MICROBIOLOGA

SEGUNDO CURSO

GUIN DE PRCTICAS

Curso 2007-2008

INDICE

Normativa de las prcticas de Microbiologa............................................................................................................. Pag. 3

Normas y reglas en el laboratorio de Microbiologa .................................................................................................. Pag. 4
Material de laboratorio ............................................................................................................................................... Pag. 5
Objetivo de las prcticas de Microbiologa ................................................................................................................ Pag. 6
Esquema de trabajo .................................................................................................................................................... Pag. 7
Toma de muestra ........................................................................................................................................................ Pag. 8
Preparacin de medios de cultivo ............................................................................................................................... Pag. 9
Mtodos de siembra .................................................................................................................................................. Pag. 10
Mtodos de incubacin ............................................................................................................................................. Pag. 15
Observaciones macroscpicas................................................................................................................................... Pag. 15
Observaciones microscpicas ................................................................................................................................... Pag. 17
Morfologa de las bacterias ....................................................................................................................................... Pag. 21
Identificacin bacteriana ........................................................................................................................................... Pag. 22
Tiras Multisustrato .................................................................................................................................................... Pag. 30
Antibiograma ............................................................................................................................................................ Pag. 31
Prctica de Virologa................................................................................................................................................. Pag. 36
Prctica de Micologa................................................................................................................................................ Pag. 41
Anlisis de alimentos ................................................................................................................................................ Pag. 56
Medios de cultivo...................................................................................................................................................... Pag. 59
Pruebas bioqumicas ................................................................................................................................................. Pag. 62
Supuesto prctico ...................................................................................................................................................... Pag. 72

NORMATIVA DE LAS PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA

- Las prcticas de Microbiologa e Inmunologa son obligatorias para todos los alumnos matriculados en la asignatura y deben ser superadas para poder acceder al examen final de
la misma.
- Se exceptan de esta norma aquellos alumnos que las hayan superado en el curso anterior en esta Facultad. Los alumnos que hayan cursado prcticas de Microbiologa en otras
Universidades debern presentar un certificado acreditativo que ser evaluado por el Departamento para juzgar si procede o no a su convalidacin.
- Los alumnos sern convocados mediante listas que se expondrn con la debida antelacin en el tabln de anuncios del Departamento (Pabelln de Sanidad Animal) y debern
venir provistos de bata de laboratorio y guin de prcticas, as como de dos artculos de
divulgacin, extrados de la prensa diaria reciente (peridicos o revistas que se puedan comprar en kioscos, y que no sean especficamente cientficos; tambin puede ser de Internet del
mismo tipo de publicaciones on-line).
- Las practicas transcurren a lo largo de dos semanas consecutivas. De martes a viernes, en las que se realizarn las enseanzas prcticas de correspondientes a la asignatura de
Microbiologa.
- Los horarios sern de maana para los alumnos que cursan estudios por la tarde y de
tarde para los que cursan estudios por la maana. La duracin de cada una de las sesiones
prcticas es variable, estimndose en unas 3 h.
- Es obligatoria la asistencia a todas las sesiones prcticas que integran cada grupo.
Las faltas debern ser debidamente justificadas y la ausencia en ms de una sesin supondr
el paso directo al examen final de prcticas.
- Una parte importante de las prcticas corresponder a la realizacin de una identificacin bacteriana de una muestra problema. Al finalizar la misma, el alumno deber entregar
al profesor de prcticas un informe sobre el proceso seguido, en el que se incluya la bibliografa consultada, y otros datos que considere de inters.
- La calificacin del alumno en lo que respecta a las prcticas de esta asignatura se basar en tres criterios: actitud del alumno a lo largo de las prcticas, conocimientos adquiridos,
e informe presentado.
- Los alumnos que no superen la evaluacin prctica podrn presentarse al examen final de prcticas que tendr lugar antes del examen final terico de la asignatura.
- Tendrn derecho al examen final de prcticas todos los alumnos de la asignatura que
por cualquier causa no las hayan superado con anterioridad.
- Excepcionalmente podrn repetir las prcticas voluntariamente aquellos alumnos que
no habiendo superado la prueba correspondiente a su grupo, as lo soliciten y sean informados
favorablemente por el Profesor responsable de su grupo.
- Los cambios de grupos de prcticas slo se admiten en las siguientes circunstancias:

*
*
*

Por razn de incompatibilidad con el horario laboral debidamente justificada y siempre que se haga constar con claridad en la ficha de la asignatura.
Por acuerdo con otra persona que deba tambin realizarlas pero en un turno diferente,
hacindolo constar igualmente muy claramente al rellenar la correspondiente ficha por
parte de ambas personas.
Por razones de enfermedad debidamente justificadas.

NORMAS Y REGLAS EN EL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGIA
Por escaso que sea el nivel de conocimientos que se posea de esta asignatura, cualquiera puede imaginarse fcilmente que en el trabajo cotidiano en un laboratorio de Microbiologa, uno de los problemas que hay que cuidar es el de las contaminaciones con microorganismos no deseables, ya que su presencia en un cultivo es origen, en el mejor de los casos, de
errores en las pautas de identificacin, cuando no atentan contra la seguridad del microbilogo y de su entorno. Por este motivo, se deben respetar y cumplir unas reglas esenciales:
A - Evitar la contaminacin del material a estudiar.
B - Evitar la contaminacin por el material a estudiar.
Las normas bsicas de actuacin se concretan en:
1.- Del microbilogo:
1.1 La prenda adecuada para trabajar en un laboratorio de Microbiologa es la bata
blanca, que debe estar siempre limpia y usarse slo en el interior de los laboratorios.
1.2 Normas generales de higiene:
* Limpieza de manos antes y despus del trabajo.
* Si la longitud de los cabellos es notable, stos debern estar recogidos.
1.3 Normas generales de comportamiento:
* El material, mobiliario y dems utensilios deben cuidarse con el mayor esmero.
* No se puede fumar, beber o comer en el laboratorio bajo ningn concepto.
* Hay que evitar desplazamientos intiles y movimientos bruscos.
2.- Del lugar de trabajo:
2.1 Cada alumno dispone de un puesto de trabajo en el que podr encontrar:
* Un papel de filtro que cubre el lugar de trabajo.
* Un mechero de gas emplazado en el centro. El mechero debe permanecer encendido durante la realizacin de los experimentos que requieran su utilizacin, apagndose cuando no sea necesario.
* Los instrumentos y elementos especficos para la realizacin de cada prctica
concreta.
3.- Del trabajo:
3.1 No se debe comenzar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones precisas.
3.2 Se deben preguntar siempre todas las dudas que aparezcan antes de realizar el trabajo.

3.3 La mayor parte de los instrumentos que se utilizan deben ser y permanecer estriles,
por lo cual se manejan siempre en una zona aproximada de unos 15 cm alrededor
de la llama del mechero encendido.
3.4 La esterilizacin de algunos utensilios (asas de platino, boca de los tubos, etc) se
consigue mantenindolos en posicin oblicua sobre la llama. Estas operaciones se
realizan siempre antes y despus de utilizar tales instrumentos.
3.5 No se debe dejar nunca el tubo o la placa abiertos ms tiempo del estrictamente necesario, para evitar una posible contaminacin del cultivo. Tampoco se debe depositar el tapn del tubo con el que estamos trabajando sobre la mesa, debindose
mantener siempre en la mano hasta el momento de tapar el tubo.
3.6 La organizacin del trabajo vara segn la prctica que se est realizando, pero en
general:
* Deben evitarse las precipitaciones.
* Deben evitarse riesgos de confusin etiquetando o marcando el material.
* Deben evitarse riesgos de contaminacin (evitar contacto de la boca con las
manos, evitar chupar objetos del laboratorio, etc.).
* Deben tomarse todas las precauciones posibles para evitar accidentes (cortaduras, quemaduras, etc.).
3.7 Despus del trabajo, tambin debe seguirse un plan ordenado.
* El material utilizado debe transportarse al lugar donde contine su procesamiento.
* El material y utensilios utilizados deben ser lavados y esterilizados para su
posterior uso o bien eliminarse previa esterilizacin si son de un solo uso.
* El puesto de trabajo debe quedar al final ordenado y limpio, tal como se encontr al inicio de la sesin.

MATERIAL DE LABORATORIO
El material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende
fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado; evidentemente, no se precisa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con un alto grado de especializacin
que en un laboratorio de Bacteriologa Clnica.
Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele encontrar en un laboratorio
mnimamente dotado.
A) Material de uso corriente:
* Material de vidrio o plstico que se usa para contener o medir: aqu se incluyen tubos de
ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc.,
todo ello de distintos tamaos y capacidades. Tambin incluimos las placas de Petri, los
portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de recuento, cestillos y cubetas para efectuar tinciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc.
* Material de siembra: constituido principalmente por asas y filamentos de platino, asas de
Drigalski y pipetas estriles.
* Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estriles, tubos y frascos
estriles, jeringas y agujas, trcares, cnulas, catteres y material de diseccin.
B) Aparatos productores de calor:

Se utilizan con diversas finalidades:

* Para esterilizacin: autoclave (calor hmedo), horno Pasteur (calor seco) y mechero Bunsen (esterilizacin por calentamiento directo).
* Para incubacin: estufas, baos de agua, de aceite o parafina y de arena.
C) Aparatos productores de fro:
* Refrigeradores: son indispensables para conservar los medios de cultivo, productos biolgicos y patolgicos, as como mantener la supervivencia de algunos mo. Su temperatura oscila alrededor de los 4C.
* Congeladores: alcanzan temperaturas entre -20 y -70 C y son indispensables para conservar determinados productos biolgicos (sueros, clulas, mo).
* Neveras porttiles: para trasladar muestras al laboratorio en condiciones de refrigeracin.
D) Material ptico:
Es de capital importancia en el laboratorio ya que permite la observacin de los mo..
* Microscopios: en su distintas versiones (campo claro, campo oscuro, contraste de fases,
fluorescencia).
* Lupa estereoscpica: permite observar colonias bajo distintas condiciones de iluminacin.
E) Otro tipo de material y aparatos:
* Agitadores y homogeneizadores.
* Centrfugas.
* Balanzas.
* Liofilizadores.
* pHmetros.
* Espectrofotmetros.
* Destiladores, etc.

OBJETIVO DE LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA

Las clases prcticas de Microbiologa tienen como objetivos bsicos los siguientes:
- Familiarizar al alumno con las normas generales de trabajo en el laboratorio.
- Iniciarle en el uso de los elementos y medios propios de la asignatura.
- Ensearle las tcnicas bsicas empleadas para el estudio de microorganismos.

Aislamiento e identificacin bacteriana.

Preparacin e interpretacin de antibiogramas.
Anlisis de microorganismos en alimentos.
Recuento de bacterias
Estudio e identificacin de hongos.
Observacin de la patogenicidad celular de virus.

ESQUEMA DE TRABAJO
A) BACTERIOLOGA
1) Anlisis clnico.
- Recogida de muestras:
* Condiciones de esterilidad
* Emisin de informe
* Envo rpido al laboratorio
- Anlisis
- Aislamiento:
* Medios de cultivo slido
* Siembra por agotamiento
* Incubacin:
* 37C
* 24/48 h
* Aerobiosis/anaerobiosis
- Identificacin:
* Anlisis macroscpico de colonias
* Anlisis microscpico:
- Formas y dimensiones
- Tincin de Gram
- Estructuras especiales
* Pruebas bioqumicas
* Pruebas serolgicas
* Identificacin por comparacin de datos
* Identificacin por tiras multisustrato
2) Antibiograma
* Preparacin
* Interpretacin
3) Anlisis de microorganismos en alimentos
B) MICOLOGIA
* Obtencin de cultivos puros
* Pautas de identificacin
D) VIROLOGA
* Efecto citoptico.

TOMA DE MUESTRA
Bajo la denominacin de muestra se incluye cualquier elemento orgnico, natural o
patolgico, procedente del animal vivo, del cadver, o de su entorno, que sea susceptible de
contener microorganismos. Son muestras por tanto, lquidos fisiolgicos (sangre, orina, saliva, heces), lquidos patolgicos (exudados, pus, esputos, vmitos) y slidos como biopsias o
piezas procedentes del cadver; tambin son muestras los alimentos, camas y el propio ambiente en el que se encuentran situados los animales.
Recogida de muestras:
Las muestras deben ser recogidas con la mxima asepsia con el fin de no introducir en
ellas microorganismos ajenos al proceso. Esta asepsia se refiere:
* Al proceso y condiciones de la toma de muestras, que debe
evitar las contaminaciones.
* A los utensilios empleados, que deben estar estriles.
* A los recipientes destinados a la recogida y envo al laboratorio, que igualmente deben estar estriles.
Una vez recogidas, las muestras se deben enviar al laboratorio con la mayor rapidez
posible.
Toda muestra debe ir acompaada de un informe en el cual, de forma ordenada y
pormenorizada, se expondrn todos aquellos datos que tengan relacin con la misma y que
puedan ser tiles para orientar al laboratorio en su labor analtica. Estos datos suelen ser de tipo clnico (sintomatologa, lesiones, tratamientos efectuados) y epidemiolgicos (n de animales afectados, n de bajas, edad, sexo, tipo de alimentacin, sistema de explotacin, vacunaciones, enfermedades ms frecuentes en la zona, etc.).
En el momento de su recepcin en el laboratorio, toda muestra debe ser convenientemente identificada a travs de un nmero de orden y de su inclusin en el libro de anlisis.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Tipos de medios:
a) Por su objetivo:
- Aislamiento
- Enriquecimiento
- Identificacin
- Conservacin
- Recuento
b) Por su especificidad para los microorganismos:
- Comunes
- Selectivos
c) Por su composicin:
- Naturales o empricos
- Sintticos
- Semisintticos
d) Por su estado fsico:
- Slidos: por el empleo de agentes solidificantes.
* Agar:1,5-2 % medios slidos
0,2 % medios semislidos
* Gelatina.
- Lquidos
e) Por su forma de almacenamiento y empleo:
- En placa
- En tubo:* lquido
* slido vertical
* slido en pico de flauta
2. Material necesario:
- Preparacin: balanza, matraz, vaso de precipitados, esptula, probetas, tubos, tapones.
- Esterilizacin: autoclave/filtracin.
3. Mtodo de preparacin:
- Pesar las cantidades fijadas para cada medio de cultivo.
- Hidratar con agua destilada hasta el volumen preciso.
- Ajustar el valor del pH.
- Homogeneizar por calentamiento para una buena solubilizacin de los componentes.
- Esterilizacin.
* Por autoclave: material que no se altere por
** Caramelizacin: ciertos azcares.
** Precipitacin: ciertos minerales.
** Desnaturalizacin: ciertas protenas.
* Por tyndalizacin: material que se altere a temperaturas de autoclave.
* Vapor fluente.
* Filtracin: ** Filtros adaptables a jeringuillas.
** Sistemas de filtros Millipore.
4. Medios incompletos:
Son aqullos a los que hay que aadir algn otro componente tras la esterilizacin (normalmente es un componente sensible al calor); p.e., yema de huevo, sangre, etc..

