Mesa redonda

DNA, complementarias de las originales,

que contienen las secuencias de nucletidos del fragmento de DNA que se quiere
amplificar. Para que se p r o d u z c a este
fenmeno, las secuencias complementa
rias de los iniciadores tienen que estar
relativamente cerca una de otra, a una
distancia de 2 kilobases menos. El re
sultado de este primer ciclo de amplifica
cin es, as, la duplicacin del fragmento
de DNA de inters. Mediante la repeticin
secuencial de este proceso se p u e d e n
crear millones de copias del fragmento de
DNA de inters. Este gran acumulo de
copias puede ser fcilmente detectado por
electroforesis en gel, eventualmente se
guida de hibridacin con una sonda c o m
plementaria marcada. Actualmente existe,
adems, la posibilidad de hacer una cuantificacin del material gentico de partida
(PCR cuantitativa). En su notable capaci
dad de amplificacin reside la gran S E N
SIBILIDAD de la tcnica de PCR.

Aplicaciones de la
tcnica PCR a la
medicina
Moderador:
M. I. Sr. D. Carlos Viader
Farr*. Ponentes: Sr. Dr. D. Jos M. Zabey, D Juana M. Mulet

Principios de la tcnica de
reaccin en cadena de la
Polimerasa
La tcnica de reaccin en cadena de la
p o l i m e r a s a (PCR) amplifica s e c u e n c i a s
especficas de DNA, permitiendo as la
deteccin de las mismas. La amplificacin
por PCR de secuencias de RNA requiere
un paso previo de transcripcin inversa
del RNA a c D N A (tcnica RT-PCR).

Cada uno de los pasos del ciclo de

amplificacin representado en la Figura 1
dura entre 30 y 60 segundos. En un an
lisis por PCR tpico se realizan entre 30 y
40 ciclos de amplificacin. Por consiguien
te, el proceso en s de amplificacin del
DNA por PCR es rpido. La muestra que
debe ser ampliada exige a veces proce
sos complejos de preparacin. Sin embar
go, en la mayor parte de las aplicaciones
clnicas el resultado de una determinacin
por PCR puede ser obtenido en un tiempo
de 12 a 48 horas. Por tanto, el diagnstico
por PCR tiene tambin la propiedad de la
RAPIDEZ.

Los principios bsicos de esta tcnica

esquematizados en la Figura 1. El DNA de
la muestra biolgica en la que se pretende
detectar la secuencia de inters es prime
ramente desnaturalizado por calentamien
to a 9 2 - 9 5 C . A continuacin, sendos oligonucletidos sintticos (iniciadores) se
unen, a temperaturas de 4 5 - 6 0 C , a las
correspondientes secuencias complemen
tarias de las cadenas del DNA desnatura
lizado; estas secuencias complementarias
de los iniciadores estn en los extremos
del f r a g m e n t o del DNA que se d e s e a
amplificar. Por ltimo, a una temperatura
de 7 2 C y en presencia de deoxinucletidos, una D N A - p o l i m e r a s a termoestable
extiende cada iniciador por su extremo 3',
de modo que se crean dos cadenas de
g

La utilidad clnica de la tcnica de PCR

se basa en la existencia de secuencias de
DNA que son e s p e c f i c a s de distintos
m i c r o o r g a n i s m o s y de distintos g e n e s
humanos normales y p a t o l g i c o s , este
hecho proporciona a la tcnica de PCR
una gran ESPECIFICIDAD, que la hace
aplicable al diagnstico de enfermedades
infecciosas, neoplsicas y genticas, y al
tipaje del sistema mayor de histocompatibilidad.

* Acadmico Numerario

93

Secuencia de inters

+ Iniciadores
(45-60C)

e' : : :

3'

: : : : : : : : : : : : : : q>

i!!n:::::;;:H:::ii

+ D N A polimerasa +
deoxinucletidos
(72C)

Fig. 1:
Esquema
de la tcnica
de
PCR

Secuencia de inters
amplificada

Aplicaciones diagnsticas
de la tcnica de reaccin en
cadena de la polimerasa
disponibles en el laboratorio
immunogen.

jas potenciales de estas tcnicas en cada

una de las aplicaciones.
Hepatitis B
La tcnica de PCR es la ms sensible
de las tcnicas de biologa molecular para
la deteccin de DNA del virus de la hepatitis B (VHB) (1,2)?

