a pipeta
at seu volume mximo e ento feita a dispensa do lquido at ao volume desejado. O
operador deve olhar de frente para a marcao, em linha reta, para verificar se o volume
est na marcao. Quando um lquido est em um recipiente cilndrico ele no fica em
linha reta, h uma espcie de curva, a parte inferior desta o menisco. Quando medimos
um lquido os olhos devem estar na altura do menisco e a pipeta deve estar
verticalmente reta.

Para o uso adequado das pipetas automticas, visando obter preciso e

exatido, necessrio primeiramente que as pipetas e ponteiras sejam de qualidade, que
se tenha suficiente experincia prtica em seu uso correto e que a manuteno e
calibrao estejam em conformidade com as orientaes do fabricante. Ponteiras de m
qualidade podem ter rebarbas ou ondulaes no plstico que retm lquidos, de modo
que o volume pipetado no o volume dispensado. Outro problema no uso de ponteiras
de m qualidade a abertura no concntrica da ponta da ponteira, afetando a
distribuio do lquido na ponteira. Nunca mover a pipeta da posio vertical quando
estiver com lquido na ponteira. Manter a pipeta na posio vertical e efetuar a aspirao
do lquido lentamente, dando uma pausa de uma frao de segundos aps a aspirao.
recomendado que se faa um ambiente na ponteira com o lquido a ser pipetado. Com
isto se obtm melhor exatido e preciso da pipetagem. Para prevenir corroso do
pisto, evitar aspiraes acidentais do lquido para dentro da pipeta. Aps o uso as
pipetas devem ser mantidas na posio vertical em estantes apropriadas.

3.

Porque as atividades realizadas na rea de biologia molecular requerem

reagentes de qualidade e pureza elevada?

Para obter resultados sem contaminao e com uma maior preciso, no se
pode ter reagentes mal armazenados, vencidos ou em concentraes erradas, alm de
uma qualidade ruim, pois comprometem e alteram os processos nos experimentos de
biologia molecular, pois so altamente sensveis.
4.

Descreva detalhadamente os clculos feitos para o preparo de todas as

solues.
Para os clculos, utilizou-se uma regra de trs simples, fazendo a correo na
metodologia para os volumes descrito no procedimento.
A)

Preparo de solues: TE
1. Preparou-se 5mL de Tris-HCL 2 M;
6,075g Tris Base-------- 50ml gua destilada
x --------------------------- 5ml gua destilada
x=0,6075g Tris Base
3 ml HCl---------- 50ml gua destilada
y--------------------- 5ml gua destilada
y= 0,3 ml HCl

2. Em seguida preparou-se 5mL de EDTA 0,5 M;

14,89g EDTA -------- 80ml gua destilada
x------------------------ 5ml gua destilada
x= 0,9306g EDTA
B)

Preparo de solues: TBE

1. Preparou-se 100ml de TBE 10X
108g Tris Base ----------1000ml gua destilada
x----------------------------100ml gua destilada
x=10,8 Tris Base
55g cido Brico------- 1000ml gua destilada
y--------------------------- 100ml gua destilada
y=5,5g cido Brico
7,44g EDTA------------- 1000ml gua destilada
z--------------------------- 100ml gua destilada
z=0,744g EDTA
2.Preparou-se 500 mL de TBE 1X
100ml TBE 10X-------1000ml gua destilada
x---------------------------500ml gua destilada
x=50ml TBE 10X

C)

Preparo de solues: SDS e precipitao proteica

1.Preparou-se SDS 20%
20g SDS-------------- 100ml gua destilada
x----------------------- 50ml gua destilada
x=10g SDS
2.Preparou-se Acetato de Potssio (5M)
24,687g Acetato de Potssio ------------ 500ml gua destilada
y---------------------------------------------- 10ml gua destilada
y=0,49375 Acetato de Potssio

5.