METODOS DE SIEMBRA
El primer paso a seguir en la identificacin de un microorganismo es proceder a su obtencin en cultivo puro, pues es obvio que las reacciones de cultivos mixtos no podrn ser
usadas en la identificacin.
El mtodo ms comn de obtencin de un cultivo puro consiste en tomar una sola colonia del medio de aislamiento y proceder a su siembra por agotamiento.
Pauta general:
1. Coger el asa de platino como se indica en la figura 1.
2. Flamear el asa de platino hasta que tome color rojo. Flamear tambin el resto del vstago
(figura 2).
3. Toma de muestra
3.I Si se parte de una muestra lquida (o cultivo lquido):
3.I.a. Agitar el tubo (figura 3).
3.I.b. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4).
3.I.c. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5).
3.I.d. Introducir el asa en el tubo de forma que el extremo quede justo por debajo de la superficie (figura 6).
3.I.e. Esperar a que deje de burbujear y extraer el asa. La pelcula formada estar cargada de microorganismos.
3.I.f. Volver a flamear el tubo.
3.I.g. Poner el tapn.
3.II. Si se parte de un cultivo slido:
3.II.a. Enfriar el extremo del asa en una zona del medio de cultivo donde no
haya crecimiento.
3.II.b. Tomar una colonia bien aislada.
4. Siembra en el medio de cultivo.
4.I. Siembra en medio lquido:
4.I.a. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4).
4.I.b. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5).
4.I.c. Introducir el extremo del asa, previamente cargada en el tubo con medio
lquido y se agita con energa para desprender los microorganismos.
4.I.d. Volver a flamear el tubo.
4.I.e. Poner el tapn.
4.II. Siembra en medio slido:
4.II.a. Tomar una placa de medio slido no utilizada y por tanto estril.
4.II.b. Colocarla sobre la mesa de trabajo de forma invertida de tal forma que
se encuentre el medio de cultivo en la parte superior. De esta forma se
puede destapar la placa con una sola mano.
4.II.c. Una vez destapada, se apoya el extremo del asa cargada con microorganismos sobre la superficie y se efecta la siembra.
5. Flamear el asa hasta que se ponga incandescente.
6. Rotular las placas o los tubos de forma que se puedan identificar.
- Tipos de siembras:
a) Siembra por agotamiento: La finalidad de esta siembra es obtener colonias aisladas del microorganismo o microorganismos sobre el medio de cultivo slido. Consiste en

desplazar el asa de platino sobre la superficie del medio slido siguiendo cualquiera de los siguientes procedimientos:
* En zig-zag: consiste en desplazar el asa por el medio haciendo un movimiento
en forma de zeta desde un borde de la placa hacia el opuesto. Cuando se llega
al centro de la placa, se levanta el asa y se repite el movimiento empezando por
el otro extremo de la misma (figura 7). Este tipo de siembra tambin se puede
hacer en tubo con medio slido en pico de flauta.
* En estras: con el asa cargada se trazan dos o tres lineas tangenciales en un
borde de la placa; se flamea el asa, se enfra en una zona no sembrada y de
nuevo se trazan dos o tres estras que crucen a las anteriores; este procedimiento se repite hasta que se completa la superficie de la placa (Figura 7).
b) Siembra en masa: primero se aade un volumen conocido de suspensin de microorganismos en una placa estril; despus se aaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido
a 45C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos circulares y se deja solidificar.
c) Siembra en superficie: sobre una placa con medio solidificado se deposita una
cantidad medida de suspensin de microorganismos y se extiende de forma uniforme con un
asa de Drigalski (figura 8).
d) Siembra por picadura: se utiliza el filamento de platino que se introduce de forma
vertical en un tubo con medio slido (figura 9).
e) Siembra por inundacin: sobre una placa con medio solidificado se vierte una
suspensin densa de microorganismos de forma que "se inunde" toda la placa. Se espera unos
15 minutos para que se adsorban los microorganismos y se elimina el lquido restante guardando condiciones de esterilidad.

TCNICAS DE AISLAMIENTO: TOMA DE MUESTRAS

Figura 7.- Tcnicas de aislamiento: agotamiento de asa en placa

A.- PASOS SUCESIVOS DEL AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

1. Estras

3. Estras

2. Flameado
Enfriar

7. Estras

5. Estras

4. Flameado
Enfriar

6. Flameado
Enfriar

B.- OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS TRAS LA INCUBACIN

Obtencin de colonias aisladas

OTROS SISTEMAS DIFERENTES DE AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

METODOS DE INCUBACION
1. Temperatura:
as
* Bacterias patgenas: 37C; excepcionalmente otras T .
* Hongos: ver prctica correspondiente.
2. Atmsfera de incubacin:
* Aerobiosis: trasladar las placas a la estufa e incubarlas de forma invertida (tapa abajo; medio inoculado arriba). Los tubos se incuban siempre en posicin vertical.
* Microaerofilia:
** Mtodo de la vela: en la jarra se introduce una vela encendida que va consumiendo el oxgeno acumulado tras cerrar la jarra.
** Estufa de CO2: permite regular la cantidad de CO2 en la atmsfera de incubacin.
* Anaerobiosis (Mtodo de GasPak): en una jarra de anaerobiosis junto a las placas o
tubos se introduce un preparado comercial que produce H2, el cual se combina con el
O2 y produce agua.

OBSERVACIONES MACROSCOPICAS
A) Crecimiento en medio slido: las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal
rapidez que en 18 - 24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre medios slidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un
nico tipo de microorganismo.
Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista o con la
ayuda de una lupa. Los caracteres ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters
en la caracterizacin son los siguientes:

1. Forma: Puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada

2. Tamao: Se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm.
3. Elevacin: Vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa,
pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresin central).
4. Forma del borde: Puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso,
y rizado.
5. Superficie:
* Lisa
* Rugosa
* Mate
* Brillante
* Transparente
* Opaca
6. Color:
Presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio.
7. Capacidad de emulsin en agua:
* Forma una suspensin uniforme
* Forma una suspensin grumosa
* No se emulsiona
B) Crecimiento en medio lquido: tiene inters los siguientes aspectos:
1. Cantidad de crecimiento:
* Ninguna
* Escasa
* Moderada
* Abundante.
2. Crecimiento en la superficie:
* Positivo
* Negativo
* Formacin de un anillo
* Pelcula superficial que se desintegra o no al agitar
3. Turbidez:
* Uniforme
* Floculante
* Negativa
4. Depsito en el fondo del tubo:
* Ausente
* Granular
* Floculante
* Viscoso
* Se desintegra o no al agitar

OBSERVACIONES MICROSCOPICAS
El ndice de refraccin de las bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto
son difciles de ver al microscopio. En cambio son qumicamente muy diferentes; estas diferencias son las que permiten distinguir las bacterias por medio de TINCIONES. Las tinciones
son de dos tipos:
a) Tinciones simples: Son aqullas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma,
el tamao y la ordenacin de las bacterias.
b) Tinciones diferenciales: Son aqullas que utilizan dos o ms reactivos. Con ellas
se pueden observar diferencias entre clulas o partes de clulas. Las ms importantes son:
1. Tincin de Gram.
2. Tincin de microorganismos cido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen).
3. Tincin de estructuras.
- Tincin de esporos.
- Tincin de flagelos.
- Tincin de cpsulas.
Los principales pasos para realizar una tincin para su posterior examen microscpico
son:
1. Extensin:
* A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en el
portaobjetos y se extiende con movimientos circulares (figura 10).
* A partir de una colonia en medio slido. Con el asa de platino se toma una gota de agua
que se deposita en el portaobjetos; despus se toma una colonia, se mezcla y se extiende
como antes (figura 11).
2. Secar: dejando la preparacin al aire hasta la evaporacin
3. Fijacin:
Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la llama hasta que se
seque, sin calentar demasiado (figura 12). El calor excesivo alterara la forma normal y la estructura de los microorganismos que se van a teir. El portaobjetos debe notarse caliente, pero
no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano.
4. Tincin: En funcin del objetivo existen distintos procedimientos de tincin.

Tincin de Gram
Cuando se emplea este mtodo de tincin, debido a diferencias en la pared celular, las
bacterias se dividen por lo general en dos grandes grupos, segn retengan o no el colorante
primario ("GRAMPOSITIVAS" o "GRAMNEGATIVAS" respectivamente) tras sufrir la accin de un decolorante.
En esta tcnica se emplean cuatro reactivos diferentes:
METODO:

* Un colorante primario (violeta de genciana) durante tres minutos.

* Lavar con agua.
* Un mordiente (lugol) durante dos minutos.

* Lavar con agua.

* Un agente decolorante (alcohol-acetona) durante diez segundos.
* Lavar con agua.
* Un colorante de contraste (safranina) durante treinta segundos.
* Lavar con agua y secar sobre un papel de filtro.
(figuras 13, 14 y 15)
Las clulas que retienen el colorante primario se denominan "GRAMPOSITIVAS"
(color violeta) y las que se decoloran con el alcohol-acetona y se tien posteriormente con la
safranina reciben el nombre de "GRAMNEGATIVAS" (color rojizo).
* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (punto 4).

Tincin de esporos
Las bacterias de algunos gneros forman endosporos que son estructuras muy resistentes a las altas temperaturas, a la falta de humedad y a la accin de productos qumicos. Los
endosporos son tambin resistentes a la penetracin de colorantes utilizados en Bacteriologa
y por tanto en una extensin teida segn el mtodo de Gram se pueden distinguir como zonas incoloras en el interior de las formas vegetativas de las bacterias Gram positivas. Sin embargo, una vez teidas su decoloracin suele ser difcil.
METODO (Bartolomew y Mittwer)
* Se prepara una extensin en la forma habitual y se fija intensamente al calor para lo
cual se pasa unas veinte veces por la llama.
* Se cubre la extensin durante 10 minutos con solucin acuosa saturada de verde malaquita, calentando hasta la emisin de vapores.
* Se lava con agua y se aade safranina durante 30 segundos, se lava con agua y se seca
con papel de filtro.
* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin
Segn este mtodo de tincin, los endosporos se tien en verde, pero el resto de la clula (o la
clula que no posee endosporos) se tie de rojo dbil.

Tincin de cpsulas
Los mtodos ordinarios de tincin no colorean la cpsula, aunque a veces se puede observar una zona clara rodeando al organismo teido. Para demostrar la presencia de cpsulas
se emplea generalmente la tincin negativa con tinta china o nigrosina.
METODO
* Depositar una gota de tinta china o nigrosina sobre un portaobjetos.
* Mezclar con ella una colonia procedente de un medio slido, con ayuda del asa de platino.
* Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas de aire. Presionar con
fuerza entre papel de filtro para eliminar los restos de tinta china que puedan enturbiar
la observacin.
* Examinar al microscopio con el objetivo de inmersin

Las bacterias con cpsula aparecen rodeadas de una zona clara destacando del fondo gris oscuro. Las bacterias no capsuladas no presentan esta zona clara.
5. Observacin al microscopio con el objetivo de inmersin
METODO
* Depositar en la preparacin una pequea gota de aceite de inmersin. De esta forma
se reduce la refraccin de los rayos de luz al pasar del portaobjetos al aire, consiguindose que un mayor nmero de ellos penetren en el objetivo (figura 16).
* Colocar el portaobjetos en la platina.
* Elevar el condensador del microscopio al nivel de la platina para lograr el mximo de
luz.
* Bajar el objetivo de inmersin hasta que contacte con la gota de aceite y enfocar hasta
observar la morfologa del microorganismo.

Rayos no refractados
Aceite de inmersin

Rayos de luz refractados

Aire Preparacin

MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

Las bacterias presentan una amplia diversidad de tamaos y de forma muy general
pueden aparecer bajo la luz del microscopio ptico o electrnico con morfologa esfrica (cocos), alargada (bacilos), y espiral (espiroquetas).
Los cocos libres aparecen como clulas esfricas aisladas, en pares como DIPLOCOCOS, en cadenas como ESTREPTOCOCOS, o dependiendo de los planos de divisin, en tetradas o en grupos arracimados.
Los bacilos pueden variar considerablemente en longitud desde los que son muy cortos, a veces denominados COCOBACILOS, hasta los bacilos largos que varan en longitud de
dos a diez veces su dimetro. Los extremos de los bacilos pueden ser suavemente redondeados, o cuadrados. Las largas hileras aisladas se conocen como FILAMENTOS. Los bacilos
bacterianos fusiformes, que aparecen en la cavidad bucal e intestinal, son aguzados en ambos
extremos.
Los bastones curvos, o ESPIRILOS, varan desde microorganismos pequeos, en forma de coma, o levemente helicoidales con una sola curvatura, o en forma de espiroquetas ms
largas y sinuosas.
a-e: cocos

FIGURA 17: MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

a: cocos arracimados
b-c: diplococos
d: cocos en cadena
e: cocos en ttradas

f: cocobacilos
g-i: bacilos g: bacilos aislados
h: bacilos en cadenas
i: bacilos aislados, en empalizada y formando ngulos
j-k: espirilos

IDENTIFICACION BACTERIANA
Los procedimientos para llevar a cabo la identificacin bacteriana van desde los simplemente descriptivos (morfologa y tincin), pasando por las pruebas bioqumicas simples
para deteccin de productos metablicos o de una determinada reaccin enzimtica, llegando
hasta tcnicas muy sofisticadas como puede ser el clculo del porcentaje G+C en bacterias o
el empleo de sondas de ADN.
Un proceso exhaustivo de identificacin bacteriana incluira los siguientes pasos:
1 Caractersticas macroscpicas.
2 Caractersticas microscpicas.
3 Condiciones de crecimiento.
4 Propiedades bioqumicas.
5 Susceptibilidad a los antibiticos.
6 Estructura antignica (serotipia) y fagotipia.
7 Composicin qumica.
8 Produccin de bacteriocinas.
9 Patogenicidad.
10 Composicin del ADN.
Las pruebas bioqumicas nos indican una serie de caractersticas metablicas que, en
conjunto, nos permitirn diferenciar unas bacterias de otras). Existe un gran nmero de estas
pruebas, por lo que en un problema concreto nos decantaremos por la realizacin de una u
otra prueba bioqumica basndonos en:
* Origen de la cepa: de dnde la hemos aislado.
* Condiciones bajo las que ha sido aislada.
* Morfologa.
* Tincin, especialmente la de Gram.
* Posibilidad de formacin de esporos.
* Posibilidad de formacin de cpsula.
Segn los resultados obtenidos de la observacin de estos parmetros, una vez consultada la bibliografa sobre taxonoma bacteriana, el amplio espectro bacteriano, va a quedar
restringido a unos pocos gneros, por lo que el siguiente paso ser realizar las pruebas bioqumicas que nos ayuden a quedarnos con uno solo de ellos, y posteriormente llegar a la determinacin de especie.
Es muy importante comprender que estas pruebas no han sido elegidas al azar, sino
siguiendo una pauta detallada con objeto de escoger aquellas que nos van a llevar a la
identificacin de especie lo ms rpidamente posible.
Son muchas las pruebas bioqumicas descritas, y es evidente que en cada caso intentaremos realizar las menos posibles, siempre y cuando stas nos lleven a una completa y segura
identificacin.
En la realizacin de pruebas bioqumicas hay que tener en cuenta que no todos los
miembros de una determinada especie bacteriana reaccionarn de la misma manera: Se producen variaciones, y esto habr que recordarlo cuando se interpreten los cuadros para identificacin de bacterias. Al comparar los resultados obtenidos con un grupo tabulado de resultados
patrn, se debe utilizar el criterio de "aproximacin mxima": si un microorganismo se desva
de lo normal en uno o dos resultados de una batera de pruebas segn la tabla patrn, ello no
supone que necesariamente haya que descartarlo de esa especie.