El laboratorio Immunogen tiene actualmente montadas tcnicas de PCR aplicables al diagnstico y valoracin de diversas enfermedades infecciosas, y al tipaje
del sistema HLA de clase II. a continuacin se describen brevemente las venta-

La importancia del diagnstico molecular de la hepatitis por V H B radica en los

siguientes hechos:
a) La determinacin de DNA de V H B
94

en suero permite una estimacin

replicacin viral ms fiable que los
dos s e r o l g i c o s c o n v e n c i o n a l e s ,
como la determinacin de HBeAg
anticuerpos anti-HBeAg (1).

de la
mtotales
y de

e) El nivel de RNA de VHC circulante

puede ser til para la monitorizacin de la
respuesta a tratamientos anti-vricos (8).

Infeccin por el virus de la

inmunodeficiencia humana (VIH)

b) La prdida de DNA de V H B indica

a u s e n c i a reduccin de la replicacin
viral, y frecuentemente predice la resolucin de la enfermedad (1).

En la infeccin por VIH las tcnicas de

PCR tienen las siguientes aplicaciones:
a) Diagnstico de la infeccin VIH en
nios nacidos de madres infectadas. En
los nios recin nacidos, el diagnstico
serolgico convencional de la infeccin VIH
tiene el problema de que los anticuerpos
anti-VIH de clase IgG pueden ser de origen materno, transmitidos a travs de la
placenta, y pueden persistir en el nio
hasta durante 18 meses. En estos casos,
la PCR destinada a la bsqueda de DNA
provrico en las clulas mononucleares de
sangre perifrica del nio es la tcnica de
eleccin para hacer el diagnstico de infeccin VIH (9).

c) La cantidad de DNA deVHB circulante puede servir para la seleccin de pacientes con hepatitis crnica B para tratamiento con interfern (1).
d) La determinacin de DNA de VHB
en suero puede ser til para la monitorizacin de la respuesta a tratamientos antivricos (4).

Hepatitis C
La importancia de la determinacin del
RNA del virus de la hepatitis C (VHC) en
suero mediante RT- PCR se basa en los
siguientes hechos:

b) D i a g n s t i c o de la i n f e c c i n V I H
durante el periodo de seroconversin. Tras
la infeccin por VIH existe un periodo
generalmente de 3 a 6 semanas de duracin, pero que puede ser bastante ms
largo, durante el cual no hay anticuerpos
anti-VIH detectables. En estas circunstancias, la tcnica de PCR destinada a la
bsqueda de DNA provrico en las clulas
mononucleares de sangre perifrica es
muy til para hacer el diagnstico precoz
de infeccin VIH (10).

a) Permite hacer un diagnstico de la

infeccin ms precoz que la determinacin de anticuerpos anti-VHC, ya que la
presencia de RNA de VHC precede a la
aparicin de dichos anticuerpos(5).
b) puede contribuir a la distincin entre
hepatitis crnica persistente y hepatitis
crnica activa, ya que los niveles sricos
de RNA de VHC son menores en la primera de las formas de hepatitis (6).
c) El nivel s r i c o de RNA de V H C
permite estimar el grado de replicacin
viral (4). La evaluacin de la replicacin
viral no puede hacerse por la determinacin de anticuerpos anti-VHC, que no diferencian entre infeccin pasada e infeccin
actual.

c) Diagnstico de la infeccin VIH en

casos en los que la d e t e r m i n a c i n de
anticuerpos anti-VIH por "Western-blot" da
resultados indeterminados. En estos casos, la bsqueda por PCR de DNA provrico en las clulas m o n o n u c l e a r e s de
sangre perifrica es esencial para descartar que el resultado i n d e t e r m i n a d o del
"Western-blot" sea debido a que el paciente se encuentra en una fase precoz de la
infeccin VIH.

d) El nivel de RNA de VHC circulante

puede servir para la seleccin de pacientes para tratamiento con interfern, ya que
se ha observado una correlacin inversa
entre dicho nivel y la respuesta al tratamiento anti-vrico (7).

d) Distincin entre la infeccin por V I H 1 y la infeccin por VIH-2. Esta distincin

95

puede no ser posible mediante la determinacin de anticuerpos anti-VIH, debido a

la existencia de reacciones cruzadas. La
tcnica de PCR permite hacer el diagnstico diferencial, mediante el uso de pares
de iniciadores y de sondas especficos
para cada tipo de VIH (11).

