28/11/2014

TD Immuno S5 2014-2015

Pr : Nadia . Dakka

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Anticorps monoclonaux
Population homogne d anticorps issus d un
seul et unique clone de cellules B
Les anticorps monoclonaux sont des anticorps
ne reconnaissant qu'un seul type d'pitope sur
un antigne donn . Ils sont par dfinition tous
identiques et produits par un seul clone
de plasmocyte.
Avantage
Spcificit
Affinit
Production massive et constante

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Les Ac monoclonaux sont disponibles indfiniment une fois les

hybridomes immortaliss.
La production des Ac monoclonaux ncessite moins danimaux
par rapport la production des Ac polyclonaux,
Les Ac polyclonaux peuvent tre obtenus beaucoup plus
rapidement, moindre cot et avec moins de comptences
techniques que pour produire des Ac monoclonaux.
Les Ac polyclonaux sont obtenus en 4 8 semaines, tandis que la
production dAc monoclonaux peut prendre 3 6 mois.

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Principe de la production des anticorps

monoclonaux
Les partenaires de fusion
cellules B extraites d organes lymphodes secondaires (rate,
ganglions), des plasmocytes scrtant des Ac.
cellules mylomateuses de souris

Mthode de fusion
Chimique
Physique

Slection, clonage
in vitro dun hybridome producteur dAc.

Expansion
multiplication de clones de lhybridome, soit in vitro, soit in vivo,
afin dobtenir de grandes quantits dAc.

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L'immunisation
Les sources d'antignes
degr de puret : limination des
contaminants

L'immunisation de l'animal
dose et forme de l antigne
adjuvants
voie et nombre d injection

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Immunogne
Antigne
n
Protine protine lyophilise

Haptne

Quantit de limmunogne par injection et par animal.

2 - 50 g

en solution

2 - 50 g

Incluse dans un gel de polyacrylamide

1 - 10 g

Peptide

1 - 10 g

Nuclotide
glucide

Substance chimique naturelle ou synthtique

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Les animaux, souris ou rats, utiliss la fois pour

limmunisation en vue de la prparation du clone
dhybridome et pour la production dAc monoclonaux
(production in vivo), doivent tre de mme souche
(syngniques) pour des raisons dhistocompatibilit.

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Csar Milstein et Georges Khler (1970)

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IMMUNISATION DE LA SOURIS
AVEC LANTIGNE TUDI
OBTENTION DES LYMPHOCYTES
SPECIFIQUES

UTILISATION DE
CELLULES MYELOMATEUSES

OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES

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Les cellules de mylome utilises dans les hybridomes nont pas

lenzyme

HGPRT

(hypoxanthine-guanine

transfrase) . Elles ont

phosphoribosyl

perdu la capacit de produire des

immunoglobulines (mutants Ig-).

Les cellules de mylome napportent que leur proprit
dimmortalit aux cellules rsultant de la fusion.

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Lautre

partenaire

de

la

fusion

est

une

population

de

plasmocytes possdant lenzyme: HGPRT et scrtant les Ig.

Ces plasmocytes contribuent la capacit des hybridomes
survivre dans le milieu de culture slectif HAT (Hypoxanthine,
Aminoptrine et Thymidine).

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On fusionne les plasmocytes scrtant des anticorps

dirigs spcifiquement contre l'antigne choisi, avec
des cellules de tumeur :
mylomes (cellules
immortelles) .
La fusion membranaire se fait grce l'addition
de polythylne glycol (PEG) et permet ainsi
d'obtenir des hybridomes.
Les hybridomes ont la capacit de se multiplier plus
rapidement que les plasmocytes productrices
d'anticorps et de dvelopper indfiniment des
anticorps spcifiques.