Los resultados definidamente positivos (+) o negativos (-) son aquellos en que como
mnimo el 90% de las cepas de esa especie reaccionan de esa manera, mientras que los Variables (V) se refieren al hecho de que un 11 a 89% pueden hacerlo en uno u otro sentido, por lo
que no debe confiarse en stos para los fines de identificacin.
Las tablas siguientes son un resumen de las que se pueden encontrar en cualquier manual de identificacin bacteriana y que nos servirn para identificar los microorganismos utilizados durante la primera semana de prcticas as como los empleados en el supuesto prctico.
Ferm. Gluc. +: G. Staphylococcus (Tabla I)
CATALASA +

Ferm. Gluc. -: G. Micrococcus (Tabla I)

COCOS
BACTERIAS GRAM +

ClNa 6% + : G. Enterococcus (Tabla II)

CATALASA -

ClNa 6% - : G. Streptococcus y Lactococcus (Tabla II)

Regulares/pequeos: G. Listeria (mvil a 22C, inmvil a 37C) (Tabla VII)

MVILES
CATALASA +

INMVILES

BACILOS

MVILES

Regulares/grandes: G. Bacillus (Tabla V)

G. Corynebacterium (Tabla III)

G. Clostridium (Tabla VI)

CATALASA INMVILES

COCOS

G. Erysipelothrix (Tabla IV)

NO fermentativos, inmviles: G. Neisseria / Brahamella (Tabla VIII)

No fermentativos

OXIDASA+

Bacilos/cido de glucosa: G. Pseudomonas (Tabla IX)

Cocobacilos/no cido de glucosa G. Bordetella (Tabla X)

OXIDASA +

Mviles/curvados: F. Vibrionaceae (Tabla XII)

CATALASA+

Inmviles/cocobacilos: G. Pasteurella / Mannheimia (Tabla XIII)

G. Escherichia

BACILOS

G+ L+ Gas+ SH2-

G. Klebsiella
G. Enterobacter

Fermentativos

G. Yersinia

G. Salmonella
OXIDASA (CATALASA +)
F. Enterobacteriaceae (Tabla XIV)

KLIGLER

BACTERIAS GRAM -

OXIDASA G. Acinetobacer (Tabla XI)

G+ L- GasV SH2-

G. Shigella
G. Enterobacter
G. Yersinia

G. Salmonella
G+ L- GasV SH2+

G. Proteus
G. Edwarsiella

G+ L+ Gas+ SH2V+

G. Citerobacter

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

COCOS
bacilos)
(coco-

24

Crecimiento
MacConkey
Negativo
Positivo
Negativo

BACILOS

COCOS

BACTERIAS GRAS POSITIVAS

Positivo

Metabolismo

Gneros

Oxidativo
Cat+/Ox+
Oxidativo o no reactivo
Cat.+/OxOxidativo
Cat+/Ox+
Fermentativo
Cat+/Ox+
No reactivo
Cat+/Ox+

Neisseria spp.
Branhamella spp.
Acinetobacter spp.

No reactivo
Cat+/-/Ox+/No reactivo
Cat+/OxOxidativo
Cat+/Ox+
Fermentativo
Cat+/Ox+
Fermentativo
Cat+/-/Ox+/Fermentativo
Cat+/OxNo reactivo
Cat+/Ox+
Oxidativo
Cat+/Ox+/Fermentativo
Cat+/OxFermentativo
Cat-/OxNo reactivo
Cat+/OxOxidativo
Cat+/OxFermentativo
Cat+/OxFermentativo
Cat-/Ox-

No reactivo
Cat+/Ox-

Flavobacterium spp.
Pasteurella spp. (la mayora)
Brucella spp.
Haemophilus spp.
Pasteurella anatipestifer
Taylorella equigenitalis
Moraxella spp.
Campylobacter spp.
Francisella tularensis
Pseudomonas spp. (la mayora)
Burkholderia cepacia
Aeromonas spp.*
Pasteurella heamolytica*
Plesiomonas spp.*
Actinobacillus spp.
Enterobacteriaceae*
Pasteurella caballi
Bordetella spp.*
Alcaligenes spp.*
Micrococcus spp.
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Rhodococcus equi
Nocardia asteroides (algunos)
Bacillus spp.* (algunos)
Actinomyces viscosus
Bacillus spp.* (algunos)
Corynebacterium spp.
Listeria spp.*
Actynomyces spp.** (la mayora)
Actinomyces pyogenes
Erysipelothrix spp.
Clostridium spp.**/*
Eubacterium spp.**
Lactobacillus spp.
Rhodococcus equi

Cat=catalasa; Ox=oxidasa; +: reaccin positiva; -: reaccin negativa; V= variable; *=mvil; **=anaerobio

25

TABLA I. FAMILIA Micrococcaceae

Gnero Staphylococcus
Nitratos
Motilidad
O/F
glucosa
Manitol
Maltosa
Coagulasa
V.P.
DNAsa
Lecitinasa
Ureasa
O

Gnero Micrococcus

S. intermedius S. aureus S. simulans S. epidermidis M. luteus M. roseus M. varians

+
+
+
+
V
+
+
V
+
F

V
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
V

+
+ dbil
+

+
+
V
+

+
V

+
-

+
V
+

: Oxidativo; : Fermentativo;

V+

: Mayora de cepas positivas; : Variable.

TABLA II. Gneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus

Hemlisis CAMP

S. agalactiae
S. dysgalactiae
S. uberis
S. suis
S. bovis
L. garvieae
L. piscium
E. faecalis
E. faecium
E. hirae

, ,no
, no
, no
no
, no

No
,no
, no
No

+
-

Hidrlisis
Esc. Hipur. Arg.
+
+
+
+
+
+
+
ND
+
+
+
+
ND
+
(+)
+
+
+
+
+
+

ClNa
6,5%

V.P.

+
+
+

+
+
+
+
ND
+
+
+

Acidificacin
Sal.
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+

Raf.
+
+
D

Sorb.
+
+
-

Lac. Man.
V
+
+
+
+
+
V
V
+
V
V
+
+
+
+
+
(+)
+
-

hemlisis = incompleta; hemlisis = completa; Esc: esculina; Hipur: hipurato; Arg: arginina; V.P.
V+
Voges Proskauer; Sal: salicina; Raf: rafinosa; Sorb: sorbitol; Lac: lactosa; Man: manitol; Rib: ribosa; :
VV
Mayora de cepas positivas; : Mayora de cepas negativas; : Variable.

TABLA III. GENERO Corynebacterium

C. pseudotuberculosis
C. renale
C. bovis
C. urealyticum

Nit.

Ureasa

Esculina

V
-

+
+
V
+

Fermentacin
Gluc.
+
+
+
V
-

Sac.
-

Manit.
-

Xyl.
-

Malt.
+
-

Rib.
+
+
-

Nit. = reduccin nitratos; Glu = glucosa; Sac: sacarosa; Manit: manitol; Xyl: xylosa; Malt: maltosa; Rib:
V+
VV
ribosa; : Mayora de cepas positivas; : Mayora de cepas negativas; : Variable.

Rib.
+
+
+
ND
+
+
+
+
+

26

TABLA IV. GNERO Erysipelothrix

E. inopinata
+
V
+
-

Lactosa
Ribosa
Trehalosa
Arabinosa
V+

E. rhusiopathiae
+
+

E. tonsillarum
+
+
V

: Mayora de cepas positivas

B. anthracis

B. cereus

B. megaterium

B. subtilis

B. pumilus

B. licheniformis

B. alvei

B. brevis

B. polimixa
B. stearothermophilus
B. coagulans

TABLA V. GNERO Bacillus

Motilidad

V+

V+

Nitratos

V.P.

O/F

Lecitanasa

Arabinosa

Xilosa

Manitol

Crecimiento Anaerobiosis

: Oxidativo; : Fermentativo;

V+

: Mayora de cepas positivas; : Variable.

TABLA VI. GNERO Clostridium

C. tetani
Motilidad
Indol
Lecitinasa
Nitratos
Esculina
Hemlisis
Morf.esporos

V
V
+
RT

C. botulinum tipos

C. perfringens
+
+
+
V
V
OS

II

III

V
+
+
OS

+
+
OS

V
V
V
+
OS

RT: Redondos/Terminales; OS: Ovales/Subterminales;

V
negativas; : Variable.

V+

C. difficile
+

V
+
OS
V-

C. septicum
+

V
+
V
+
+
OS

: Mayora de cepas positivas; : Mayora de cepas

27

TABLA VII. GENERO Listeria

L. monocytogenes
L. ivanovii
L. seeligeri
L. innocua
L. welshimeri
L. grayi
C

Test de CAMP
Hemlisis R. equi S .aureus
C
+
+
+
P
++
+
c
+
+
+
P

Reduccin

Acidificacin de azcares

Nitratos
+/-

D-Manitol
+

L-Ramnosa
+
+/+/-/+

D-Xilosa
+
+
+
-

: En forma de cerilla. : En forma de pala. : En forma de cerilla, dbil.

cb

M. lacunata

M. phenylpruvica

B. catarrhalis

B. ovis

B. cuniculi

N. canis

N. flavescens

N. lactamica

Morfologa
Hemlisis
MacConkey
Oxidasa
Catalasa
Red. Nitratos
Ureasa

M. bovis

TABLA VIII. GNEROS Moraxella, Brahamella y Neisseria

cb
+
V
+
+
V
-

cb
+
+
+
-

cb
+
V
+
+
+
V
+

c
+
+
+
-

c
+
+
+
+
-

c
+
+
-

C
+
+
+
-

c
+
+
-

c
+
+
-

: Cocos. : Cocobacilos.

V+

: Mayora de cepas positivas.

TABLA IX. GNEROS Pseudomonas y Burkholderia

MacConkey
Nitratos
Citrato
Lecitinasa
Pigmentacin
Acidificacin:
Maltosa
Glucosa
Lactosa
Manitol
V-

P. aeruginosa

P. fluorescens

P. putida

B. cepacia

crece
+
+
verde

crece
+
+
verde

crece
V

crece
V
+
No relevante
no

+
V

+
+

+
-

+
+
+
+

: Mayora de cepas negativas; : Variable.

TABLA X. GNERO Bordetella

Movilidad
MacConkey
Hemlisis
Reduccin nitratos
Ureasa
Oxidasa

B. avium
+
+
+

B. bronchiseptica
+
+
+
+
+
+

B. parapertussis
+
+
-

TABLA XI. GNERO Acinetobacter

Hemlisis
Citrato
cido de glucosa
Crecimiento 41-44 C

A. baumanni
+
+
+

A. calcoaceticus
+
+
-

A. lwolffii
-

TABLA XII. FAMILIA Vibrionaceae

ClNa 6%
Sensibilidad O129
Motilidad
Lisina-DC
Ornitina-DC
Nitratos
Indol
Arabinosa
Sacarosa
V+

Gnero Vibrio
+
+
V
V. fluvialis
V. vulnificus
+
+
+
V
+
+
+
+
+
V
+
V
V-

Gnero Aeromonas
resistente
A. hydrophila
A. salmonicida
+
+
V
+
+
+
+
+
-

: Mayora de cepas positivas; : Mayora de cepas negativas

Gnero Plesiomonas
sensible
P. shigelloides
+
+
+
+
+
-

TABLA XIII. GNEROS Pasteurella y Mannheimia

MacConkey
Indol
Ureasa
ONPG
Ornitina-DC
-hemlisis
Acidificacin:
Manitol
Rafinosa
Lactosa
V+

P. multocida

P. pneumotropica

M. haemolytica

No crece
+
V
+
V
-

No crece
+
+
+
+
-

Crece
+
V
+

+
+
V

+
+
V
+
V

V
V

V-

: Mayora de cepas positivas; : Mayora de cepas negativas

TABLA XIV. FAMILIA Enterobacteriaceae

V+

V-

+
+
V
+
V
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
V ND
+
-

: Mayora de cepas positivas; : Mayora de cepas negativas; : Variable;

ND

+
V
+
+
+
-

+
+
+
+
-

:No determinado

V
+
+
+
+

Y. ruckeri

Y. enterocolitica

Yersinia

P. vulgaris

Proteus

P. mirabilis

S. gallinarum

+
+
V +
+
+
+ +
+ +

K. pneumoniae

K. ozaenae

+
+
V
V
+
+
+

S. arizonae

K.oxytoca

- V - V
+
- V+ +
- V V + +
+
+
V V
+ + +
+
+
- V
+
+
+ +
+
+ + + +
V + V + +
+
+
+ +
+

Salmonella

Klebsiella

E. coli

E. sakazakii

+
+
+
V
+
+
+
+

E. claocae

C. freundii

E. agglomerans

Escherichia

C. diversus
Indol
Rojo M
V.P.
Citrato
Urea
ADH
Lisina-DC
Ornitina-DC
Movilidad
Lactosa
ONPG

Enterobacter

E. aerogenes

Citrobacter

+
V
V
+
+
V

TIRAS MULTISUSTRATO
Dentro de las tiras multisustrato, el sistema API es un mtodo rpido de identificacin
microbiana mediante el empleo de pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas.
Cada tira API consta de un nmero variable de microtubos que contienen los sustratos
deshidratados. Existen varios tipos de sistemas API compuestos por diferentes combinaciones
de pruebas bioqumicas, con el objeto de identificar correctamente los diversos grupos microbianos. Los tipos de sistemas API ms utilizados son:
* API 20 E. Identificacin de Enterobactiaceae y otros Gram negativos.
* API 20 A. Identificacin de bacterias anaerobias.
* API Strep. Identificacin de Streptococcus.
* API Staph. Identificacin de Staphylococcus.
* API 50 CH. Estudio del metabolismo de hidratos de car-bono.
* API Z. Deteccin de Salmonella, Shigella y Yersinia.
* API S. Deteccin de enterobacterias.
* API 20 EC. Deteccin de enterobacterias coliformes.
* API 20 NE. Identificacin de Gram negativos no enterobacterias.
* API 20 C AUX. Identificacin de levaduras.
* API 20 B. Deteccin de bacterias hetertrofas anaerobias.
* API ZYM. Estudio de actividades enzimticas.
* API 10 M 5 FC. Deteccin de levaduras.