a) Diagnstico de tuberculosis en los

casos con baciloscopia negativa. T o m a n do c o m o r e f e r e n c i a el d i a g n s t i c o por
cultivo, la tcnica de PCR tiene una sensibilidad del 83-87 %, pero una especificidad del 9 8 - 9 9 % (17, 18). As, la tcnica
del PCR puede ser muy til para hacer el
diagnstico de tuberculosis en casos con
baciloscopia negativa, ya que es un procedimiento mucho ms rpido que el cultivo; sin embargo, una PCR negativa no
excluye en estos casos la existencia de
infeccin.

e) Cuantificacin del RNA de VIH circulante. El nivel plasmtico de RNA de VIH

(carga vrica), determinado por RT-PCR,
puede ser til como marcador predictivo
de progresin clnica de la infeccin VIH
(12) y para monitorizar el efecto de diferentes tratamientos anti-retrovricos (13).

b) Diagnstico de tuberculosis activa en

pacientes con prueba de la tuberculina
positiva, o con historia clnica de tuberculosis previa tratada y/o de e n f e r m e d a d
inactiva. En estos casos, tambin t o m a n do c o m o referencia el d i a g n s t i c o por
cultivo, la sensibilidad es mxima (100%),
pero la especificidad es baja (70%) (19).
Por tanto, en estos pacientes no parece
estar indicada la realizacin de estudio por
PCR.

Infeccin por Citomegalovirus

En la neumonitis por CMV, un problema frecuente en pacientes nmunodeprimidos, la tcnica de PCR tiene las siguientes aplicaciones:
a) Diagnstico de la infeccin. Utilizando m u e s t r a s de lavado b r o n c o a l v e o l a r
(BAL), la tcnica de PCR como procedimiento aislado tiene, para el diagnstico
de infeccin por CMV, una especificidad
relativamente baja pero una sensibilidad
de 100% (14,15). Por tanto, la tcnica de
PCR es muy til para descartar el diagnstico de infeccin por CMV con un alto
grado de certeza y con mayor rapidez que
el cultivo viral. La combinacin de la tcnica de PCR con la tincin por inmunofluorescencia de macrfagos alveolares da
una especificidad tambin del 100% (15).

Infeccin por chlamydia trachomatis

La tcnica de PCR ofrece niveles de
sensibilidad y de especificidad similares a
los de la tcnica convencional de cultivo
celular para el diagnstico de infeccin por
C. t r a c h o m a t i s (20), t e n i e n d o s o b r e la
metodologa de cultivo las ventajas de una
mayor rapidez y de una menor complejidad tcnica.

b) M o n i t o r i z a c i n de la eficacia del
tratamiento anti-vrico. La persistencia de
DNA de CMV en sangre tras el tratamiento anti-vrico puede predecir la recidiva de
la enfermedad con un alto grado de certeza, aunque tambin se pueden observar
recidivas en pacientes en los que llega a
desaparecer el DNA de CMV (16).

Infeccin por papilomavirus h u m a n o

(PVH)
Puesto que el PVH no se ha podido
cultivar, las tcnicas de biologa molecular
son las nicas disponibles para la deteccin y el tipaje del virus. Mediante la tcnica de PCR se obtiene una prevalencia
de infeccin por PVH mayor que la que se
observa con otras tcnicas moleculares,
tales como la hibridacin "in situ" en biopsias ( 7 7 % vs 68%) y la hibridacin en
medio lquido en frotis y en muestras de

Tuberculosis
El papel de las tcnicas de PCR en el
diagnstico de tuberculosis pulmonar se
ha evaluado en dos situaciones distintas:
96

orina ( 5 0 % vs 22%) (21). Esto, unido a su

mayor rapidez y a su mayor sencillez, hace
de la PCR la tcnica de eleccin para el
diagnstico de infeccin por PVH. Adems,
mediante la tcnica de PCR puede hacer
se el tipado del virus, por lo que es una
metodologa vlida para el estudio epide
miolgico de los distintos tipos de PVH en
la poblacin (21).

La genotipificacin de los alelos del

sistema HLA de clase II tiene sobre el
tipaje HLA convencional las siguientes
ventajas prcticas:
a) Al tener una mayor resolucin, per
mite la consecucin de mayores grados
de homologa HLA clase II entre el donan
te y el receptor. Esto es muy importante
en los casos, como el trasplante de mdu
la sea, en que la identidad HLA de clase
II es esencial para el xito del trasplante.