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Mthodes de fusion
Fusion chimique: Poly Ethylne Glycol (PEG)
fusion des membranes cytoplasmiques
rendement de fusion lev
DMSO renforce la viabilit cellulaire

Fusion physique : Electrofusion

Ouverture de pores dans la cellule par des pulses lectriques
technique onreuse
moins destructrice

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Par mthode chimique

FUSION DES MEMBRANES
CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly thylne glycol)
SELECTION

Par mthode physique

FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES
PAR ELECTROPORATION

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Slection, clonage
Slection sur milieu slectif HAT

Hypoxanthine Aminopterine Thymidine

facteurs de croissance : IL6 mercaptoethanol
srum de veau ftal
fibroblastes
sous atmosphre CO2
seuls les hybridomes se dveloppent
1 x 105 cellules/ml

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Aprs fusion des hybridomes, les cellules sont rparties dans

des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule
par puits. le mlange de toutes ces cellules (hybrides et cellules
parentales) est plac sur un milieu de culture slectif : HAT
(Hypoxanthine, Aminoptrine et Thymidine) .
Les plasmocytes non fusionns meurent rapidement et les
cellules mylomateuses utilises ayant un gne non fonctionnel
pour une enzyme intervenant dans la synthse des nuclotides
(HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT .

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La slection par le milieu HAT dpend du fait que

les cellules de mammifres peuvent synthtiser les
nuclotides par deux voies diffrentes :
La voie de novo et la voie de rcupration en
incorporant directement les purines et les
pyrimidines dans les nuclotides ncessaires la
synthse de lADN et de l ARN.
Les enzymes qui catalysent la voie de rcupration
incluent HGPRT et TK. Une mutation de lun ou
lautre de ces deux enzymes bloque la capacit de la
cellule utiliser la voie de rcupration et entrane
sa mort dans le milieu HAT .

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+
Culture sur milieu HAT
Hypoxanthine Aminoptrine Thymidine

Cellule mylomateuse HGPRT-

MORT CELLULAIRE
Impossibilit de se
diviser

HYBRIDOME
SELECTIONNE

Lymphocyte B

MORT CELLULAIRE
disparition aprs
quelques divisions

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+
Ds que la croissance est suffisante, il faut
propager les cultures d'hybridomes productrices de
l'anticorps dsir, les conserver et les cloner. Deux
mthodes sont utilises pour obtenir un clone
partir d'une cellule :

Sur milieu glos

Par dilution limite

Une colonie = une cellule initiale Une ou zro cellules par puit

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Slection d une seule cellule et mise en culture.

Clonage dans lAgar, dans lAgarose
on visualise directement les colonies cellulaires dans
l agar, que l on remet en culture aprs dilution.
Clonage par dilution limite
la plus utilise dans les laboratoires.
Ralise directement dans une plaque de microtitration
peu onreuse
Longue.

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Immuno prcipitation

Ouchterlony, Mancini
Radio immunologie (RIA)

radio isotope
Immuno enzymologie (EIA)

enzyme (ELISA)
Compteur de cellules (Cell sorter)
Western Blot

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TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT

DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX
PAR LA METHODE ELISA
DU TYPE DANTICORPS PRODUIT
PAR DES METHODES DIMMUNOPRECIPITATION

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2 techniques ELISA
Comptition
Sandwich : la plus utilise pour ce propos

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ELISA sandwich

Ac de capture

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Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans

chaque puits la prsence d'anticorps dirigs contre
l'antigne utilis pour immuniser la souris.
On peut alors multiplier les clones positifs
(producteurs de lAc dintrt) soit en continuant de
les cultiver in vitro, soit en utilisant lanimal immunis
pour une production in vivo.

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Avantages
Concentration leve en
Ac Mo
Pas dintermdiaire
industriels

Inconvnients
Utilisation de lanimal
Prsence de protines
murines
Contaminants
Stress de la souris

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Amplification des hybridomes

Production par
cultures cellulaires

OBTENTION DES
ANTICORPS MONOCLONAUX
Production dans
les liquides d'ascites
CONSERVATION
DES HYBRIDOMES

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Injection des hybridomes dans le pritoine de souris

Dveloppement d une tumeur : ascite
Prlvement des anticorps par ponction de liquide d ascite
Rendement lev 20 g/l
Cest la souris qui rgule les conditions de culture !
Purification du liquide d ascite ncessaire

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Prparation de lchantillon
Purification principale
Chromatographie
daffinit
Affinit
immunologiques
spcifique du Fc.
spcifique de
lantigne.

Ligand

Impurets

Analyte

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Fixation

Elution

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Elution par dplacement

avec lantigne libre

Elution par dplacement

avec un analogue

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Avantages
Pas dutilisation d animal
Production de grandes
quantit danticorps
Pas de personnel
danimalerie
Pas de contaminant

Inconvnients
Ncessite lutilisation de
srum de veau ftal
Contamination par les
hybridomes morts
Ac de plus faible affinit
Plus chre pour de petites
production

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Bas sur la technologie des fibres creuses.