Los componentes del sistema API son:

* Tira o galera con pruebas bioqumicas.
* Cmara de incubacin.
* Medio de suspensin. Unicamente se provee en los casos en que se requiere
un medio especial, en el resto la suspensin se realiza en solucin salina estril.
* Hoja de resultados.
Deben conservarse en refrigeracin (2-8C) y utilizarse antes de la fecha de caducidad
indicada en el envase.
1.
2.
3.

4.

5.

6.

Modo de empleo
Preparacin de la cmara de incubacin. Se aade agua (unos 5 ml) en los alveolos de
la base de la cmara, con el fin de proporcionar una atmsfera hmeda.
Preparacin del inculo. Tomar colonias del microorganismo a analizar y diluirlas
homogneamente en un medio de suspensin mediante agitacin.
Inoculacin de la tira. Se utilizarn micropipetas o puntas de pipeta estriles. Deben
llenarse los microtubos de cada prueba bioqumica, evitando la formacin de burbujas.
En caso de que el nombre abreviado de la prueba aparezca rodeado por tres barras
(p.ej. |CIT ), tambin debe llenarse la cpula del microtubo, y si aparece subrayado
(p.ej. ADH), la cpula debe completarse con aceite de parafina o de vaselina estril.
Incubacin. Introducir la tira en la cmara de incubacin. La temperatura y condiciones de aerobiosis o anaerobiosis dependern del anlisis. El tiempo normal de incubacin es de 18-24 horas, en caso de que las reacciones sean dudosas debe reincubarse
durante otras 24 horas.
Lectura de resultados. Se aadirn reactivos en las pruebas que necesiten revelado. Se
anotarn en la hoja de resultados las pruebas positivas y negativas (en las hojas hay
algunas pruebas que deben hacerse aparte, p.ej. catalasa, motilidad, oxidasa, crecimiento en agar McConkey, etc., que tambin deben anotarse).
Identificacin. Mediante el empleo del programa de ordenador Apilab Software. Tambin pueden utilizarse tablas y manuales especficos para sistemas API.

ANTIBIOGRAMA
Podemos definir en lneas generales como agentes antimicrobianos a aquellas sustancias que inhiben el crecimiento de los microorganismos o producen suinactivacin. Por lo tanto, y dependiendo de la accin que dichos agentes ejercen sobre los microorganismos, podemos dividirlos en:
* Agentes microbiostticos: son aquellos en los que la inhibicin del crecimiento que
producen desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo.
* Agentes microbicidas: son aquellos que producen una accin letal irreversible sobre
los microorganismos.
Dependiendo de su naturaleza y procedencia, las sustancias antimicrobianas pueden
ser productos qumicos de sntesis o bien productos naturales producidos por microorganismos u otros organismos vivos. A estos ltimos se les considera Antibiticos si bien algunos de ellos, que fueron primero descubiertos en la naturaleza, se obtienen en la actualidad
sinttica o semisintticamente, de una forma ms sencilla y barata. Entre las sustancias antimicrobianas qumicas de sntesis se ha englobado dentro del concepto de Quimioterpico a
aquellas que pueden interferir directamente en la proliferacin de los microorganismos a concentraciones toleradas por el husped. Por lo tanto, al ser sustancias que poseen una toxicidad
selectiva, pueden utilizarse teraputicamente (de ah su nombre) para inhibir a un determinado
microorganismo sin ocasionar lesiones importantes en el hospedador.
Esta serie de propiedades (toxicidad selectiva, especificidad y extremada actividad)
justifican la aplicacin de este tipo de sustancias en la clnica cuando las defensas corporales
no bastan para que el individuo supere la enfermedad. De esta manera, el individuo puede recuperarse sin consecuencias graves, permitiendo la destruccin o eliminacin del agente
etiolgico sin excesivos riesgos (o por lo menos menores que los producidos por la infeccin)
en el hospedador.
La resistencia bacteriana a quimioterpicos y antibiticos tom su verdadera importancia cuando se comprob la posibilidad de su adquisicin por mecanismos de transformacin, conjugacin y transduccin. De esta manera se obtiene la resistencia a gran cantidad de
antibiticos y quimioterpicos al contactar cepas patgenas con cepas saprofitas que, al ser
huspedes habituales del hombre y los animales, estn continuamente expuestas a gran cantidad de estas sustancias. El suministro de estos agentes antimicrobianos a los animales y hombre provoca la seleccin (que no el acostumbramiento) de los mutantes resistentes a estas sustancias. Si esta resistencia es extracromosmica, puede ser transferida a otros microorganismos menos frecuentes y ms patgenos.
VALORACION DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS: ANTIBIOGRAMA
La accin de los agentes antimicrobianos debe estudiarse sobre cultivos "in vitro" del
agente en cuestin. Con los datos obtenidos puede planificarse la posible utilidad teraputica
del producto ensayado.
Entre estos datos puede ser interesante conocer los tipos de microorganismos sobre los
que acta un antibacteriano (espectro antimicrobiano), las concentraciones necesarias para
inhibir el crecimiento de un microorganismo (sensibilidad), el efecto de las condiciones ambientales sobre la sensibilidad (pH, temperatura, etc.), si posee accin microbicida o microbiosttica, etc.

Uno de los datos que ms se maneja a nivel clnico y que ms trascendencia tiene es el
de la sensibilidad; para calcularla se enfrentan los microorganismos problema a diversas concentraciones de sustancias antibiticas o quimioterpicas. Mediante este sistema definimos la
Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que es la menor concentracin de una sustancia que
es capaz de inhibir el crecimiento visible de un microorganismo.
La realizacin de esta tcnica es lo que se conoce como antibiograma, permitiendo el
conocimiento de la CMI y la posible aplicacin teraputica, para cada caso clnico en particular, de la sustancia adecuada a la dosis correcta.
Para la realizacin del antibiograma se pueden utilizar varias tcnicas, siendo la ms
difundida y sencilla el Tcnica de Difusin en Agar, que a continuacin se detalla.
ANTIBIOGRAMA POR TECNICA DE DIFUSION EN AGAR
Esta prueba consiste en enfrentar a un microorganismo a diversas sustancias antimicrobianas a una concentracin determinada para establecer la sensibilidad o resistencia de dicho microorganismo a las mismas. Hay que sealar que el antibiograma se debe realizar con
un solo tipo de microorganismo cada vez, es decir, con un microorganismo en cultivo puro,
no debindose utilizar una poblacin mixta de microorganismos para realizar el antibiograma.
Por tanto, debern realizarse tantos antibiogramas como microorganismos significativos encontremos en la muestra clnica.
* Medio de cultivo: el medio que se utiliza es el Mueller-Hinton. Las placas se secan
30 minutos a 37C antes de su empleo.
* Inculo: la cepa que se estudia se cultiva durante 24 horas en medio de cultivo slido, normalmente a la temperatura de 37C; posteriormente se realiza una suspensin en solu6
cin salina estril, de manera que obtengamos aproximadamente una concentracin de 10 de
bacterias/ml.
* Discos de antibiticos.
Tcnica:
1. Siembra: se realiza una siembra por inundacin, utilizando 3-5 ml de la dilucin
preparada. Se deja reposar 5 minutos. Posteriormente se elimina el sobrenadante inclinado la
placa en varias direcciones, para dejar secar la placa durante 10 minutos a 37C en posicin
invertida.
2. Aplicacin de los discos antibiticos: los discos se ponen a unos 15 mm de la periferia de la placa con ayuda del aplicador, apretando ligeramente los discos que no hayan entrado totalmente en contacto con el medio usando para tal fin el asa de platino esterilizada a la
llama. Se pueden colocar aproximadamente 6 discos por placa, teniendo en cuenta que las zonas de inhibicin de los diferentes discos no deben entrecruzarse para que se puedan efectuar
la lectura de los dimetros de los halos de inhibicin en varias direcciones.
3. A continuacin se dejan secar las placas de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente
para que se sequen por completo.
4. Incubacin de las placas a 37C durante 18-24 horas.

Tras este periodo se observar el crecimiento bacteriano y los halos de inhibicin, si

los hubiera.
* Lectura de la zona de inhibicin: se mide el dimetro (en milmetros) de la zona de
inhibicin con una regla o comps (Figura 18). Cuando el borde no es neto, la lectura se realiza en la zona que corresponda aproximadamente al 80% de inhibicin. Ciertos antibiticos
producen a veces extensas colonias perifricas que no hay que tener en cuenta en la medicin
del dimetro si stas son escasas.

* Interpretacin del antibiograma: se comparan los dimetros de los halos de inhibicin producidos por cada uno de los antibiticos utilizados con los que se detallan en la Tabla
1 adjunta. En esta tabla se relacionan las zonas de inhibicin con la potencia de los discos y la
sensibilidad bacteriana, por lo que debemos asegurarnos que la potencia de los discos que refleja la tabla coincide con la usada por nosotros.
Para el uso clnico se han clasificado las bacterias en tres grandes grupos, segn su
sensibilidad antibitica:
- Cepa sensible: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento a la dosis habituales por va general.
- Cepa intermedia: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento local,
mediante un aumento de las dosis por va general, o por una concentracin fisiolgica particular (orina, bilis, etc.).
- Cepa resistente: es aquella que probablemente no ser afectada con las dosis
habituales, sea cual sea el tipo de tratamiento.

CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UN ANTIBIOGRAMA

1. No se debe realizar el antibiograma sobre una poblacin mixta de microorganismos, debindose proceder previamente al aislamiento y cultivo en pureza de los distintos
microorganismos encontrados en la muestra clnica, para, posteriormente, realizar un antibiograma para cada uno de los distintos tipos de microorganismos de significacin clnica hallados.
2. No deben incluirse un nmero muy elevado de antibiticos.
3. Hay que realizar las siguientes consideraciones:
3.a. Se debe limitar el estudio de la sensibilidad a los antibiticos a aquellos que presumiblemente sean activos sobre el microorganismo implicado en el
proceso infeccioso. Ha de tenerse en cuenta que, a pesar de que el espectro antibacteriano es el mismo para una misma familia de antibiticos, los fenmenos de resistencia
no son siempre extrapolables a todos los miembros de dicha familia.
3.b. Se deben tener en cuenta las contraindicaciones de la especie animal a
tratar.

35

TABLA 1:CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORAS EN ANTIBIOGRAMAS

Antimicrobiano

Disco

cido Nalidxico
cido Oxolinico
Ampicilina

NA 30g
OA 2g
AM 10g

Amoxicilina
Amoxicilina+cla

AMX 25g
AMC 30g

Amikacina
Apramicina
Aztreonam
Ceftazidima
Ceftiofur

AN 30g
APR 40g
ATM 30g
CAZ 30g
EFT 30g

Cefotaxima
Cefoxitina
Ciprofloxacina
Cloranfenicol

CTX 30g
FOX 30g
Cip 5 g
C 30g

Colistina
Doxiciclina

CL 50g
D 30g

Enrofloxacina

Dimetro (Interpretacin)
S
I
R
19
14 18
13
11
10
17
14 16
13
29
28
17
16
26
19 25
18
21
14
20
19
18
14 17
13
17
15 16
14
14
13
22
16 21
15
18
15 17
14
21
18 20
17
23
18
21
18
21
15
16

15 22
15 17
16 20
13 17
18 20
13 15

14
14
15
12
17
< 15
12

ENR 5g

23
21

17 22
17 20

16
16

Eritromicina

E 15g

Estreptomicina
Espectinomicina

S 10g
SPC 100g

23
21
15
14

14 22
16 20
12 14
11 13

13
15
11
10

Florfenicol

FFC 30g

19

15 18

14

Flumequina
Gentamicina
Imipenem
Kanamicina
Lincomicina
Marbofloxacina
Marbofloxacina
Neomicina
Penicilina

AR 30g
GM 10g
IMP 10g
K 30g
L 15g
MAR 5g
MAR 5g
N 30g
P 10g

14 18
13 14
14 15
14 17

Sulfafurazol (sulfamidas)
Tetraciclina

SF 300g

19
15
16
18
21
18
18
17
29
15
28
17

15 18
19 22

Tiamulina
Tilmicosina

T 30g
TIL 15g

19
23
20
14
11

Tilosina
Trimetoprim

TY 30g
TM 30g

TE 30g

20
16

15 17
15 17
13 16
20 - 27
13 16

11 13

11 15

13
12
13
13
< 17
14
14
12
28
14
19
12
14
18
16
10
10
16
10

Aplicable en:

Referencia

Enterobacterias

NCCLS 2002(V)

Enterobacterias
Estafilococos
Enterococos
Estreptococos (salvo S. pneumoniae)

NCCLS 2002(V)

Estafilococos
Otros organismos

Enterobacterias
Enterobacterias
Actinobacillus pleuropneumoniae
Pasteurella multocida
Salmonella enterica
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Salvo Estreptococos
Estreptococos (no S. pneumoniae)
Estafilococos, Enterobacterias y
Pseudomonas
P. multocida, E. coli (Aves)
Mannheimia haemolytica, P. multocida y
H. somnus (bovino)
Salvo Estreptococos
Estreptococos
Enterobacterias
M. haemolytica, P. multocida y
H. somnus (bovino)
M. haemolytica, P. multocida y
H. somnus (Bovino)

Estafilococos
Enterococos
Estreptococos (salvo S. pneumoniae)

SFM 2001
NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(V)
VAV
NCCLS 2002(H)
NCCLS 2002(H)
NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(H)
NCCLS 2002(H)
NCCLS 2002(H)
NCCLS 2002(V)
SFM 2001
NCCLS 2000(H)
NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(H)
NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(V)

NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(V)
NCCLS 2002(V)
SFM 2001
ROSCO
VTOQUINOL
LIOFILCHEM
NCCLS 1999(V)

NCCLS 2002(V)
Otros salvo Estreptococos
Estreptococos
M. haemolytica (Bovino)
P. multocida, A. Pleuropneumoniae (Porcino)
Enterobacterias , Estafilococos

NCCLS 2002(V)
LIOFILCHEM
NCCLS 2002(V)
LIOFILCHEM
NCCLS 2002(H)