Quais so os diferentes tipos de gua?

gua Destilada: obtida pelo processo de destilao simples, separa os

compostos no volteis. Os compostos volteis e condensveis so coletados junto com
a gua destilada. adequado para alguns usos em laboratrio, como preparao de
algumas solues.

gua Desmineralizada ou gua deionizada: obtida pela passagem da gua

por duas colunas trocadoras de ons, uma catinica e a outra aninica. Tambm pode ser
por passagem em um leito misto constitudo de uma mistura das duas resinas.
adequada para aplicaes que exigem gua com baixa condutividade.
gua ultra pura (milli-q): uma gua de extrema pureza, isenta de partculas,
ons e substncias orgnicas ou microrganismos. obtida pela passagem da gua por
sistemas de abrandamento como resina trocadora que substituem o clcio e o magnsio
dissolvido na gua por ons de Sdio, seguido de sistema de osmose reversa, que faz a
remoo desses ons, seguido de um refinamento por uma srie de filtros constitudos de
resinas catinicas e aninicas. Um leito de carvo ativo para remoo de contaminantes
orgnicos e finalmente um filtro fsico para remoo de particulas. usado em
laboratrios analticos onde se requer uma gua de altssima pureza, como por exemplo,
nas anlises por HPLC.
CONCLUSO
Com essa aula, foi possvel estabelecer a importncia da prtica de
biossegurana em laboratrios de biologia molecular, devido ao perigo que o mesmo
oferece, com a manipulao de cidos concentrados, reagentes txicos (carcinognicos)
entre outros produtos e processos do qual necessrio a utilizao dos EPIs e EPCs para
uma maior segurana e conservao da integridade fsica do aluno/profissional. Foi
possvel tambm, obter uma maior aprendizagem a respeito de pipetagem e
micropipetagem, observando a importncia do manuseio apropriado desse instrumento,
pois qualquer erro, pode implicar na alterao em grande escala de seu resultado. Na
parte de preparo de solues, observou-se que todo experimento tem uma metodologia
para esses preparos, e que necessrio a adequao dessa metodologia padro para a
alterao da quantidade, de acordo com a necessidade do experimento.

REFERNCIAS

DIFERENA ENTRE GUA DESTILADA, DEIONIZADA E ULTRAPURA. Efeitos

qumicos na gua. Disponvel em: <quimicanaagua.com.br>. Acesso em: 27 de maro de
15.

ALBUQUERQUE, M.B.M. Biossegurana, uma

viso da histria da cincia.

Biotecnologia, Cincia &Desenvolvimento, v.3, n.18, p. 42-45, 2001.

HAMBLETON, P.; BENNETT, A.M.; LEAVER, G. Biosafety monitoring devices for

biotechnology processes. Tibtech, v.10, p.192-199, 1992.

WAISSMAN W.; CASTRO, J.A.P. A evoluo das abordagens em sade e trabalho no

capitalismo industrial. In: TEIXEIRA, P.; VALLE, S. (Ed.). Biossegurana: uma
abordagem multidisciplinar. Rio de Janeiro: Fiocruz, 1996. p.15-25.

TCNICAS

DE

PIPETAGEM.

Odonto

unifoa.

Disponvel

em:<

http://odontofoa09.wordpress.com/2009/08/11/tecnicas-de-pipetagem>. Acesso em: 27 de

maro de 2015.

TCNICAS DE PIPETAGEM E MICROPIPETAGEM. Portal da Educao.

Disponvel em: < www.portaleducacao.com.br/Artigo/Imprimir/24384>. Acesso em 27 de
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REAGENTES PARA BIOLOGIA MOLECULAR . Disponvel em: <www.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS

FACULDADE DE CINCIAS BIOLOGICAS E AMBIENTIAS FCBA
CURSO DE BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE FUNDAMENTOS BIOLOGIA MOLECULAR

RELATRIO DE AULA PRTICA 1

TURMA P3

NOES DE BIOSSEGURANA EM LABORATRIOS DE BIOLOGIA

MOLECULAR E PIPETAGEM, REAGENTES E PREPARO DE SOLUES

ALUNOS: ALEX OLIVEIRA

MATHEUS WERLANG
OTAVIO MARQUES
VANDER BERRES

PROF DR ALEXIA BARUFATTI GRISOLIA

DOURADOS-MS, MARO DE 2015