EFECTUL ENZIMELOR ASUPRA BIOMATERIALELOR

Scopul lucrarii este evidentierea degradarii catalizate de enzime a biomaterialelor pe

baza de colagen si stabilirea vitezei de degradare enzimatica.
Consideratii teoretice
Enzimele sunt catalizatori specifici reactiilor chimice care au loc in organismele vii.
~nalta specificitate a enzimelor este o caracteristica distincta a acestei categorii de catalizatori.
Enzimele prezinta att o specificitate de reactie ct si o specificitate de substrat.
In functie de tipul de reactie pe care il catalizeaza, enzimele pot fi:
hidrolaze - participa la scindarea hidrolitica a unor legaturi sau grupari;
oxido-reductaze - catalizeaza reactiile redox;
transferaze - catalizeaza reactii de transfer a unor grupe de la o molecula la alta;
liaze - catalizeaza reactii de eliminare sau de aditie a unor grupari din sau de la
moleculele substratului fara participarea apei, cu formarea unei legaturi duble sau la
nivelul legaturii duble in cazul reactiilor de aditie;
izomeraze - catalizeaza reactiile de izomerizare ( D - L, cis-trans, etc.);
liganzele sau sintetazele - catalizeaza reactiile de sinteza prin condensarea a doua
molecule.
Specificitatea de substrat poate fi:
absoluta - enzima "recunoaste" structura chimica a unei singure substante chimice, care
este de fapt unicul substrat al ei;
relativa - poate cataliza un numar de substante inrudite chimic "recunoscnd" numai o
grupare chimica comuna tuturor sau un tip comun de legatura chimica.
Specificitatea de substrat a enzimelor este unul dintre cele mai importante fenomene
biologice care stau la baza metabolismului si deci a vietii. Enzimele sunt catalizatori ai
reactiilor si respecta toate legile catalizei: -enzima nu se consuma in timpul reactiei si poate,
teoretic, provoca transformarea unui numar nelimitat de molecule de substrat, eventuala
denaturare a enzimei este independenta de actul catalitic;
-enzima nu se consuma in timpul reactiei si poate, teoretic, provoca transformarea unui
numar nelimitat de molecule de substrat, eventuala denaturare a enzimei este independenta de
actul catalitic;
- enzima nu modifica natura reactiei, echilibrul sau bilantul ei termodinamic, reactia fiind
posibila si in absenta ei;
- enzima accelereaza viteza de reactie, pentru acest parametru cinetic inregistrndu-se
valori de aproximativ 1011 ori mai mari dect cele obtinute in absenta biocatalizatorului.
Studiul cinetic al interactiunii dintre enzima si un suport este bazat pe masuratori ale
vitezei de reactie. Reactiile chimice decurg cu viteze deferite, unele fiind spontane altele
avnd loc cu viteze foarte mici astfel inct necesita prezenta unor activatori( temperatura sau
catalizatori).
Reactia dintre o enzima si un substrat poate fi scrisa, conform teoriei lui Michaelis,
sub forma:
k
k
E + S
ES 2 P

k1
unde: E - enzima
S - substrat
ES - comple enzima-substrat
P - produsi de reactie
1

k1 - viteza reactiei de formare a complexului

k -1 - viteza reactiei de desfacere a complexului
k2 - viteza reactiei de formare a produsilor
Complexul enzima-substrat este un produs intermediar de reactie. El nu poate exista
ca atare dect un timp foarte scurt. Din acest complex se vor forma produsi de reactie pe baza
unei reactii care se desfasoara practic complet, in acelasi timp regenerndu-se enzima.
Ecuatiile cinetice ale proceselor pot fi scrise:
dS
dE

k 1 E S k 1 ES (1)
dt
dt
dES
k 2 ES
dt
Lund in considerare ambele procese:
dES
k1 E S k 1 ES k 2 ES
dt
dES
k1 E S k 1 k 2 ES (2)
dt
dP
k 2 ES (3)
dt
Daca se are in vedere faptul ca concentratia totala a enzimei de la inceputul reactiei
enzimatice:
Et =E + ES (4)
E - enzima din amestecul final
ES - enzima din complexul enzima-substrat
Se obtine un sistem de 4 ecuatii cu 4 necunoscute care rezolvate in sistem
computerizat pot conduce la determinarea vitezei de formare a produsului P.
Viteza reactiei enzimatice este dependenta de o serie de factori:
- concentratia enzimei si a substratului;
- pH;
- temperatura;
- prezenta unor activatori sau inhibitori.
Pentru fiecare factor in parte care influenteaza viteza de reactie se pot stabili ecuatii
matematice, functii ale vitezei, al caror grad de complexitate se accentueaza in cazul
existentei a mai multor substraturi.

Principiul lucrarii consta in inregistrarea cantitii de proteina eliberata in timp prin

hidroliza enzimatica dintr-un biomaterial pe baza de material colagenic si evidentierea vitezei
reactiei enzimatice.
Materiale si aparatura
Materiale
- film de material colagenic
- reactiv biuret
- fosfat monosodic
- fosfat disodic
- colagenaza

Aparatura
1. Flacoane Erlenmeyer,
100ml
2. cristalizor
3. bagheta de sticla
4. pipeta cu bula 2ml
5. eprubete

- tripsina

6. baie de apa
7. etuva
8. spectrofotometru UV-Vis

Modul de lucru
Pentru studiul degradarii in prezenta de enzima se procedeaza astfel: din filmul de
material colagenic se taie 4 bucati cu mase aproximativ egale (0.2g). Se prepara o solutie de
colagenaza/tripsina de concentratie 10-2(%) in solutie tampon fosfat cu pH=7.4. Pentru cele 2
tipuri de enzyme luate in studio, in cate 2 flacoane Erlenmeyer cu capacitate de 50ml se
introduc:
- intr-un flacon 30ml solutie de enzima;
- intr-un flacon 30ml solutie tampon.
Se termostateaza solutiile la temperature de 37oC, in baie de apa.
Se imerseaza filmele in cele doua solutii.
Din cele 4 pahare se extrag, la intervale de timp de 10min, 20min, 40min, 60min,
80min, 100min, 120min cte 2ml de solutie ( se agita putin in pahar inainte de extragerea
probei), se adauga 5ml reactiv biuret si se determina absorbanta la 540nm. Cu ajutorul unei
curbe etalon se stabileste concentratia proteinei in solutie.
Datele experimentale se prelucreza astfel:
Concentratia proteinei hidrolizate enzimatic va fi:

c p ct ce c pl
unde: cp - concentratia proteinei hidrolizate enzimatic;
ct - concentratia de proteina inregistrata pentru proba introdusa in solutie de enzima;
ce - concentratia enzimei;
cpl - concentratia de proteina din proba in alb (fara enzima).
Se reprezinta grafic:
cp= f(t)
Bibliografie
1. Lanza R.P., Langer R., Vacanti J.P. Principles of Tissue Engineering. Academic Press; 3nd
ed., 2007
2. Bronzino J.D. The Biomedical Engineering Handbook, Boca Raton, Florida, CRC Press,
2000
3. Ratner B., Hoffman A.S., Schoen F.J., Lemons J.E., Biomaterials Science, Elsevier
Academic Press, London, 2004
4. Blitterswijk C., Tissue Engineering, Elsevier Academic Press, London, 2008