36

PRCTICA DE VIROLOGA
INTRODUCCIN
Los virus son agentes infecciosos extraordinariamente pequeos compuestos por protena y un nico tipo de cido nucleico, ARN o ADN pero no ambos. Aquellos que tienen envoltura, adems poseen lpidos y, en algunas ocasiones, las protenas ms superficiales poseen
grupos azcares (glucoprotenas).
Dada su extrema simplicidad estructural, los virus son incapaces de llevar una vida independiente y necesitan parasitar clulas que les van a aportar aquellos materiales de los que
carecen y van a permitir su replicacin. Por lo tanto, en el ciclo de vida de los virus se puede
hablar de dos fases:
a) fase extracelular, en la que actan como partculas inertes sin actividad metablica alguna, simplemente para pasar de clula a clula;
b) fase intracelular, en la cual desarrollan su ciclo de vida, y de la cual se deriva su efecto
patognico.
Algunos virus pueden prescindir de la fase extracelular porque son captados por otra
clula no infectada segn geman o emergen, o porque aprovechan que la clula se est dividiendo para transmitirse a las clulas hijas. Pero ningn virus puede prescindir de fase intracelular. Por este motivo, el estudio de los virus siempre requiere el uso de clulas vivas.
Afortunadamente, en la actualidad se dispone de lneas celulares continuas: clulas que se
multiplican en un medio adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio y que cuando hay
muchas se prescinde de parte de ellas para que las que permanecen puedan seguirse multiplicando, y as bsicamente de una forma indefinida.
Las clulas as mantenidas son muy susceptibles a alteraciones accidentales tales
como contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presin de oxgeno, etc. Han de
ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo las condiciones lo ms constantes posible. Por este motivo, el acceso a la sala de cultivos debe ser restringido y no es
aconsejable incluir en las prcticas el manejo de las clulas, bien infectadas o bien sin infectar
por virus.
Los virus son demasiado pequeos para ser observados con el microscopio ptico. Sin
embargo, al desarrollar su ciclo de replicacin utilizan productos celulares y alteran la vida de
la clula, y en muchas ocasiones esto s que se puede observar con el microscopio ptico.
Como se indic ms arriba, ste es el llamado efecto citoptico. Los posibles efectos citopticos son numerosos. Entre ellos se cuentan la aparicin de sincitios, la lisis celular, el desarrollo de cordones, la vacuolizacin, la aparicin de clulas gigantes, etc. Al final de la descripcin de esta prctica hay algunas fotos demostrativas. En la WebCT de la Microbiologa,
en Laboratorio Virtual de Microbiologa Veterinaria, en la parte destinada a Laboratorio de
Virologa hay imgenes de efectos citopticos y cmo se van desarrollando.
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es hallar la cantidad de virus presente en una muestra de
origen infeccioso. Para ello, realizaremos una titulacin, a fin de determinar la Dosis Infectiva
en Cultivo Tisular 50 (TCID50), o cantidad de muestra que produce efecto citoptico en 50%

37

de los cultivos. Los clculos son muy similares a los que se realizan para determinar cualquier
otra dosis infectiva, letal, etc 50.
DESARROLLO
Todo el proceso debe realizarse en condiciones de la mxima esterilidad. Se dispondr de una placa de 96 pocillos en la que se van a hacer dos titulaciones. Las placas son
muy parecidas a las de ELISA pero estn tratadas para que las clulas se adhieran a las mismas. A diferencia de las bacterias, los virus no crecen bien en cualquier clula y son muy especficos. En el laboratorio generalmente hay que disponer de una veintena o ms de lneas
celulares para garantizar que un virus procedente de un aislamiento concreto puede crecer en
alguna de ellas. Sin embargo, en estas prcticas se va a titular un virus que sabemos que crece
sobre la lnea celular CRFK, fibroblastos de rin felino. Para la titulacin, haremos diluciones del virus que iremos aadiendo a los pocillos. Transcurridas 24 h veremos el efecto citoptico.
Protocolo de la prctica
En la placa, en cada uno de los 96 pocillos hay alrededor de 20.000 clulas en 100 l
en un medio de cultivo especfico para cultivos titulares. Cada placa ser empleada para dos
titulaciones, aadiendo 100 l de cada dilucin del virus a cuatro pocillos diferentes.
1. Realizar diluciones de la muestra de virus en base cinco.
Preparar una batera de tubos Eppendorf estriles, hasta un total de 10 tubos.
Aadir 800 l de medio de cultivo (RPMI con suero fetal bovino y antibiticos, para evitar en la medida de lo posible el crecimiento de bacterias) a cada
uno.
Tomar con una micropipeta 200 l de muestra de virus, y transferirlos al primer Eppendorf. En este tubo, el virus habr quedado diluido 1:5.
Mezclar concienzudamente, y transferir 200 l del tubo 1:5 al siguiente tubo,
quedando el virus diluido 1:25.
Repetir el paso 5 hasta el final, partiendo siempre del ltimo tubo en donde se
ha realizado la dilucin.
2. Una vez estn todas las diluciones hechas, pasar 100 l de cada dilucin a cuatro pocillos distintos. La dilucin final del virus en cada pocillo ser la mitad que la inicial, ya
que en el volumen final, tan slo la mitad corresponde a la dilucin del virus.
3. No aadir dilucin de virus a las dos ltimas columnas, para considerarlas controles.
En estos pocillos, las clulas tienen que crecer perfectamente.
4. Incubar a 37C durante 24 horas en atmsfera con 5% de CO2 y humedad.
Al da siguiente se procede a observar el resultado. A partir de aqu ya no es necesario
mantener las condiciones de esterilidad.
1. Eliminar el medio de cultivo por absorcin con una pipeta multicanal.
2. Fijar las clulas con metanol, aadiendo 100 l a cada pocillo con la pipeta multicanal
y dejndolo actuar durante 5-10 minutos.
3. Eliminar el metanol y lavar con el agua del grifo dejndola caer en los pocillo con mucho cuidado para que no se desprendan las clulas.
4. Aadir 100 l de solucin Giemsa, y dejndolo actuar durante 30 minutos. Si el colorante no est preparado, diluir 1 gota de la solucin madre en 1 ml de agua.

38

5. Eliminar la solucin de Giemsa y lavar con cuidado con el agua del grifo.
6. Observar al microscopio.
7. Anotar en un papel los pocillos en los que hay efecto citoptico (aquellos en los que
las clulas pegadas al pocillo son menos de la mitad que en los controles).

RESULTADOS
Para evaluar los resultados y dar un ttulo hay que aplicar una frmula estadstica.
Aqu se muestra el mtodo de Karber.
TCID50 = - -(S-0.5)
= log10 de la ltima dilucin con 100% de cultivos positivos (con efecto citoptico)
= log10 del factor de dilucin
log10 10 = 1
log10 5 = 0,7
log10 3 = 0,5
log10 2 = 0,3
S = suma de la fraccin de pocillos con efecto citoptico en cada dilucin, desde la dilucin en la que el 100% lo muestra. Este ltimo caso tiene un valor de 1 y todos los
dems sern una fraccin de 1.
En el ejemplo de la pgina anterior
= -2,4 (log10 de 1:250, ltima dilucin con el 100% de efecto citoptico).
= 0,7 (diluciones en base 5)
S = la suma de
Dilucin 1:250 = 4/4 = 1
Dilucin 1:1250 = 3/4 = 0,75
Dilucin 1:6.250 = 1/4 = 0,25
Dilucin 1:16.250 =0/0= 0
Suma =
2,00
Sustituyendo los valores en la ecuacin:
TCID50 = - 2,4 (0,7 x (2-0,5)) = -2,4 (0,7 x 1,5) = - 2,4 1,05 = -3,45

39

TuboColumna
Dilucin
en el Eppendorf

RPMI
Virus
Dilucin
final en
pocillo

1:5

1:25

1:125

1:625

1:3125

1:15.625

1:78.125

800l
200l
1:10

800l
200l
1:50

800l
200l
1:250

800l
200l
1:1250

800l
200l
1:6.250

800l
800l
800l
800l
800l
200l
200l
200l
200l
200l
1:16.250 1:156.250 1:781.250 1:3.906.250 1:19.531.250

Ejemplo

1:390.625 1:1.953.125

10

(11)

(12)

1:9.765.625

Contr

Contr

40

Algunos ejemplos de efecto citoptico

a) Efecto citoptico inexistente

b) Lisis, calvas o placas

c) Efecto citoptico: leucemia

d) Efecto citoptico: sincitios

41

PRACTICA DE MICOLOGIA
Objetivos:
En esta prctica el alumno debe cubrir los siguientes objetivos:
Conocimiento de las tcnicas bsicas utilizadas en el laboratorio de Micologa.
Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se desarrollan sobre medios de cultivo.
Conocer las caractersticas morfolgicas (macro y microscpicas) de los distintos
grupos taxonmicos de inters veterinario.
Aprender a utilizar las claves dicotmicas bsicas de identificacin de hongos.
Teora:
1. Medios de cultivo: no difieren en principio de las normas generales expuestas al hablar de
bacterias. Los aspectos diferenciales que podemos destacar son los siguientes:
Se utilizan medios selectivos con los siguientes objetivos:
a) Inhibir el crecimiento de bacterias. Para ello se han empleado dos estrategias bsicas:
** Medios con pH cido (<5).
** Medios a los que se aade antibiticos de amplio espectro: tetraciclina, penicilina/ estreptomicina, cloranfenicol, gentamicina, etc.
b) Inhibir el crecimiento de un determinado grupo de hongos:
** Actidione (cicloheximida) que inhibe el crecimiento de la mayora de los
hongos saprofitos, se utiliza en los medios de aislamiento de los hongos dermatofitos.
c) Restringir el crecimiento de hongos de desarrollo invasivo, como en el caso de los
Zygomycetes, agregando Rosa de Bengala, al 03 por mil.
2. Incubacin:
* La incubacin se realiza en aerobiosis.
* Se utilizan diferentes temperaturas de incubacin dependiendo del tipo de muestra
en estudio:
** Temperatura de 22-28C: cuando se quiere aislar hongos que colonizan sustratos no vivos (alimentos, ambientes....).
** Temperatura de 32C: cuando se procesan muestras clnicas para el diagnstico de micosis superficiales.
** Temperatura de 37C: cuando se procesan muestras clnicas de mamferos
para diagnstico de micosis profundas.
* El periodo de incubacin vara entre 3-5 das y hasta 21 das en dermatofitos.

42

3. Mtodos de aislamiento: Obtencin de cultivos puros.

Mtodos:
- Siembra por agotamiento: utilizado para levaduras (ya descrito en las
tcnicas de bacteriologa.

Siembra en tres puntos: utilizado para hongos miceliares.

Siempre que trabajemos con un cultivo de hongos debemos tener en cuenta que estos
se reproducen por medio de esporas, y que estas se dispersan muy fcilmente por el ambiente,
contaminando el laboratorio. Por tanto, debemos tomar precauciones en la manipulacin de
los cultivos, de tal forma que se evite, en lo posible, la contaminacin, para lo cual:
-

Debemos tener las placas abiertas el menor tiempo posible.

Las placas con crecimiento fngico siempre se abren boca abajo, dejando
la tapa en la mesa y manteniendo el cultivo hacia abajo con el fin de que
las esporas no se diseminen.

Mtodo de siembra en tres puntos

a. Con el asa de platino estril y fra se raspa ligeramente el centro de la colonia del
hongo.
b. En una placa con medio de cultivo se toca en tres puntos equidistantes con el asa de
platino cargada.
c. Se lleva a incubar a temperatura y periodo ptimos dependiendo del tipo de problema en estudio.
4. Mtodo de identificacin de hongos aislados sobre medio de cultivo: La identificacin
se realiza siguiendo las pautas:
* Anlisis macroscpico de las colonias: por el aspecto de la colonia podemos saber si se trata de una levadura o de un hongo miceliar o filamentoso.
Los caracteres macroscpicos de la colonia que presentan inters taxonmico son:
Color (anverso y reverso), tonalidad y distribucin.
Textura superficial, surcos y/o estras.
Exudados y pigmentos.
Tamao

43

* Anlisis microscpico.
a.- Para levaduras: siguiendo procedimiento similares a las tcnicas bacteriolgicas ya
descritas.
- En fresco, sin fijar.
- Fijadas y teidas
b.- Para hongos miceliares: las preparaciones para la observacin microscpica se
montan normalmente utilizando los siguientes elementos:
- Agua o azul de metileno como agente de montaje.
- Agujas enmangadas o "celo" para toma del material a examinar.
Tcnica de la cinta adhesiva:
1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa.
2. Se corta un trozo de papel celo que se pone en contacto con una colonia del hongo.
3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno.
4. Se presiona el celo sobre el porta, eliminando el exceso de agua o colorante con papel secante (filtro), evitando la formacin de burbujas.
5. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.
Tcnica del cubreobjetos
1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa.
2. Con dos agujas enmangadas se toma una porcin del centro de la colonia.
3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno.
4. Se dislacera, con ayuda de las agujas, la porcin de colonia en estudio.
5. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, eliminando el resto de agua
o colorante con papel secante (filtro).
6. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.
El agua para el montaje de la preparacin, se emplea cuando queremos conocer la coloracin que tienen las estructuras de los hongos.
Caracteres que presentan valor taxonmico:
a) En la identificacin de levaduras.
b) En la identificacin de hongos miceliares.
a) Criterios de identificacin para levaduras:
Caractersticas de cultivo:
- Medio lquido: formacin de velo o anillo.
- Medio slido: Caractersticas macroscpicas de la colonia (ya descritas)
Caractersticas microscpicas de la levadura:
- Forma, tamao de las clulas.
- Tipo de reproduccin asexual.
- Tipo de reproduccin sexual.
Caractersticas fisiolgicas:
- Utilizacin de los compuestos de carbono:
** Fermentacin
** Oxidacin
** Hidrlisis de la arbutina
- Utilizacin de los compuestos de nitrgeno.

44

Capacidad de crecimiento en medios libres de vitaminas.

Hidrlisis de la urea
Produccin de pigmentos.
Capacidad de licuar gelatina.

b) Criterios de identificacin para hongos miceliares:

Caractersticas de cultivo: a partir de las colonias desarrolladas en medios de cultivo slidos ejem: agar extracto de Malta, agar glucosado de Sabouraud, CzapexDox, etc.
- Caractersticas macroscpicas: (ya descritas)
- Caractersticas microscpicas:
** Caractersticas de las hifas:
Dimetro.
Color: (hialino, dematiceo = oscuro, marrn)
Presencia o ausencia de septos.
Presencia de determinadas formaciones caractersticas: hifas en raqueta,
hifas en espiral, hifas peptinadas, formacin de clamidosporas.
-

** Caractersticas de las estructuras reproductoras asexuales:

Hongos cenocticos:
Morfologa del esporangio
Morfologa de la columela
Presencia o ausencia de apfisis, rizoides...
Hongos septados
Presencia o ausencia de conidiforo.
Morfologa del conidiforo.
Morfologa y tipo de clula conidigena.
Tipo de conidiogenesis: tlica o blstica.
Estructura y caractersticas de los conidios.
** Caractersticas de las estructuras reproductoras sexuales (si las hay).
Hongos cenociticos
Morfologa de la zigospora
Hongos septados
Presencia de cuerpos fructferos sexuales (cleistotecios, apotecios, peritecios).
Presencia y tipos de ascas y ascosporas.

