PROTEINE

Definiie
Biomacromolecule formate din una sau
mai multe catene, rezultate prin policondensarea aminoacizilor.

Funcionalitate extrem de
divers

Biocataliza enzimatic
Hormoni
Transport, stocare
Formaiuni motile
Suport structural
Anticorpi
Transmitere de impulsuri nervoase
Reglarea unor procese metabolice

Determinarea compoziiei i
purificarea proteinelor

1. Evaluarea coninutului de protein brut

1. Metoda Kjeldahl

Se bazeaz pe corelaia coninutului de

azot cu cel de protein.
Se consider c proteinele contin 16 %
azot

Mineralizarea probei
Antrenarea amoniacului i
dozarea acestuia

Norg

(NH4)2SO4
NH4OH
NH3

H2SO4
(NH4)2SO4
NaOH

NH4OH

NH3
HCl

NH4Cl

1. Evaluarea coninutului de protein brut

2. Metoda Lowry

Se bazeaz pe absorbana
la 660 nm a complexului
reaciei de tip Biuret (protein
+ Cu+2) i formei reduse a
reactivului Folin de catre Cu+
rezultat la oxidarea Tyr, Cys
i Trp

Reactivi:

Soluie alcalinocupric
Reactiv Folin Cioclteu
(soluie fosfomolibdowolframic NaWO4 2H2O
NaMoO4 2H2O)

Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

H
N

N
Cu+2

R
H

N
H

1. Evaluarea coninutului de protein brut

3. Varianta reactiv
bicinconinic
Acid 2,2 bichinolin 4,4 dicarboxilic
Proteina interacioneaz cu ionul
Cu2+ ntr+o reacie similar
cu reacia Biuret. n urma
acestei reacii, n mediu
alcalin are loc reducerea
Cu2+ la Cu+ care dezvolt o
coloraie purpurie prin
complexare cu reactivul
562 nm
Anal Biochem. 1985 Oct;150(1):76-85

HO2C

CO2H
N

N
Cu+

N
HO2C

N
CO2H

 4. Metoda Bradford

Deplasarea maximului de
absorbie al colorantului n urma
atarii acestuia de protein
(465 595 nm)
SO3-

H3C

NH

CH3

Coomassie Blue G-250

O

SO3-

Bradford, M. M. (1976), Anal. Biochem. 72:248-254

2.Separarea i purificarea
proteinelor
2.1. Distrugerea membranelor i pereilor celulari
Mijloace nechimice
Utilizarea de abrazivi
Forfecarea prin de destindere
Ultrasonare

Mijloace chimice

Solveni organici
Detergeni
Ageni chaotropici
Tratament alcalin
Enzime (lizozim)

Dezintegratoare
Ultrasonic

Forfecare la destindere

Dezintegratoare (continuare)

2.2. ndeprtarea resturilor de la omogenare

Centrifugarea

2.3. Purificarea grosier a proteinelor

Solubilitatea carboxihemoglobinei
funcie de tria ionic i natura ionilor

Precipitare la
punctul izoelectric
Precipitarea prin
efect salin

Dializa

Purificarea fin a proteinelor

Metode cromatografice
Metode electroforetice

Cromatografia de excluziune steric

Electroforeza (principiu)

Relaia mobilitate masa la

separrile electroforetice

Gel electroforetic dup migrare

Determinrii structurii primare a

proteinelor
1. Separarea catenelor (desfacere de legturi slabe)

Utilizare de valori extreme ale pH-ului

Ageni chaotropici (distrugtori de structur)
Uree 8M
Clorohidrat de guanidiun 6M
Concentraii ridicate de sruri (sulfat de amoniu)

2. Desfacerea puntilor disulfurice

metode reductive

metode oxidative

3. Stabilirea compoziiei n aminoacizi

Hidroliza, separare

Secvena determinrii structurii primare

a proteinelor (continuare)
4. Stabilirea aminoacizilor de capt

N, C.