Tipaje de los genes de las molculas

HLA de clase II

b) Mayor especificidad
c) Para el tipaje convencional hay que
utilizar clulas vivas que expresen mol
culas HLA de clase II, material que, a
veces, puede ser difcil de obtener. Esta
restriccin no existe en la genotipificacin,
ya que todas las clulas del organismo
tienen la misma dotacin gentica que se
puede extraer sin necesidad de que las
clulas estn vivas.

La genotipificacin de los alelos del

sistema HLA tiene ms resolucin que la
tipificacin de las protenas por mtodos
serolgicos celulares. Ello es debido a
que el polimorfismo de las protenas del
s i s t e m a HLA no da c u e n t a de todo el
polimorfismo que existe en el g e n o m a (22,
23). As, por ejemplo, para las 18 especi
ficidades serolgicas HLA-DR codificadas
por el gen de la cadena I D R B 1 , se han
identificado mediante tcnicas de biologa
molecular 60 alelos diferentes (22). Este
sistema utiliza unas letras que designan el
gen, seguidas de 4 nmeros, de los que
los dos primeros corresponden a la espe
cificidad definida por mtodos serolgicos
o celulares, mientras que los dos ltimos
corresponden al alelo definido por mto
dos moleculares; as, por ejemplo, DRBI
*0406 es la nomenclatura de uno de los
alelos de la especificidad serolgica 4 de
HLA-DR (DR4), mientras que DRB1 "0410
es la nomenclatura de otro de los alelos
c o m p r e n d i d o en la m i s m a especificidad
serolgica.

d) Los reactivos que se usan en la

genotipificacin son sintticos, y por tan
to, ms fciles de obtener y de estandari
zar que los antisueros y las clulas homozigotas para tipaje convencional conven
cional. Esto se traduce en una mayor
reproducibilidad de los resultados.

Aplicaciones diagnsticas
de la tcnica de reaccin en
cadena de la polimerasa que
estarn disponibles en el
laboratorio immunogen en
un futuro prximo

La tcnica molecular ms empleada en

el momento actual para la genotipificacin
de los alelos del sistema HLA de clase II
es la tcnica de PCR-SSO. Esta tcnica
tiene tres pasos: 1) amplificacin por PCR
de la zona polimrfica del DNA; 2) fijacin
en m e m b r a n a s de nylon del DNA amplifi
c a d o , y 3) hibridacin con nucletidos
especficos de secuencia (SSO, "Sequence Specific Oligonucleotides") de todos los
alelos a estudio (23).

El laboratorio I m m u n o g e n d i s p o n d r
prximamente de tcnicas de PCR aplica
bles al diagnstico y valoracin de otras
enfermedades infecciosas, al diagnstico
del cncer, y al diagnstico de diversas
enfermedades genticas.
Enfermedades infecciosas
Para el diagnstico y valoracin de
otras e n f e r m e d a d e s i n f e c c i o s a s , t a l e s
97

c o m o infeccin por virus herpes h u m a n o

c) su gran sensibilidad, lo que la c o n -

6, virus varicela-zster, agentes c a u s a n -

vierte en la t c n i c a de eleccin para la

tes de periodontitis, etc, la tcnica de la

deteccin de e n f e r m e d a d mnima residual

PCR tiene sobre los mtodos serolgicos

(27).

ventajas similares a las que se han ido

especificando en el apartado previo.
Diagnstico de e n f e r m e d a d e s
genticas
Diagnstico del cncer
En el diagnstico

La tcnica de PCR puede ser t a m b i n

del cncer,

muy

utilizada para identificar alteraciones ge-

e s p e c i a l m e n t e en el c a m p o de la O n c o -

nticas, tales como deleciones y m u t a c i o -

H e m a t o l o g a , la tcnica de PCR basa su

nes,

aplicabilidad en:

medades
de

a) su c a p a c i d a d para detectar marca-

que son c a u s a de diferentes

hereditarias

enfer-

(distrofia

muscular

fibrosis

qustica,

Duchenne/Becker,

tumores

deficiencia de alfa-1 antitripsina, hemofilias,

que escapan a la resolucin de tcnicas

etc.) (28). Las aplicaciones de la t c n i c a

citogenticas c o n v e n c i o n a l e s (24, 25).

de PCR en este c a m p o son el d i a g n s t i c o

dores

genticos

especficos

de

de pacientes, la deteccin de p o r t a d o r e s ,

b) la mayor facilidad y rapidez con que

el d i a g n s t i c o

puede detectar dichos marcadores genticos,

con

respecto

a otras

tcnicas

prenatal

y el

"screening"

neonatal.

de

biologa molecular tales como el "Southerm

blot" (26).

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