En la mayor parte de los hongos miceliares la informacin obtenida del estudio de sus caractersticas de cultivo (anlisis macro y microscpico) es suficiente para poder identificarlos utilizando las claves dicotmicas.
En algunos casos, para poder discernir entre dos gneros prximos o bien dentro de un gnero
determinado entre dos especies, se tiene que recurrir a pruebas fisiolgicas, que nos pondrn
en evidencia diferencias metablicas entre ellas (presencia o ausencia de un determinado enzima, capacidad de asimilacin de determinados sustratos.......).

45

IDENTIFICACIN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS

1.a -

Crecimiento en Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias ms o menos mucosas, de color blanco, crema, rosa, rojas .......etc., sin formacin de filamentos.................................................................................LEVADURAS

1.b -

Crecimiento en medio Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias de

apariencia miceliar........................................................................................... 2

2.a -

Hifas no septadas (o con septos muy escasos en las proximidades de los

rganos, reproductores). Dimetro de la hifa >4. Esporas asexuales se forman en el interior de receptculos cerrados (esporangios)
HONGOS CENOCITICOS
Div. Zygomycota

2.b - Hifas septadas. Dimetro de la hifa variable normalmente <4u

HONGOS TABICADOS
Div. Ascomycota
Div. Deuteromycota

46

HONGOS CENOCITICOS.
Division Zygomycota
Crecimiento en medios slidos, generalmente muy expansivo, algodonoso, hifas hialinas, los esporangios se ven como puntos oscuros en la superficie de la colonia

Caractersticas de inters taxonmico

47

1.a.- Esporangiosporas formadas en el interior de merosporangios.........................

.............................................................................................. Syncephalastrum

1.b.- Esporangiosporas formadas en esporangios globosos con columela......................................................................................................... 2

2.a.- Micelio vegetativo con rizoides. El esporangio presenta apfisis ................. 3

48

2.b.- Ausencia de rizoides y de apfisis........................................................... Mucor

3.a.- Rizoides situados en la base del esporangio. Columela de forma globosa

............................................................................................................ Rhizopus

3.b.- Rizoides presentes pero a menudo difciles de observar. Apfisis en forma de

embudo.................................................................................................. Absidia

HONGOS TABICADOS.
Divisin Ascomycota. Divisin Deuteromycota.
1.a.- Organos reproductores cerrados presentes: sexuales (cleistotecio, peritecio y
apotecio) o asexuales (picnidios, acervulos)............................................................2

49

1.b- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales

cerrados ausentes................................................................... Div. Deuteromycota
Clase Hyphomycetes
2.a.-Organos reproductores sexuales presentes. Espora sexual en el interior de una
clula en forma de saco (asca)...............................................Div. Ascomycota

2.b.- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales

cerrados presentes.................................................................... Div. Deuteromycota
Clase Coelomycetes

Divisin Deuteromycota. Clase Hyphomycetes.

1.a.- Conidios ausentes............................................... Micelio estril.
1.b.- Conidios presentes........................................................ 2.
2.a.- Conidios mayoritarios formados por un proceso tlico . .............................. 3.

50

2.b.- Conidios mayoritarios formados por un proceso blstico. ............................ 6

3.a.-

Conidio formado por fragmentacin de micelio vegetativo (sin diferenciacin

previa),
formando
artroconidias
exclusivamente.
Micelio
hialino............................................................................................. Geotrichum

3.b.-

Artroconidia ausente o poco abundante,presencia de otro tipo de conidios tlicos. Micelio hialino.................................................................................... 4.

4.a.- Presencia de dos tipos de conidios tlicos:

unicelulares (microconidios) y
pluricelulares con tabiques transversales (macroconidios)........................... 5.

51

4.b.- Presencia de un solo tipo de conidio pluricelular (tabicado con septos transversales)......................................................................... Epidermophyton

5.a.- Macroconidia de pared gruesa y rugosa. Relativamente ms abundantes que

las microconidias.......................................................................... Microsporum

5.b.- Macroconidia de pared delgada y lisa. Microconidia relativamente ms abundante que las macroconidias............................................... Trichophyton

6.a.- Conidios generalmente unicelulares............................................................ 7.

6.b.- Conidios generalmente pluricelulares......................................................... 10.
7.a.- Conidios mayoritarios formados a partir de micelio indiferenciado por gemacin (blstico). Colonias viscosas, aspecto levaduriforme, color variable ini-

52

cialmente (blanquecinas, rosas, marrn plido) evolucionando a marrn oscuro........................................................................................Aureobasidium

7.b.- Conidios formados sobre clulas conidigenas diferenciadas y agrupados

de forma caracterstica constituyendo conidioforos...................................... 8.

8.a.-

Colonias en tonos blancos o marrones claros cuando envejecen. Clulas conidiognas anelidicas, conidios generalmene rugosos de base truncada,
agrupados formando cadenas...................................................Scopulariopsis

8.b.-

Colonias en tonos blancos, amarillos, azules, verdes, generalmente de crecimiento rpido.

Clulas conidiogenas fialidicas....................................... 9.

9.a.-

Las fialides insertadas sobre el pice de una hifa diferenciada, ensanchada,

que constituye la vescula. Pudiendo tener uno o dos verticilos de clulas conidiogenas................................................................................... Aspergillus

53

9.b.- Las fialides constituyen el ltimo verticilo del conidioforo que tiene la forma
caracterstica de pincel.................................................................... Penicillium

10.a.- Colonias blancas, amarillas, rosadas.Generalmente los macroconidios tienen

Forma de hoz con tabiques transversales.Tambin pude tener microconidios
unicelulares........................................................................................ Fusarium

10.b.- Colonias generalmente de coloresoscuros (verde, marron). Micelios oscuros

(dematiaceos). Conidios maduros pluricelulares con tabiques de orientacin
irregular, transversales, longitudinales y oblicuos (dictioconidio).... Alternaria

54

Levaduras

55

Glosario de los terminos micolgicos empleados

en la clave de identificacin de las prcticas
Anlide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de una manera baspeta, alargandosese con
la produccin de cada conidio, que deja cicatrices en forma de anillo en la superficie externa.

Aplanospora: espora inmvil.

Apfisis: dilatacin en el extremo del esporangiforo situado debajo del esporangio de los Zygomicota.
Artrospora. Espora resultante de la fragmentacin de la hifa.
Cenoctica: no septada.
Clamidospora: conidio tlico de pared gruesa, que generalmente funciona como espora de resistencia.
Columela: estructura estril existente dentro de un esporangio u otra fructificacin.
Conidio: espora asexual no movil, que suele formarse en el pice o en el lado de la clula esporgena (clula
conidigena).

Conidio blstico: conidio que se forma por un proceso de gemacin a partir de una clula conidigena.
Conidio tlico. Conidio formado por transformacin de la totalidad de una clula hifal preexistente.
Conidiforo: hifa simple o ramificada que sale de una hifa somtica y se modifica de tal forma que en su pice, o en un lado lleva una o ms clulas conidiogenas.

Dictioconidio: espora con tabique transversales , longitudinales y oblicuas.

Esporangio: estructura en forma de saco cuyo contenido protoplsmico completo se transforma en un nmero
indefinido de esporas.

Esporangiolo: esporangio pequeo que contiene pocas esporas.

Esporangioforo: hifa portadora de un esporangio.
Filide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de unamanera baspeta, sin un aumento detectable de la longitud.

Hifa hialina: hifas transparentes, incoloras.

Hifa dematiacea: hifas de color oscuro.
Merosporangio: esporangio cilndrico.
Rizoide: ramificacin corta y delgada de las hifas semejante a la raiz de una planta.
Zoospora: espora movil, producida asexualmente.

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ANALISIS DE ALIMENTOS
La existencia de microorganismos en los alimentos no significa en muchos casos un
peligro para el consumidor o una calidad deficiente de los mismos. Slo en aquellos casos en
los que los alimentos vehiculan grmenes potencialmente patgenos o en los que la manipulacin y las condiciones de higiene y almacenamiento han sido deficientes pueden constituir un
serio peligro para la salud del consumidor. No obstante la legislacin vigente exige la ausencia de determinados microorganismos, y un nmero mximo de otros, con lo que sea por la
causa que sea, el anlisis de alimentos microbiolgico de alimentos es obligatorio. Como consecuencia la determinacin en el laboratorio de ciertos grupos de microorganismos cuya presencia en los alimentos en determinado nmero indica que estos alimentos estuvieron expuestos a condiciones tales que permitieron la entrada y multiplicacin de agentes infecciosos o
toxignicos. A estos grupos de microorganismos se les denomina "indicadores" y sirven para
evaluar la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus toxinas.
En otros casos se pueden seleccionar otros grupos de bacterias, aadiendo al agar nutritivo inhibidores selectivos con actividad de superficie o colorantes, modificando la composicin de la atmsfera de incubacin, eliminando por ejemplo el oxgeno.
METODO:
Objetivo: Determinar el nmero de microorganismos totales o un grupo de ellos en
concreto que hay en 1 ml o en 1 g del alimento a analizar.
Recuentos en placa de bacterias: Dichos recuentos se basan en la determinacin del
nmero de colonias que crecen en placas de agar nutritivo que han sido sembradas con cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en determinadas condiciones ambientales.
Como se ha sealado anteriormente, la siembra en la placa de agar nutritivo del alimento se realiza con este diluido. Los diluyentes utilizados, varan dependiendo del tipo de
muestra que se deba analizar; en general suelen ser sustancias tales como agua destilada, solucin salina, solucin Ringer, solucin tampn fosfato, y para el recuento bacteriano en alimentos est especialmente recomendada una solucin al 0,1% de peptona en agua destilada o
solucin salina.
El mtodo para diluir alimentos slidos o lquidos es diferente.
1. Muestras lquidas:
1.a. Homogeneizacin de la muestra usando el agitador excntrico.
1.b. Con una pipeta se toma 1 ml de la muestra y se deposita en el primer tubo
de dilucin que contiene 9 ml de diluyente (figura 20).
1.c. Una vez utilizada la pipeta se elimina.
1.d. Este primer tubo se homogeneiza
1.e. De este tubo se toma 1 ml que se deposita en un segundo tubo de dilucin
con otros 9 ml de diluyente.
1.f. Se elimina nuevamente la pipeta utilizada.
1.g. Se homogeneiza este segundo tubo.
Este procedimiento se repite tantas veces cuantas diluciones sean necesarias.
2. Muestras slidas:

57

En el caso de muestras slidas o semislidas, se considera que 1 g de muestra equivale

a 1 ml del mismo producto en estado lquido; de este modo 10 g de la muestra y 90 ml de diluyente convenientemente homogeneizados en una batidora, constituirn la primera dilucin.
Posteriormente se procede igual que en el caso anterior.
El segundo paso sera sembrar en superficie un determinado volumen (0,1-0,2 ml) de
cada dilucin en placas de agar nutritivo, para lo que se utiliza el asa de Drigalski tal y como
se describe en la pgina 11.
INTERPRETACION:
Para hacer recuento de microorganismos aerobios mesfilos las placas sembradas de
esta forma se incuban a 32-37C durante 24-48 horas.
Trascurrido el periodo de incubacin se procede a contar el nmero de colonias que
haya en las placas correspondientes a las distintas diluciones, teniendo en cuenta que slo se
deben considerar aquellas placas cuyo nmero de colonias sea superior a 30 e inferior a 300.
Las colonias se cuentan punteando con rotulador cada una de ellas por el reverso de la placa
de Petri, con el fin de no contar una misma colonia dos veces.
Tras contarlas se debe utilizar este dato , junto a los de volumen sembrado y dilucin
que corresponda , para calcular el nmero de microorganismos por unidad de volumen o peso
-7
de muestra. As, por ejemplo, si en la dilucin 10 , hemos contado 35 colonias, multiplicare7
mos este nmero por el inverso de dicha dilucin, con lo cual obtendremos 35x10 en el volumen que hemos aadido a la placa (0,1 ml). Como el resultado debe darse por mililitro de
8,
9
muestra original, el resultado final ser 35x10 o, expresado ms sencillamente, 3,5x10

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Batera de tubos conteniendo cada uno NUEVE

ml exactos de solucin salina estril

De cada tubo del banco de diluciones se siembran una o varias placas Petri con agar nutritivo o medio selectivo especfico.

Demasiadas colonias

Nmero adecuado
para recuento
(30 a 300)

Pocas colonias

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MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS GENERALES
AGAR SANGRE
Composicin en g/l:
* Peptona de casena............ 12'0
* Peptona de carne............... 11'0
* Almidn............................. 1'5
* Cloruro Sdico.................. 5'0
* Agar................................. 15'0
pH final: 7'3 aproximadamente

Tambin pueden emplearse como medio base para el agar sangre el agar Columbia o el agar
de Soja Tripticasena (TSA). El medio base, una vez esterilizado debe enfriarse hasta una temperatura
de 45C. En ese momento se aade la sangre desfibrinada de carnero o de caballo hasta una concentracin del 5% . En el caso de que se aadiera la sangre a una temperatura mayor a 45C, sta se hemolizara, con lo que obtendramos el denominado "Agar-chocolate".
Se trata de un medio de uso general (no selectivo), que soporta bien el crecimiento de bacterias normales como las enterobactericeas y otros ms exigentes como Pasteurella y Brucella, etc. Este medio contiene una mezcla equilibrada de peptonas de carne y casana, que lo hacen muy adecuado
para la preparacin de medios selectivos y diagnsticos con la adicin de sangre y/o inhibidores. Tal
como se presenta, es decir sin adiciones y aadiendo sangre, es un excelente medio de cultivo general.
Normalmente, las bases de Agar Sangre contienen una peptona de casena que facilita la produccin
de colonias de gran tamao y una peptona de carne, que proporciona unos halos de hemlisis muy definidos, propiedad que es muy importante desde el punto de vista taxonmico.
MEDIO DE SOJA TRIPTICASEINA (TSA)
Composicin en g/l:
* Peptona de Casena............. 15'0
* Peptona de Soja....... ......... 5'0
* Cloruro de Sodio................. 5'0
* Agar................................... 15'0
pH final: 7'3 aproximadamente.

Se trata de un medio para uso general, que contiene dos peptonas, las cuales favorecen el crecimiento de una amplia variedad de microorganimos. Es idneo para el cultivo tanto de aerobios como
anaerobios. Tambin se puede utilizar el medio como base de Agar Sangre; para ello se debe aadir un
7% de sangre. Igualmente, se puede usar para la preparacin de "Agar chocolate".
GAR DE MUELLER HINTON (MH)
Composicin en g/l:
* Peptona........................ 17'5
* Infusin de Carne............4'0
* Almidn........................ 1'5
* Agar............................. 15'0

Este agar fue ideado como medio de cultivo para aislamiento de especies patgenas del gnero
Neisseria. Sin embargo, a partir de 1970 la OMS propuso este medio de cultivo para los ensayos de
sensibilidad de antibiticos y sulfamidas, en un afn de estandarizar dichos ensayos.