Diminution des cots, du temps.
Augmentation de la production 3 5 g/l, de la puret
Pas ou peu de contaminant (6 x moins)

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Spcificit
Reconnaissance d un seul motif pitopique
Ractions croises, non-spcifiques.
Maintient de l activit aprs modification chimique
L'affinit
leve
Constante et contrle
Avantages de ce type de production
Constante
reproductible

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Tout anticorps est caractris par deux proprits :

- capacit de lier spcifiquement un ou plusieurs ligands
- participation une ou plusieurs fonctions effectrices
(activation du complment, stimulation de la phagocytose )

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Premires applications thrapeutiques des Ac Mo en 1981 avec le

muromonab utilis dans le traitement des pisodes de rejet aigu en
transplantation d'organes.
Inconvnients des premiers anticorps monoclonaux produits par des
hybridomes murins:
- une demi-vie courte
-immunognes.
Les progrs de la biologie molculaire, au cours des annes 1980, ont
permis la production d'abord d'anticorps chimriques, puis d'anticorps
humaniss et enfin danticorps totalement humains.
Depuis, le dveloppement et l'utilisation clinique de ces anticorps
monoclonaux ont connu un essor spectaculaire.

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100% souris

Ac monoclonal
de souris

Ac monoclonal
chimrique

75% homme
25% souris

90 % homme
10% souris
Ac monoclonal
humanis

Ac monoclonal
humain

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La chimrisation et l'humanisation permettent de varier les

isotypes

des

potentielles

anticorps
de

donc

l'anticorps

de manipuler

(par

exemple,

les
la

fonctions

fixation

du

complment).
Un autre avantage: augmentation de la demi-vie de l'anticorps,
qui passe de moins de 20 heures avec les anticorps murins
plusieurs jours, s'approchant des 21 jours des IgG humaines
endognes.
Ceci permet une meilleure utilisation de ces Ac comme agents
thrapeutiques.

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ANTICORPS ENTIEREMENT HUMAINS:

Des anticorps entirement humains et biocompatibles sont
cependant de plus en plus recherchs pour l'immunothrapie
passive.
Trois grands types de technologies ont t mis au point pour les
obtenir:
- Techniques d'hybridomes,
- Phage display,
- Souris transgnique.

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Les anticorps monoclonaux utiliss comme mdicaments ont tous

une nomenclature se terminant par mab , acronyme de
monoclonal antibody comme par exemple le rituximab.
Ils sont utiliss dans les tests de grossesse, dans de nombreux
domaines de la recherche en biologie et par de nombreuses
techniques (cytomtrie en flux, western blots.), dans les tests
d'immuno-hmatologie.
Les anticorps monoclonaux, en monothrapie ou en association
avec une chimiothrapie, ont pris place aujourdhui dans le
traitement standard de nombreuses formes de cancers.

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Herceptin (Anticorps humanis)

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Biotechnologie
Recherche

Diagnostic

Thrapeutique

Cytomtrie en flux, Immunohistochimie

Etude des lignes cellulaires
Etude des marqueurs des cellules non lymphocytaire
Etudes des cellules pathologiques
Purification dantignes
Recherche dAc ou dAg
Immunodtection (ELISA, RIA)
Imagerie (immunoscintigraphie)
20 Ac monoclonaux utilises en thrapeutique
+ 70 Ac monoclonaux en essais cliniques
traitement immunosuppresseur
(Maladies auto-immunes et inflammatoires, rejet de greffe)

traitement anticancreux (limination des cellules cancreuses)

cardiologie (traitement anti-thrombotique)
infectiologie (prophylaxie antivirale)
allergologie (traitement asthme)

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Beaucoup despoirs soulevs dans le traitement de

nombreuses pathologies lourdes, pour lesquelles les
thrapeutiques conventionnelles ont montr leurs limites.
(thrapeutiques cibles)
Toutefois le cot de ces produits est un facteur limitant
leur utilisation, dautant plus que de nombreuses
applications restent des traitements de longue dure.
Enfin et en l'absence d'tudes de tolrance long
terme, le suivi et la prudence sont indispensables pour
mieux valuer les risques lis leur utilisation.

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