5. Fragmentarea catenelor lungi

Chimic, enzimatic

6. Secvenarea propriuzis Edman

7. Reconstituirea secvenei prin alinierea
fragmentelor

Evaluarea secvenelor pe tip de fragment

8. Relocarea punilor disulfurice

Electroforeza fragmentelor nainte i dup desfacerea punilor disulfurice

2.Desfacerea punilor disulfurice

1.Ci reductive
Mercaptoetanol

Ditiotreitol

2.Ci oxidative
Acidperformic

3.Determinarea compoziiei in aminoacizi

Hidroliza acid (HCl 6N la reflux 7296h)

1. Separare cromatografica
2. Identificare, cuantificare

Reactia ninhidrinei i determinarea calitativ prin

cromatografie pe strat subire a aminoacizilor
R
O

O
H3N

OH

CO2-

O-

CH

OH

R
N
O

Ninhidrin
(tricetohidrinden
hidrat)

O
CO2
O

df

ds

HOH
NH2
O-

O-

CHO

O
OH

Rf=100 x ds/df

N
O

H
O-

O
OPurpura lui RUHEMANN

CH

4. Determinarea aminoacizilor de capt

Aminoacizii N-teminali

a) dansilarea
H3C

H3C

CH3

H3C

CH3

Aminoacizii C-teminali

a) Metoda Akabori
Ri

CH3

hidroliz
acid

H2N-CH(R)-CO-NH-CH-....

R3

R2

H3N

R1

+ aa1 +...

NH CH CO NH CH CO NH CH CO2
SO2NH -CH(R)-CO-NH-CH...

SO2Cl

SO2NH-CH(R)-CO2H

Clorur de dansil

a) Metoda Sanger
F

NH-CH(R)-CO-NH-CH...
NO2

NO2

H2N-CH(R)-CO-NH-CH-....

NH-CH(R)-CO2H
NO2

hidroliz
acid

+ aa1 +...
NO2
2,4 dinitrofluorobenzen

NO2

NO2

H3N
H2N NH2

CH CO NH NH2
R1

H2N NH2

i=2,...

CH CO2

5. Fragmentarea catenei polipeptidice

a.Fragmentareenzimatic
R1 O

COO

CH C NH CH

H3N

R1 O
H3N

R2

CH C

R2
O

H3N CH

COO

Enzima

Situs preferat

Tripsina
Clostripaina
Chimotripsina
Termolisina
Pepsina
Proteaz stafilococic (tampon fosfat)
Proteaz stafilococic (tampon HCO3- )
Subtilizina
Carboxipetidaza A

R1: Lys, Arg

R1: Arg
R1: Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, Trp
R2: Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, Trp
R1: Phe, Leu, muli ali aminoacizi
R1: Asp, Glu
R1: Glu
R1: Muli
R2: Aminoacid C- terminal (exceptie, Arg,
Tyr, Trp)

b.Fragmentarechimiccubromocian

H
O

O
C

NH CH C NH
CH2
CH2
H3C

NH CH

NH CH

H3C

CN

H3C

Br

SCN

bromocian
O
C

O
CH2

CH2

homoserinolactona
NH CH

C
O

CH2
CH2

H3N

O
C

CH2

CH2

H
H
N

6. Secvenarea Edman

R2

O
NH

S
C

pH = 9

R1

H2N

R2
(H*)

O
S
NH

NH

R1

(H*)

feniltiocarbamoil peptid
CF3CO2H

O
O
N
S

mediu apos
R1

NH

Feniltiohidantoin (PTH)

S
N

Anilinotiazolinon

R1
(H*)

R2
NH2

peptida fr
aminoacidul N-termina

7. Reconstituirea secvenei
totale

8. Relocarea puntilor disulfurice

Aminoacizii naturali, sistematizai pe diferite criterii

L-aminoacid

L-prolina

Alanina
Arginina
Asparagina
AcidulAspartic
Cisteina
Glutamina
AcidulGlutamic
Glicina
Histidina
Izoleucina
Leucina
Lizina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofan
Tirozina
Valina

A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V

ala
arg
asn
asp
cys
gln
glu
gly
his
ile
leu
lys
met
phe
pro
ser
thr
trp
tyr
val

Structura primar i secundar a unei proteine

Unghiurile de torsiune i
Diagrama Ramachandran

Conformatie
defavorizata

Structuri helix

Principalele tipuri de
structuri secundare
dispuse pe diagrama
Ramachandran

Modelul
alfa helix n
diferite
reprezentri

Modele foi plisate (modele beta) paralel si antiparalel

Modelul paralel

Modelul antiparalel

Foi beta : model antiparalel

Foi beta : model paralel

FOI BETA
Model paralel

Model antiparalel

Model foaie beta antiparalel extins

Modaliti de conectare ale structurilor beta:

a) Antiparalel, prin bucl
b) Paralel, prin bucl de dreapta, cazul comun
c) Paralel, prin bucl de stnga, caz extrem de rar

Modaliti de formare a structurilor

helicoidale din proteine

Bucle
Buclele se plaseaz
ntre helixuri sau foi
plisate. Ele nu sunt
att de rigide. De
regul aceste regiuni
sunt zone de
recunoatere

Structuri suprasecundare

Interaciuni care stabilizeaz structurile teriare proteice