MEDIOS SELECTIVOS
MEDIO DE BAIRD-PARKER (BP)
Composicin en g/l:
* Peptona de casena.............10'0
* Extracto de carne.............. 5'0
* Extracto de levadura...........1'0
* Cloruro de Litio................ 5'0
* Agar................................. 17'0
* Glicina............................. 12'0
* Piruvato de Sodio............ 10'0
pH final: 6'8 aproximadamente

Una vez esterilizado el medio, se aaden 10 ml de una solucin de Telurito Potsico al 1% y

una Yema de Huevo emulsionada.
Se trata de un medio altamente selectivo para el aislamiento y enumeracin de los miembros
del gnero Staphylococcus. El medio incorpora Piruvato Sdico como estimulante del crecimiento. As
mismo incorpora un fuerte inhibidor de muchos microorganismos como es el Telurito Potsico, actuando tambin como inhibidores, el Cloruro de Litio y la Glicina. La emulsin de Yema de Huevo
hace al medio opaco y permite observar si los microorganismos presentes en el medio poseen lecitinasa, una enzima que desdobla la lecitina presente en la Yema de Huevo. La actividad de esta enzima
produce zonas de aclaramiento o halos ms claros alrededor de las colonias.
Las colonias de Staphylococcus aureus aparecern brillantes y de color negro por la reduccin
del Telurito Potsico. Sin embargo, el color de las colonias no es decisivo para la identificacin:
miembros del gnero Listeria que presentan el mismo aspecto. En este medio tambin pueden desarrollarse microorganismos de los gneros Bacillus y Micrococcus.
MEDIO DE MacCONKEY (Mck)
Composicin en g/l:
* Peptona................... 20'0
* Lactosa................... 10'0
* Sales Biliares............ 2'5
* Cloruro Sdico......... 5'0
* Rojo Neutro............. 0'05
* Cristal Violeta.......... 0'001
* Agar........................ 15'0
pH final: 7'2 aproximadamente.

Se trata de un medio diferencial para la deteccin, aislamiento y enumeracin de coliformes y

patgenos intestinales en agua, productos lcteos y muestras biolgicas. Se utiliza fundamentalmente
para el aislamiento de miembros de la Familia Enterobacteriaceae y diferenciacin de Escherichia coli de otros patgenos intestinales de la misma familia. Los componentes selectivos lo constituyen el
Cristal Violeta (inhibidor de los microorganismos Gram-positivos) y las Sales Biliares. La concentracin de estas dos sustancias permite el crecimiento de todos los miembros de la familia anteriormente
citada. Las bacterias del gnero Pseudomonas pueden crecer tambin en este medio, aunque no perte-

61

necen a la Familia Enterobacteriaceae; sin embargo, se diferencian bien por ser las Pseudomonas
Oxidasa positivas y aerobias estrictas.
La incorporacin del rojo neutro (de color rosa en medio cido) permite la diferenciacin de
los microorganismos que fermentan la Lactosa de los que no lo hacen. Los primeros, al fermentar la
Lactosa acidificarn el medio, dando lugar a que las colonias presenten una coloracin rosada, que no
aparecer si no se hidroliza dicho disacrido.
MEDIO DE SABOURAUD (Sb)
Composicin en g/l:
* Glucosa............................. 40'0
* Peptona de Casena............. 5'0
* Peptona de Carne............... 5'0
* Agar....................... .......... 15'0
pH final: 5'6 aproximadamente.

Se trata de un medio indicado para el cultivo de hongos. Su selectividad se debe a su bajo pH

y a la alta concentracin de glucosa, que junto con una incubacin a temperaturas relativamente bajas
(25 a 30C), permiten favorecer el crecimiento de los hongos, al mismo tiempo que dificultan el de las
bacterias. Frecuentemente este medio es usado con antibiticos para el aislamiento de hongos patgenos, a partir de material que contenga gran cantidad de otros hongos o bacterias.

OTROS MEDIOS DE USO FRECUENTE

* Caldo BHI adaptado para el crecimiento de microorganismos exigentes.
* Agar Columbia, medio bsico enriquecido para microorganismos exigentes, tambin usado
como base para el agar sangre.
* Agar Salmonella-Shigella (SS) diferencial y selectivo para estos gneros.
* Agar Malta y Agar Czapek para el aislamiento de hongos.

PRUEBAS BIOQUMICAS
UTILIZACION DE AZUCARES
Los azcares que vamos a utilizar son:
- GALACTOSA
- GLUCOSA
- INOSITOL
- LACTOSA
- MALTOSA
- MANITOL

- RAFINOSA
- RAMNOSA
- RIBOSA
- SALICINA
- SORBITOL
- XYLOSA

FUNDAMENTO: Estas pruebas bioqumicas se integran dentro del grupo que estudia la
determinacin de la capacidad de un microorganismo para utilizar un hidrato de carbono especfico incorporado en un medio de cultivo bsico, originando un pH cido. El medio de cultivo
lleva incorporado un indicador de color (rojo fenol), de color rojo a pH alcalino y amarillo a pH
cido.
TECNICA: Se siembra con un inculo espeso. En el caso de querer apreciar la degradacin en condiciones de anaerobiosis o cuando se desea estimar si se trata de metabolismo oxidativo o fermentativo, se cubre el medio con 1-2 ml de parafina lquida estril.
Se incuba a 37C - 24 h.
RESULTADO +: color amarillo del medio, que indica acidez.
RESULTADO -: color rosa-rojizo del medio, que indica alcalinidad.

PRUEBA CAMP
FUNDAMENTO: La actividad hemoltica de la lisina estafiloccica sobre los eritrocitos se ve intensificada por un factor extracelular producido por estreptococos del grupo B,
llamado factor CAMP. Por lo tanto, cuando ambos productos se encuentran juntos en una placa
de agar sangre ovina, se advierte una intensificacin de la reaccin hemoltica.

TECNICA: La prueba CAMP se realiza trazando una estra de estreptococos (por identificar) en forma perpendicular a otra estra de una cepa de Staphylococcus aureus conocida co-

63

mo productora de lisina. Ambas lneas no deben tocarse (figura 22A). Las placas se deben incubar en aerobiosis.
INTERPRETACION: Como se ilustra en la figura 22B, la zona de intensificacin de lisis asume la forma de una punta de flecha en la interseccin de ambas estras.

PRUEBA DE LA CATALASA
FUNDAMENTO: El perxido de hidrgeno se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es txico para las bacterias, por lo que deben tener el enzima catalasa, que lo descompone
a agua y oxgeno.
TECNICA: Seguiremos el mtodo del portaobjetos: Con un asa de platino se recoge una
colonia del cultivo puro y se coloca sobre un portaobjetos.
Se agrega una gota de Perxido de hidrgeno al 30% con una pipeta Pasteur.
RESULTADO +: Inmediata formacin de burbujas por la liberacin de gas.
RESULTADO -: No hay formacin de burbujas.

CITRATO
FUNDAMENTO: Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como
nica fuente de carbono para el metabolismo. El medio utilizado incluye citrato como nica
fuente de carbono y fosfato amnico como fuente de nitrgeno. Las bacterias que metabolicen
el citrato, tambin utilizarn el fosfato amnico, con la consiguiente alcalinizacin del medio.
TECNICA: Se emplea el medio slido Citrato de Simmons, con azul de bromotimol
como indicador de pH: presenta color amarillo en condiciones cidas (pH=6), azul en medio alcalino (pH=7.6), y verde en el medio no inoculado (pH=6'9). El medio se prepara en pico de
flauta largo, con poca profundidad.
Se inocula nicamente en zig-zag sobre el medio en pico de flauta. Se incuba a 37C 24 a 48
horas, si bien a veces incluso son necesarios 4 das.
RESULTADO +: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta.
RESULTADO -: No se observa crecimiento ni cambio de color, apareciendo verde.

COAGULASA EN PORTA ("CLUMPING FACTOR")

FUNDAMENTO: Vamos a investigar la capacidad de produccin del enzima coagulasa. No se conoce exactamente su mecanismo de accin, aunque va a actuar de alguna forma sobre el mecanismo de coagulacin del suero provocando la transformacin de fibringeno en fibrina, con la consiguiente formacin del cogulo.
TECNICA: Se emplea normalmente plasma de conejo.
Se coloca una gota estril de plasma de conejo con anticoagulante (EDTA), y se emulsiona en
ella suavemente una suspensin espesa de microorganismos.
Se pueden colocar en el mismo porta microorganismos de control positivo y negativo.

64

RESULTADO +: Se observa la inmediata formacin de un precipitado macroscpico en

forma de aglutinados blancos (grumos).
RESULTADO-: Se considera negativo si no se produce la aglutinacin en 3-4 minutos.

DNAsa
FUNDAMENTO: Empleamos un medio de cultivo cuya caracterstica principal es la de
poseer cido desoxirribonucleico, con objeto de investigar si es hidrolizado por el microorganismo problema, en caso de que posea la enzima desoxirribonucleasa.
TECNICA: Se siembra en el medio Agar DNAsa con una estra central.
Se incuba a 37C - 24 h.
Trs el periodo de incubacin, se inunda la placa con cido clorhdrico 1N.
RESULTADO+: Al aadir el ClH, hace que el ADN existente precipite, produciendo
con ello un enturbiamiento del medio. Es evidente que donde ya no quedaba ADN por
la accin de la DNAsa microbiana, el medio aparecer transparente. Esto suceder en la
zona contigua al crecimiento, indicando con ello que el microorganismo ha hidrolizado
el cido nucleico.
RESULTADO -: El ADN no ha sido despolimerizado, con lo que precipita por el ClH
en toda la placa, y no va a haber zona transparente.
HIDROLISIS DE LA ESCULINA
FUNDAMENTO: la esculina, un glicsido, es hidrolizada por algunas bacterias, dando
como productos de degradacin glucosa y esculetina. La esculetina al reaccionar con el hierro
forma un complejo de color castao oscuro o negro.
TECNICA: se emplea un medio que lleva esculina, y al que se han incorporado sales de
hierro como indicadores de la presencia de esculitina. El microorganismo se siembra por agotamiento.
RESULTADO +: presencia de color negro/castao oscuro alrededor de las colonias.
RESULTADO -: ausencia de color negro.
DECARBOXILACIN DE AMINOCIDOS
(ARGININA, LISINA Y ORNITINA DECARBOXILASAS)
FUNDAMENTO: Algunas bacterias (p.e. ciertas enterobacterias) poseen unas enzimas
decarboxilasas especficas que son capaces de atacar el grupo carboxilo de determinados aminocidos, produciendo anhdrido carbnico y una amina, o diamina, con la consiguiente alcalinizacin del medio. As:
- La lisina decarboxilasa (LDC) produce, a partir de la L-lisina, cadaverina.
- La ornitina decarboxilasa (ODC) produce putrescina.
El aminocido L-arginina posee un sistema especial de transformacin: primero por
accin de una descarboxilasa se transforma en un producto intermedio, la agmatina,
la cual, por una Arginina dehidrolasa (ADH) pasa a putrescina y urea. Si el microorganismo es productor de ureasa transformar a su vez la urea en amoniaco y anhdrido
carbnico.

65

TECNICA: Se emplea un medio de cultivo con glucosa (medio Moeller), que incorpora el aminocido en cuestin (arginina, lisina u ornitina). Utilizamos como indicador el prpura de bromocresol, amarillo en medio cido y prpura en medio alcalino. Cuando el medio se inocula con
una bacteria capaz de fermentar glucosa, se produce cido que baja el pH del medio y cambia el
color del medio del prpura al amarillo. La condicin cida estimula la actividad decarboxilasa y si el organismo produce la enzima apropiada (descarboxilasa), el aminocido es degradado
a su correspondiente amina. La formacin de estas aminas (cadaverina o putrescina), eleva el
pH del medio y hacen que el indicador de pH vuelva a la alcalinidad, cambiando el color del indicador del medio de amarillo a prpura o violeta. Si el organismo no produce la enzima apropiada, el medio permanece cido (amarillo).
Se inocula el medio de cultivo, y se cubre con 1-2 ml de parafina estril (para favorecer
las condiciones de fermentacin). Se incuba a 37C-24h.
RESULTADO +: color prpura turbio a prpura apagado.
RESULTADO -: color amarillo claro y brillante.

Arginina

DC

Agmatina

DH

Putrescina
+
Urea

Arginina Decarboxilasa
PRUEBA DE LA HIDRLISIS DE LA ARGININA
La L-arginina, adems de poder ser catabolizada por una decarboxilasa, puede ser directamente transformada por una hidrolasa con el mismo final anterior, la produccin de alcalinidad por formacin de aminas, aunque los compuestos intermedios sean distintos. Esta transformacin la pueden llevar a cabo ciertos microorganismos, como por ejemplo, estreptococos y
bacterias relacionadas. As, la L-arginina, por accin de arginina dehidrolasa, produce Lcitrulina y amoniaco. Esta prueba no debe ser confundida con la ADH descrita en la prueba anterior.
FUNDAMENTO: Se trata de detectar la hidrlisis de la arginina mediante la enzima
que transforma este aminocido en citrulina, con liberacin de amoniaco.
TECNICA: Se inocula un tubo de caldo-arginina y se incuba junto a un tubo testigo
estril durante 24 h (en ocasiones 2-7 das). Transcurrido este tiempo se deposita una gota del
cultivo sobre un portaobjetos y se aade una gota del reactivo de Nessler, que reacciona con el
amoniaco. El desarrollo de un color entre anaranjado y marrn, indica la presencia de amoniaco.
El tubo estril que sirve de control debe ensayarse al mismo tiempo y debe ponerse de color
amarillo plido o no mostrar ninguna reaccin coloreada.
RESULTADO +: Color anaranjado-marrn.
RESULTADO -: Color amarillo plido o ausencia de color.

Arginina

DH

Arginina Dehidrolasa

L-citrulina
+
Amoniaco

GALACTOSIDASA (ONPG)
FUNDAMENTO: Existen microorganismos con capacidad para degradar la lactosa en
3-4 das, y no en 24 horas. Estos son los denominados "fermentadores tardos de la lactosa". En
este grupo de microorganismos podemos predecir la facultad de fermentar la lactosa demostrando la presencia o ausencia de actividad Galactosidasa mediante el empleo del compuesto orgnico Orto- nitrofenil--D-Galactopiransido (ONPG), con un enlace similar al de glucosa - galactosa existente en la lactosa. Si se encuentran clulas positivas para la metabolizacin activa
de la lactosa, el reactivo ONPG incoloro es hidrolizado liberando un compuesto amarillo, el Orto-Nitrofenol.
TECNICA: Se siembra en un tubo con aproximadamente 2 ml de solucin Ringer. Se
aade el disco reactivo de ONPG.
Se incuba a 37C - 24 h.
RESULTADO +: se produce el cambio de color a amarillo.
RESULTADO -: continua incoloro.
HIDROLISIS DEL HIPURATO
FUNDAMENTO: La hipuricasa es una enzima que produce la hidrlisis del hipurato de
sodio, con la formacin de benzoato de sodio y glicina.
TECNICA: Se inocula un caldo hipurato con el organismo por investigar, y se incuba
durante 20-24 horas. Posteriormente se traspasan 0,8 ml de la parte superior del cultivo a un tubo vaco y se aaden a ste 0,2 ml del reactivo cloruro frrico y se mezcla bien. El cloruro frrico precipita protenas, hipurato y benzoato; sin embargo, las protenas y el hipurato se disuelven
ms fcilmente en exceso de reactivo. Por lo tanto, la persistencia de un precipitado en el caldo
hipurato tras aadir un exceso de cloruro frrico indica la presencia de benzoato y, por tanto,
una prueba positiva de hidrlisis de hipurato.
RESULTADO +: Presencia de un precipitado en el fondo del tubo.
RESULTADO -: Ausencia de precipitado.
INDOL
FUNDAMENTO: Por la degradacin del triptfano se libera indol, cido pirvico,
amoniaco y energa. Ese indol puede ser detectado por el empleo de determinados reactivos que
dan una reaccin de color.
TECNICA: Se emplea un medio con triptfano.
Incubacin a 37C - 24 h.
Con objeto de visualizar el indol formado debemos aadir 5 gotas del reactivo de Kovacs, directamente al tubo ya incubado, y se agita suavemente. Cuando existe indol, ste se
combina con el aldehido que se encuentra en el reactivo de Kovacs, para dar un color rojo en la
capa de alcohol del reactivo de Kovacs.
RESULTADO +: Anillo de color rojo en la superficie del medio.
RESULTADO -: Anillo del color del Reactivo de Kovacs (ocre oscuro).

AGAR KLIGLER
FUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar los hidratos de
carbono glucosa y lactosa incorporados a un medio de crecimiento, con produccin o no de gases, junto con la posible produccin de cido sulfhdrico.
Se utiliza un medio de agar inclinado que contiene dos hidratos de carbono: Lactosa en una concentracin al 1% y Glucosa al 0'1%. Algunos microorganismos utilizarn ambos azcares, otros
solo la glucosa y otros ni glucosa ni lactosa. La utilizacin puede ser con produccin o no de gases, y se producir aerbicamente (en el pico de flauta) y anaerbicamente (en el fondo del tubo). Por tanto, los resultados que pueden obtenerse sern los siguientes:
1 Utilizacin slo de la glucosa: Aparecer el pico de flauta alcalino y la capa profunda
cida. El pico de flauta es alcalino (color rojo), lo que indica que se ha producido la degradacin
aerbica de la glucosa. Despus de 18-24 h de incubacin, la baja concentracin de glucosa
(0'1%) ha sido consumida por completo y el organismo comienza a utilizar las peptonas del medio con objeto de obtener los nutrientes precisos para su crecimiento. Sin embargo, en la capa
profunda se observa un color amarillo debido a la degradacin anaerbica de la glucosa, ms
lenta que la aerbica, dando lugar a productos cidos ms estables que hacen que el pH permanezca cido a las 24 h.
Por tanto, si la lectura se efectuara a las 12 h, aparece color amarillo en todo el tubo. Si
la lectura se efectuara a las 48 h, aparecera color rojo en todo el tubo.
2 Utilizacin de glucosa y lactosa: Como hemos mencionado anteriormente, la lactosa
se encuentra en el medio en una concentracin del 1%, es decir, 10 veces ms que la glucosa.
Esto hace que en 24 h se habr consumido aerbicamente la glucosa, pero no toda la lactosa,
momento en que se iniciara el consumo de peptona, existiendo por tanto todava una condicin
cida. Si este tubo se leyera a partir de las 48 h, el pico de flauta se habra vuelto alcalino por
depleccin de la lactosa y consiguiente utilizacin de las peptonas.
3 No utilizacin ni de glucosa ni de lactosa. Como estas bacterias son incapaces de tomar sus nutrientes de los hidratos de carbono, acuden a la peptona que contiene el medio. Si la
utilizan tanto anaerbica como aerbicamente, todo el tubo aparece de color rojo. Si solo la utilizan aerbicamente , el pico de flauta aparece alcalino y el resto sin cambios.
En resumen, con respecto a los azcares, el agar Kligler puede interpretarse de 4 maneras, teniendo en cuenta que el primer trmino corresponde al pico de flauta y el segundo al fondo del tubo:
1. Alcalina/Acida (Rojo/Amarillo): Solamente es utilizada la glucosa.
2. Acida/Acida (Amarillo/Amarillo): Son utilizadas la glucosa y la lactosa.
3. Alcalina/Alcalina (Rojo/Rojo): No es utilizada la glucosa ni la lactosa. Se utilizan las peptonas.
4. Alcalina/Sin cambio (Rojo/Granate): No son utilizadas glucosa ni lactosa. Se
utilizan las peptonas aerbicamente.
Adems de estas reacciones, podemos investigar la aparicin de gas como producto
terminal del metabolismo de los hidratos de carbono. Dicho gas aparecer en forma de burbujas
en el fondo del tubo, que pueden llegar incluso a desplazar al medio de cultivo.
Tambin podemos investigar la produccin de sulfhdrico en el medio. Para ello el medio contiene 2 indicadores: citrato frrico amnico y tiosulfato de sodio. En principio la bacteria
reacciona con el tiosulfato para dar lugar a sulfhdrico, que es incoloro. ste despus reacciona
con iones frricos, dando lugar a sulfuro ferroso, que da un precipitado negro insoluble.

TECNICA: La inoculacin se hace a partir de una colonia de cultivo puro, inoculando

en zig-zag en el pico de flauta y por picadura en la capa profunda (figura 23).
Se incuba a 37C de 18-24 h, ni antes ni despus.
RESULTADOS: El orden en que deben ser leidas las pruebas es: 1 Glucosa; 2 Lactosa; 3 Gas; 4 Sulfhdrico. Ejo: G+L-G+SH-.
Glucosa +: color amarillo en el fondo del tubo.
Glucosa -: color rojo en el fondo del tubo.
Lactosa +: color amarillo en el pico de flauta.
Lactosa -: color rojo en el pico de flauta.
Gas +: aparicin de burbujas en el medio, incluso con desplazamiento del mismo del fondo del tubo.
Gas -: no se aprecian burbujas.
SH2 +: color negro en la capa profunda.
SH2 -: no se aprecia color negro.
LECITINASA
FUNDAMENTO: Determinar la presencia del enzima lecitinasa. Para ello empleamos
un medio rico en lecitina, como pueda ser un medio nutritivo enriquecido con yema de huevo.
TECNICA: Se siembra en placa haciendo una doble estra central, como en el caso de la
DNAsa.
Incubacin a 37C - 24 a 48 h.
RESULTADO +: Se formar un halo ms claro alrededor de la zona de crecimiento microbiano debido a la degradacin de la lecitina por el microorganismo.
RESULTADO-: No existe halo opaco alrededor de la zona de crecimiento microbiano.
MOTILIDAD
FUNDAMENTO: Queremos investigar si un microorganismo es mvil o no. Para ello
se emplea un medio semislido (con Agar al 0'2%), en el que la bacteria mvil difunda lo ms
rpidamente posible.
TECNICA: La inoculacin se debe hacer por picadura en el centro del medio de cultivo
con el asa de picadura hasta una profundidad de 1,2 a 1,5 cm.
Incubacin a 22C a 37C - 24 h.
RESULTADO +: Aparece una turbidez que se difunde por todo el tubo.
RESULTADO -: Se produce una lnea de crecimiento limitada a seguir la lnea de
siembra, mientras que el medio que la rodea se mantiene claro.
NITRATOS
FUNDAMENTO: Determinar la capacidad de un organismo de reducir el Nitrato a Nitritos o N2 libre. Este proceso de reduccin tiene lugar generalmente en condiciones anaerbicas, en las cuales el microorganismo obtiene el Oxgeno del Nitrato.
TECNICA: Empleamos el medio caldo con nitrato, distribuido a razn de 2 ml por tubo.
Se inocula y se incuba a 37C - 24 h.
Antes de hacer la interpretacin debemos aadir los reactivos al medio: 1 ml de -naftol
y 1 ml de acido sulfanlico.

RESULTADO +: color rosado a rojo intenso, lo que indica la presencia de nitritos en el

medio por reduccin de los nitratos. Es decir, estos colorantes detectan la presencia de
nitritos en el medio.
En caso de que no se desarrolle color, no damos la reaccin negativa, pues nicamente
indica que no hay nitritos en el medio, pero pudo haberlos, y haber pasado a nitrgeno libre por
la accin del microorganismo. Para ello se utiliza el mtodo de reduccin por el zinc, aadiendo
directamente al tubo una pizca (20 mg) de polvo de zinc, que producira el paso de nitratos a nitritos en caso de que el microorganismo no lo hubiera hecho anteriormente.
RESULTADO +: Si no se desarrolla color es porque haba ausencia de nitritos en el
medio. Es decir, el microorganismo redujo el nitrato a nitrito, y luego redujo nuevamente el nitrito, que por ello ha desaparecido.
RESULTADO -: color rosado a rojo intenso: el nitrato presente no ha sido reducido por
el organismo, sino que ha sido el zinc el que lo ha reducido.
PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION DE LA GLUCOSA
FUNDAMENTO: La fermentacin es un proceso en que el aceptor final de electrones
es un compuesto orgnico, que proviene de la propia degradacin del substrato inicial.
La respiracin es un proceso en que el oxgeno es el aceptor final de electrones.
El hecho de que la fermentacin sea un proceso anaerbico no implica en absoluto que
no pueda desarrollarse en presencia de oxgeno: las bacterias disponen de l, pero no lo utilizan
para degradar la glucosa.
TECNICA: Se inoculan 2 tubos de caldo glucosado con indicador de pH (rojo fenol),
que en condiciones bsicas es rojo mientras que a pH cido es amarillo. Uno de ellos se cubre
con 1- 2 ml de parafina fundida estril con objeto de conseguir condiciones de anaerobiosis.
Se incuba a 37C durante 24 a 48 h.
RESULTADO +: viraje del indicador dando color amarillo del medio que indica acidificacin por degradacin de la glucosa:
a) Si es en los 2 tubos: Fermentacin.
OXIDASA
FUNDAMENTO: La prueba de la oxidasa est basada en la presencia en la bacteria del
enzima citocromo oxidasa.
TECNICA: Empleamos un bastoncillo estril, uno de cuyos extremos est impregnado
con un reactivo (N,N,N',N'-tetrametil -p-phenilenediamina dihydrochloride). Este extremo del
bastoncillo se pone en contacto con una colonia del microorganismo y se esperan unos minutos.
RESULTADO +: Las colonias que producen citocromo oxidasa hacen que el reactivo
pase a un color prpura oscuro.
RESULTADO -: No se produce cambio de color del reactivo.
ROJO DE METILO
FUNDAMENTO: Se trata de una prueba para detectar la produccin de cidos fuertes
(lctico, frmico y actico) a partir de la fermentacin "cido-mixta" de la glucosa. Se consideran rojo de metilo positivos slo aquellos microorganismos que puedan mantener un pH cido

bajo, tras una incubacin prolongada (24-48 h) contrarrestando el sistema estabilizador de pH

del medio. Se basa simplemente en el empleo de un indicador de pH (Rojo de Metilo) para determinar la concentracin de iones Hidrgeno (pH) presentes cuando un organismo degrada la
glucosa.
TECNICA: Tras la inoculacin en caldo glucosafosfato, se incuba a 37C - 24 h.
Despus de la incubacin, para llevar a cabo la interpretacin, se aade el reactivo Rojo
de metilo: unas 5 gotas. El resultado se interpreta inmediatamente: con un pH inferior a 4'4 el
reactivo permanece rojo, y con un pH superior a 6 vira a color amarillo. Con un pH entre 5 y 5'8
se producen diferentes tonalidades de anaranjado.
RESULTADO +: color rojo del medio.
RESULTADO -: color amarillo o cobrizo en la superficie del medio.
UREA
FUNDAMENTO: La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la
descomposicin de los compuestos orgnicos. Por su accin desdobla la urea, liberando 2 molculas de amoniaco.
Empleamos un indicador de pH, el rojo fenol, con color amarillo en medio cido y rosado en medio alcalino.
TECNICA: Se emplea un medio agar base con un 20% de urea. Hay que tener la precaucin de no calentar, pues la urea se descompone con el calor. Por ello, este medio se debe esterilizar por filtracin.
Se incuba a 37C - 24h.
RESULTADO +: color rojo rosado del medio, que indica alcalinizacin por el amoniaco tras el desdoblamiento de la urea.
RESULTADO -: color amarillo anaranjado del medio.
VOGES PROSKAUER (Prueba de la Acetona)
FUNDAMENTO: Esta prueba bioqumica permite determinar la presencia de acetil-metil-carbinol en los cultivos. Este compuesto es un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa, concretamente de una fermentacin particular, denominada butilenogliclica, la cual predomina en ciertas bacterias.
TECNICA: Inoculacin con un inculo poco denso en caldo glucosa fosfato. Se incuba
a 37C durante 24-48 horas.
Una vez finalizado el periodo de incubacin y para proceder a la lectura de la prueba bioqumica, se aaden los reactivos:
1 En primer lugar, 0'6 ml de una solucin de -naftol al 5% en alcohol etlico absoluto,
que actuar como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reaccin sin
prdida de su especificidad.
2 Despus se aaden 0'2 ml de una solucin alcalina (KOH al 40% o NaOH al 40%).
Este lcali, en presencia de acetil-metil- carbinol se oxida a diacetilo, dando un color rosado-salmn.
A continuacin debe agitarse suavemente el tubo, dejndolo reposar durante 10-15 minutos antes de interpretar la reaccin.
RESULTADO +: color rojo-rosado en la superficie del medio (presencia de acetoina).
RESULTADO -: no existe cambio de color.

SUPUESTO PRACTICO
* Durante la segunda semana de prcticas cada equipo de trabajo (2 personas)
tendr que aplicar los conocimientos adquiridos en la primera semana para identificar
los distintos microorganismos de una muestra clnica.
* Los microorganismos presentes en la muestras no tienen que ser necesariamente los mismos de la primera semana de prcticas, pero a cuya identificacin se
podr llegar a travs de las tablas del guin de prcticas.
* A lo largo de la segunda semana se podr solicitar al profesor de prcticas todos los medios de cultivo, reactivos y pruebas bioqumicas que se consideren necesarias
para la identificacin de los microorganismos.
* Se elaborar un cuaderno de trabajo en el que se justificar y razonar cada
uno de los pasos seguidos, as como la interpretacin que se da a cada uno de ellos y el
resultado obtenido.
* La calificacin final ser individual para cada alumno.